تصوير الأوعية الدموية العميقة في العين باستخدام الموجات فوق الصوتية المحسنة للتدفق

نحن نقدم تقنية الموجات فوق الصوتية غير الغازية لتوليد تصوير الأوعية ثلاثية الأبعاد في العين دون استخدام عوامل التباين.

الشبكية داخل العين هي واحدة من أكثر الأنسجة التي تتطلب الطاقة في الجسم ، وبالتالي تتطلب معدلات عالية من توصيل الأكسجين من إمدادات الدم الغنية. الصفيحة الشعرية للمشيمية تبطن السطح الخارجي للشبكية وهي المصدر المهيمن للأكسجين في معظم شبكية العين الفقارية. ومع ذلك ، فإن هذا السرير الوعائي يمثل تحديا للتصوير باستخدام التقنيات البصرية التقليدية بسبب موقعه خلف شبكية العين عالية امتصاص الضوء. هنا نصف تقنية الموجات فوق الصوتية عالية التردد مع تعزيز التدفق اللاحق لتصوير أسرة الأوعية الدموية العميقة (0.5-3 سم) للعين بدقة مكانية وزمانية عالية. تعمل هذه الطريقة غير الغازية بشكل جيد في الأنواع التي تحتوي على خلايا دم حمراء نواة (نماذج حيوانية غير ثديية وجنينية). يسمح بتوليد صور الأوعية ثلاثية الأبعاد غير الغازية دون استخدام عوامل التباين ، وهو مستقل عن زوايا تدفق الدم مع حساسية أعلى من تقنيات التصوير بالموجات فوق الصوتية القائمة على دوبلر.

يفرض التمثيل الغذائي العالي على شبكية العين الفقارية مقايضة جوهرية بين حاجتين متناقضتين. ارتفاع معدلات تدفق الدم ومسار خفيف خال من الأوعية الدموية. لتجنب الاضطراب البصري لخلايا الدم الحمراء المتغلغلة ، تتلقى شبكية العين لجميع الفقاريات الأكسجين والمواد المغذية عبر ورقة من الشعيرات الدموية خلف المستقبلات الضوئية ، المشيمية ^{الشعرية1،2،3}. ومع ذلك ، فإن هذا المصدر الوحيد للمغذيات والأكسجين يفرض قيودا على الانتشار على سمك شبكية ^{العين4,5} ، لذلك تمتلك العديد من الأنواع النشطة بصريا مجموعة متنوعة من شبكات الأوعية الدموية المعقدة لتوفير إمدادات دم إضافية لهذا العضو النشط استقلابيا ⁶. وتشمل هذه الأسرة الوعائية الأوعية الدموية التي تغلغل في طبقات الشبكية الداخلية في الثدييات وبعض الأسماك4،⁷،⁸،⁹،¹⁰ ، والأوعية الدموية على الجانب الداخلي (المواجه للضوء) من شبكية العين الموجودة في العديد من الأسماك والزواحف والطيور4،^11،12،¹³ ، والترتيبات الوعائية المعاكسة للأسماك المشيمية ^، و rete choroid mirabile ، الذي يسمح بتوليد ضغوط جزئية من الأكسجين في الغلاف الجوي الفائق14،¹⁵،¹⁶،^17،18،^19،20. على الرغم من أن هذه المسارات الإضافية غير المشيمية لإمدادات المغذيات الشبكية تلعب دورا أساسيا في تغذية المتطلبات الأيضية للرؤية الفائقة4، فإن التشريح ثلاثي الأبعاد لهذه الهياكل الوعائية غير مفهوم بشكل جيد، مما يحد من فهمنا للتطور المورفولوجي للعين الفقارية.

تقليديا ، تمت دراسة إمدادات الدم في شبكية العين باستخدام التقنيات البصرية ، مثل تنظير قاع العين. توفر هذه الفئة من التقنيات معلومات غير مدمرة عالية الإنتاجية عن تشريح الأوعية الدموية غير المشيمية بدقة عالية21 وبالتالي فهي تستخدم بسهولة في التشخيص السريري للتشوهات في بنية الأوعية الدموية ^{الشبكية22}. ومع ذلك، تمتص ظهارة صبغة الشبكية الضوء المنقول وتحد من عمق الرؤية في هذه التقنيات البصرية، مما يوفر معلومات مخفضة عن البنية المشيمية ووظيفتها دون استخدام عامل ^{التباين21}. هناك قيود مماثلة على العمق في التصوير المقطعي بالتماسك البصري (OCT). يمكن لهذه التقنية توليد صور وعائية قاع العين عالية الدقة باستخدام موجات الضوء على الحساب التقني لاختراق العمق23، في حين يمكن للتصوير العميق المحسن OCT تصور المشيمية على حساب جودة تصوير ^{الشبكية24}. يتغلب التصوير بالرنين المغناطيسي على القيود البصرية لتنظير العين و OCT ويمكنه رسم خريطة لطبقات الأوعية الدموية في شبكية العين، وإن كان ذلك بدقة ^{منخفضة25}. يحافظ علم الأنسجة والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) على الدقة العالية للتقنيات البصرية ويوفران معلومات عن مورفولوجيا الأوعية الدموية للعين ^{بأكملها4}، ولكن كلتا التقنيتين تتطلبان أخذ عينات من العين، وبالتالي لا يمكن استخدامهما في العيادة أو الأنواع النادرة أو المهددة بالانقراض. للتغلب على بعض القيود المفروضة على تقنيات تصوير الشبكية المعمول بها ، تقدم الدراسة هنا بروتوكول الموجات فوق الصوتية على الحيوانات المخدرة ، حيث يتم رسم خريطة لحركة الدم في سيليكو على سلسلة من عمليات المسح بالموجات فوق الصوتية ثنائية الأبعاد متساوية التباعد التي تغطي العين بأكملها من خلال تطبيق تقنية مماثلة كما هو موضح سابقا للتصوير الجنيني والقلب والأوعية ^{الدموية26}،^{27 ، 28} وفي تصوير الأوعية ^OCT29. يسمح هذا النهج بتوليد صور الأوعية الدموية العميقة ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد غير الغازية دون استخدام عامل تباين ويفتح آفاقا جديدة لرسم خرائط توزيع تدفق الدم داخل العين عبر الأنواع.

تم تنفيذ البروتوكول أدناه بإذن من هيئة التفتيش الدنماركية للتجارب على الحيوانات داخل وزارة الأغذية والزراعة ومصايد الأسماك الدنماركية ، الإدارة البيطرية والغذائية الدنماركية (رقم التصريح 2016-15-0201-00835).

1. التخدير والموجات فوق الصوتية المتوسطة

1. تخدير البحث.
   ملاحظة: يعتمد نوع وجرعة التخدير المناسب بشكل كبير على الأنواع. بشكل عام ، التخدير القائم على الغمر مثل MS-222 (حمض ميثان سلفونيك الإيثيل 3-أمينوبنزوات) ، والبنزوكاين (إيثيل 4-أمينوبنزوات) ، والبروبوفول (2,6-ثنائي إيزوبروبيل فينول) مفيد في الأسماك والبرمائيات التي تمتص بسهولة المخدر فوق الخياشيم أو الجلد (على سبيل المثال ، 0.05 ملغ · ^L-1 البنزوكاين في سمك السلمون المرقط قوس قزح). تتوفر مجموعة من المركبات الذائبة التي يمكن إعطاؤها عن طريق الوريد والعضل وداخل الصفاق للسالم ، وكذلك التخدير القائم على الغاز. الفاكسالون الذي يتم إعطاؤه عن طريق العضل مفيد في الزواحف (على سبيل المثال ، 30 ملغم · ^كغ-1 في السحالي) ، والإيسوفلوران الذي يدار كغاز مفيد في الطيور (على سبيل المثال ، 2 ٪ في الهواء للحمام). ارجع إلى الأدبيات المنشورة30،^31،32 للحصول على نظرة عامة كاملة على التخدير المتاح عبر الأنواع.
2. اختبار ردود الفعل في الحيوان لتأكيد المستوى الأمثل من التخدير. تأكد من أن الحيوان بلا حراك تماما أثناء الإجراء لأن إجراء الموجات فوق الصوتية المعزز بالتدفق حساس لضوضاء الحركة.
   1. يمكن للتخدير العميق جدا أن يغير أنماط تدفق الدم، لذا قم بإجراء معايرة الجرعة في مرحلة بدء التجربة.
   2. زيادة جرعة التخدير في خطوات ومراقبة تدفق الدم في العين بمساعدة الموجات فوق الصوتية البسيطة وضع السطوع (B-mode).
      ملاحظة: يتم الحصول على المستوى الأمثل من التخدير عندما يكون الحيوان بلا حراك (باستثناء التنفس) مع تدفق الدم المرئي في العين.
3. إذا كان نوع / جرعة المخدر غير مسموح به لحركات الجهاز التنفسي ، فتأكد من التهوية الكافية للحيوان ، على سبيل المثال ، باستخدام مضخة هواء لأكسجة الماء للأنواع المائية أو جهاز تنفس صناعي للأنواع التي تتنفس الهواء.
4. ضع الحيوان في وضع يسمح بالوصول المباشر من الأعلى إلى العين.
   ملاحظة: اعتمادا على الأنواع ، يمكن أن يكون هذا إما في وضع ضعيف أو جانبي. قد يكون من المفيد بناء جهاز حمل بسيط باستخدام قطعة صغيرة من المعدن غير التفاعلي (مثل الفولاذ المقاوم للصدأ) وأربطة مطاطية فضفاضة (انظر الشكل 1).
5. ضع وسط الموجات فوق الصوتية المناسب على عين الحيوان. إذا كانت الجفون المتدرجة (الموجات فوق الصوتية غير منفذة) تغطي العين ، فقم بإزاحتها بلطف باستخدام قطعة قطن.
   ملاحظة: بالنسبة للأنواع المائية ، فإن أفضل وسط للموجات فوق الصوتية هو مياه الخزان النظيفة التي يعيش فيها الحيوان عادة. بالنسبة للأنواع الأرضية ، تضمن كمية سخية من هلام الموجات فوق الصوتية حركات وتصويرا حرا لمحول الموجات فوق الصوتية (أي مسبار الصفيف الخطي) عبر سطح العين بأكمله. مطلوب مرهم بيطري على العين المقابلة للأنواع الأرضية.

2. 2D و 3D العين الموجات فوق الصوتية الحصول على صورة

1. ضع محول الموجات فوق الصوتية الإنسي للعين إما في اتجاه ظهري / بطني أو روسترال / ذيلي اعتمادا على اتجاه الصورة المطلوب.
2. في الوضع B ، مع أقصى عمق للمجال ، قم بتصوير الجزء الإنسي والأعمق من العين وتأكد من أن جميع الهياكل ذات الأهمية مرئية في مجال الصورة.
   ملاحظة: في بعض الأنواع ، تشغل العدسة البلورية نسبة كبيرة نسبيا من الفكاهة الزجاجية ، والتي قد تمتص الموجات فوق الصوتية ، خاصة عند الترددات الأعلى.
3. ترجم محول الطاقة ببطء إلى كل جانب أثناء فحص الصور في الوقت الفعلي. تأكد من أن جميع الهياكل ذات الأهمية مرئية في حقل الصورة ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بالتبديل إلى محول طاقة بتردد أقل وعمق أكبر للمجال.
   ملاحظة: تسمح الترددات المركزية التالية بأقصى عمق مجال على النحو التالي: 21 ميجاهرتز: 3 سم، 40 ميجاهرتز: 1.5 سم، 50 ميجاهرتز: 1 سم (انظر الجدول 1). ومع ذلك ، يمكن أن يكون عمق قيم المجال الأقصى هذه أقل بشكل ملحوظ إذا كانت العين تحتوي على هياكل متكلسة أو غيرها من الهياكل غير المنفذة بالموجات فوق الصوتية.
4. اضبط عمق الصورة، وإزاحة العمق (المسافة من أعلى الصورة إلى بنية الاهتمام)، وعرض الصورة، بالإضافة إلى عدد المناطق البؤرية وموقعها لتغطية المنطقة المطلوبة ذات الأهمية في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة (على سبيل المثال، عمق 1 سم، إزاحة عمق 2 مم، عرض صورة 1 سم، منطقة بؤرية واحدة).
   ملاحظة: على الرغم من أن التسمية المحددة للأزرار التي تضبط هذه المعلمات قد تختلف بين أنظمة الموجات فوق الصوتية، إلا أن معظم الأنظمة سيكون لها أزرار بأسماء منطقية لهذه التعديلات. عادة ما تؤثر إعدادات معلمات الصورة هذه على نطاق الدقة الزمنية المحتملة لاكتساب الموجات فوق الصوتية.
5. اضبط معدل الإطارات في حدود 50-120 إطارا·^s-1.
   ملاحظة: يجب أن تكون الدقة الزمنية (أي الفاصل الزمني بين عمليات المسح B-scans المتتالية) كافية لعرض تباين كثافة البكسل الكبير في الأوعية الدموية المصورة، أي يجب ألا تكون الدقة الزمنية عالية جدا. من ناحية أخرى ، لإكمال تسجيل 3D كامل للعين في وقت معقول ، لا يمكن أن تكون الدقة الزمنية منخفضة للغاية. عادة ما تكون الدقة الزمنية التي تتراوح بين 50-120 إطارا·^s-1 كافية لإجراء تعزيز التدفق في معظم الأنواع. في بعض أنظمة الموجات فوق الصوتية ، يمكن الحصول على هذه الدقة الزمنية المطلوبة عن طريق التبديل بين أوضاع "التصوير العام" (الدقة المكانية العالية / الزمنية المنخفضة) و "أمراض القلب" (الدقة المكانية المنخفضة / الزمنية العالية).
6. اضبط كسب 2D إلى مستوى (~ 5 ديسيبل) ، بحيث تكون الهياكل التشريحية مرئية فقط في اكتساب الوضع B لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في إعادة الإعمار اللاحقة المحسنة للتدفق.
7. للحصول على صورة ثنائية الأبعاد محسنة بالتدفق في موضع شريحة واحدة، قم بترجمة الترجام إلى هذا الموضع وتابع في الخطوة 3.1.
8. للحصول على تسجيل 3D لمنطقة بأكملها من الاهتمام ، على سبيل المثال ، شبكية العين ، ترجمة محول الطاقة إلى طرف واحد من المنطقة محل الاهتمام.
   1. لتحديد الموقع الدقيق للنهاية القصوى للمنطقة ذات الاهتمام ، قم بزيادة مكاسب 2D لفترة وجيزة.
   2. بعد اكتمال وضع محول الطاقة الصحيح ، قم بخفض كسب 2D قبل التسجيل لضمان أقصى نسبة إشارة إلى ضوضاء في إعادة البناء اللاحقة المعززة بالتدفق.
9. لكل خطوة (شريحة) في التسجيل ثلاثي الأبعاد ، احصل على ≥100 إطار (على النحو الأمثل ≥1000 إطار).
10. باستخدام مناور دقيق أو محرك محول طاقة مدمج ، قم بترجمة المحول عبر المنطقة بأكملها ذات الأهمية في خطوات ، على سبيل المثال ، 25 ميكرومتر أو 50 ميكرومتر (تذكر ملاحظة حجم الخطوة) وكرر اقتناء ≥100 إطار لكل خطوة.
11. القتل الرحيم لحيوان البحث وفقا لإرشادات رعاية الحيوان الخاصة بالمؤسسة.

3. إعادة بناء الصورة المحسنة للتدفق

1. تصدير التسجيلات إلى التصوير الرقمي والاتصالات في شكل ملف الطب (DICOM) (القليل من النهاية).
2. لإنتاج صورة واحدة محسنة التدفق استنادا إلى تسجيل سينمائي ≥100 إطار (T)، احسب الانحراف المعياري على مستوى البكسل (STD(x,y)) باستخدام الصيغة:
   
   حيث It(x,y) هي شدة البكسل عند إحداثيات البكسل (x,y) في الوقت t، و _Īt(x,y) هي القيمة الحسابية المتوسطة ل I بمرور الوقت.
3. كرر الخطوة 3.2 لكل شريحة في التسجيل ثلاثي الأبعاد.
4. لأتمتة عملية حساب STD وإعادة بناء الصورة لشرائح متعددة في تسجيل ثلاثي الأبعاد ، قم بإجراء هذه العملية في وضع الدفعات باستخدام ، على سبيل المثال ، ImageJ والبرنامج النصي الماكرو التكميلي (الملف التكميلي 1).
5. دمج جميع الشرائح المعاد إنشاؤها في مكدس صورة واحد (الأمر تحويل الصور إلى مكدس في ImageJ).
6. حدد سمك الشريحة من حجم الخطوة المستخدم أثناء الاكتساب (الأمر خصائص في ImageJ).
7. احفظ مكدس الصور كملف TIF 3D.
   ملاحظة: يمكن لاحقا استخدام التسجيلات ثلاثية الأبعاد المرجحة بالتدفق للأوعية الدموية العينية لإنشاء تجسيدات حجمية وبناء نماذج تشريحية رقمية وفيزيائية للهياكل الوعائية للعين. خيارات معالجة الصور هذه خارج نطاق هذا البروتوكول. راجع المقالات المنشورة سابقا لمزيد من ^{التفاصيل33,34,35}.

يمكن تطبيق تقنية الموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق لتصوير الأسرة الوعائية للعين في مجموعة من الأنواع وقد استخدمت حاليا في 46 نوعا مختلفا من الفقاريات (الشكل 1 ، الجدول 1). يوفر وجود خلايا الدم الحمراء النواة في الفقاريات الثدييات غير البالغة تباينا إيجابيا للدم المتدفق مقارنة بالأنسجة الثابتة في التسجيلات السينمائية (الملف التكميلي 2). ومع ذلك ، عند تحليلها على أساس كل إطار على حدة ، يكون التمييز الواضح بين الدم والأنسجة المحيطة أقل وضوحا (الشكل 2A). يقوم إجراء تعزيز تدفق الدم الموصوف في هذا البروتوكول بشكل أساسي بتجميع تسجيل نقطة متعددة الأوقات في مساحة ثنائية الأبعاد (شريحة مصنوعة من إطارات T) في صورة واحدة حيث تسجل تقلبات قيمة الإشارة المتأصلة في وحدات البكسل الموضوعة في الدم المتدفق انحرافا معياريا أعلى من الأنسجة الثابتة المحيطة ، وبالتالي إنتاج تباين إيجابي (الشكل 2B). لتعزيز تباين الأوعية الدموية بشكل ملحوظ ، يمكن استخدام جداول البحث لإنتاج صور زائفة الألوان (الشكل 2C). في عمليات الاستحواذ ثلاثية الأبعاد ، يمكن دمج شرائح متوازية متعددة مع تباعد معروف في بيانات صورة ثلاثية الأبعاد (الملف التكميلي 3 والملف التكميلي 4) التي يمكن استخدامها لعرض الحجم ثلاثي الأبعاد (الشكل 2D) والنمذجة التشريحية (الشكل 2E والملف التكميلي 5). يوفر التصوير بالموجات فوق الصوتية القائم على دوبلر أيضا خيار تصوير تدفق الدم على وجه التحديد ، ولكن بحساسية أقل من الطريقة الموصوفة (قارن الشكل 2G مع الشكل 2H والشكل 2I) ، والأهم من ذلك ليس إذا كان اتجاه تدفق الدم عموديا مباشرة أو قريبا من اتجاه الموجة الصوتية. الإجراء المعزز بالتدفق الموصوف في هذا البروتوكول مستقل عن اتجاه تدفق الدم داخل الطائرة وخارجها.

يسمح إجراء الموجات فوق الصوتية المعزز بالتدفق بتصوير تدفق الدم في مجموعة من الأنواع التي تحتوي على خلايا دم حمراء نواة (الشكل 3A-D). يمكن تصوير أسرة الأوعية الدموية العميقة للعين مثل الميرابيل المشيمي في بعض الأسماك إذا كانت موجودة في الأنواع (رأس السهم الأصفر في الشكل 2 ، الشكل 3 ب ، الشكل 4). هذه الطريقة محدودة بسبب عدم وجود خلايا دم حمراء نواة في الثدييات البالغة حيث ينتج عن إجراء تعزيز التدفق درجة معينة من تباين تدفق الدم ولكنه ليس متميزا كما هو الحال في الأنواع التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء النواة (الشكل 3E ، F).

الموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق حساسة لضوضاء الحركة ، وعلى سبيل المثال ، يمكن أن تسبب حركات الجهاز التنفسي عدم وضوح الصورة والتحف مثل تحسين حدود الأنسجة (الشكل 4A-C ، الملف التكميلي 6). يمكن استخدام بوابات مستقبلية أو بأثر رجعي لضبط ضوضاء الحركة (الشكل 4D ، E).

الشكل 1: أمثلة على مجموعة متنوعة من الأنواع المناسبة للتصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق للأوعية الدموية العينية. (أ) ذهبية (Carassius auratus). (ب) سمك الحفش السيبيري (Acipenser baerii). (ج) القاروص الأوروبي (Dicentrarchus labrax). (د) المهرج ريشة الظهر (شيتالا أورناتا). (ه) الكارب الصليبي (كاراسيوس كاراسيوس). (و) الدجاج المحلي الجنيني (Gallus gallus domesticus). قد يكون من المفيد بناء جهاز حمل بسيط باستخدام وزن معدني غير تفاعلي وأربطة مطاطية فضفاضة (A ، C ، D). يمكن استخدام كل من أنظمة التصوير بالموجات فوق الصوتية الكبيرة وغير المتحركة القائمة على المختبر للإجراء (A-D ، F) وكذلك أنظمة التشغيل الميداني الصغيرة (E). عند تصوير الأنواع الصغيرة والحساسة للغاية لدرجة الحرارة التي لا يمكن الاحتفاظ بها في حمام مائي يتم التحكم في درجة حرارته مثل الطيور الجنينية ، يمكن إجراء التصوير أثناء وجود العينة داخل الحاضنة (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تأثير تعزيز التدفق على فحوصات الموجات فوق الصوتية للعين. (أ) أمثلة على صور الموجات فوق الصوتية الخام في الوضع B لعين سمكة ذهبية في تسجيل سينمائي 1000 إطار. في حين يمكن ملاحظة تدفق الدم في التسجيل السينمائي (الملف التكميلي 2) ، من الصعب رؤيته في إطارات ثابتة. (B) صورة ذات تدرج رمادي محسن للتدفق (نفس الشريحة كما في A). يتم تعزيز كل من أسرة الأوعية الدموية الشبكية وما بعد الشبكية. (C) نسخة شبه ملونة من الصورة في B مع ImageJ Fire Search Up Table. (د) عرض حجم تدفق الدم في عين نفس السمكة الذهبية كما هو الحال في A-C ، بناء على اكتساب 3D. (ه) نموذج تشريحي للعين في الشبكية من الشبكية إلى ما بعد الشبكية (أوعية ما بعد الشبكية) (للاطلاع على النموذج التفاعلي، انظر المادة التكميلية 5). (F-I) صورة بالموجات فوق الصوتية الخام في الوضع B لعين سمكة ذهبية أخرى (F) تقارن تصوير التدفق القائم على دوبلر الملون (G) بالطرق المحسنة للتدفق الموضحة في هذا البروتوكول (H-I ، الملاحظة I هي تراكب H على F). تشير الأسهم الخضراء إلى أوعية الشبكية ، وتشير رؤوس الأسهم الصفراء إلى المشيمية rete mirabile. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: أمثلة تمثيلية لصور الموجات فوق الصوتية العينية المعززة بالتدفق في مجموعة متنوعة من أنواع الفقاريات. (أ) السنغال بشير (Polypterus senegalus). (ب) سمكة البيرانا حمراء البطن (Pygocentrus nattereri). (ج) الإغوانا الخضراء (الإغوانا الإغوانا). (د) الدجاج الجنيني (اليوم 18) الدجاج المنزلي (Gallus gallus domesticus). (ه) فأر البيت (Mus musculus). (و) الفئران البنية (الجرذ النرويجي). في الأنواع التي تحتوي على خلايا دم حمراء نواة ، ينتج عن إجراء تعزيز التدفق صور مفيدة لتدفق الدم العيني (A-D) ، بينما في الثدييات البالغة (خلايا الدم الحمراء المنوية) ، فإنه ينتج تباينا محدودا فقط بين الدم المتدفق والأنسجة المحيطة (E-F). تشير الأسهم الخضراء إلى أوعية شبكية العين. تشير رؤوس الأسهم الزرقاء إلى أوعية ما بعد الشبكية مثل الشعيرات الدموية. تشير رؤوس الأسهم الصفراء إلى المشيمية rete mirabile. في الدجاج المنزلي الجنيني المتأخر ، يمكن ملاحظة تدفق الدم في البكتين أوكولي (السهم الأخضر السفلي في F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحفز الحركات التنفسية ضوضاء الحركة التي يمكن تخفيفها عن طريق بوابات بأثر رجعي. (أ-ب) مثال على الحركات التنفسية في عين البلايس الأوروبي (Pleuronectes platessa). توجد النقطة الحمراء في نفس إحداثيات الصورة في A (الشريحة 54/410) و B (الشريحة 92/410) ، ولكن يمكن ملاحظة أن العين قد غيرت موضعها (انظر أيضا التسجيل السينمائي في المادة التكميلية 6). (ج) محاولة إجراء عملية تحسين التدفق على تسجيل 410 إطارات كاملة تفشل بسبب ضوضاء الحركة. يتم تعزيز حدود الأنسجة بشكل مصطنع بسبب الحركات. (د) عملية بوابات بأثر رجعي تستند إلى شدة الإشارة العادية (SI) عند النقطة الحمراء في A-B. يتم تضمين الإطارات ذات SI > 50 (في المجموع 38 إطارا) ، أي التي تشير إلى أن العين في نفس الموضع كما هو الحال في B ، لإجراء تعزيز التدفق. (ه) الصورة الناتجة عن إجراء تعزيز التدفق ذي البوابات بأثر رجعي. قارن مع C. في الصورة المسورة ، يتم تجنب تحسين الحدود الاصطناعية ، ويمكن ملاحظة تدفق الدم في المشيمية rete mirabile (رأس السهم الأصفر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة الأنواع التي استخدمت فيها تقنية الموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق لتصوير تدفق الدم في العين. تعتمد قابلية تطبيق هذه الطريقة على القدرة على إنتاج تمثيل غني بالتباين لأسرة الأوعية الدموية مقارنة بالخلفية الثابتة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: برنامج نصي ماكرو لأتمتة حسابات تحسين التدفق. تتم كتابة البرنامج النصي بلغة الماكرو IJ1 ويمكن تنفيذه باستخدام وظيفة الماكرو ImageJ (لتسجيل شريحة واحدة) أو عملية ImageJ Batch (لتسجيل 3D متعدد الشريحات). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: تسجيل سينمائي خام من الوضع B على عين سمكة ذهبية (Carassius auratus). يمكن ملاحظة تدفق الدم أثناء تشغيل الفيديو ، ولكن ليس على إطار واحد كما في الشكل 2A. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: شريحة فيديو من خلال عين سمكة ذهبية (Carassius auratus) من الأقسام المحسنة لتدفق الدم. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: ملف TIF ثلاثي الأبعاد للعين الذهبية المعززة بالتدفق (Carassius auratus). تم ربط الصور بمقدار 3 × 3 × 3 لتقليل حجم الملف (تقليل الدقة المكانية وحجم الملف بمقدار 27 ضعفا). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: نموذج تفاعلي ثلاثي الأبعاد لأوعية ما قبل الشبكية وبعدها في عين سمكة ذهبية (Carassius auratus). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: تسجيل سينمائي خام في الوضع B على عين لوحة أوروبية (Pleuronectes platessa). لاحظ حركات الجهاز التنفسي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

يوفر تصوير الأوعية الدموية باستخدام الموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق طريقة جديدة للتصوير غير الغازي للأوعية الدموية للعين التي توفر العديد من المزايا مقارنة بالتقنيات الحالية ولكن لها حدودها الجوهرية. الميزة الأساسية للموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق هي القدرة على توليد تصوير الأوعية العينية بعمق المجال الذي يتجاوز ظهارة صبغة الشبكية ، مما يحد من عمق المجال في التقنيات البصرية. في التصوير بالموجات فوق الصوتية ، يتم تحديد الدقة المكانية وعمق المجال في النهاية من خلال تردد محول الموجات فوق الصوتية ، حيث تزيد الترددات الأعلى من الدقة المكانية ، ولكن على حساب عمق المجال الضحل ، وبالتالي فإن اختيار تردد محول الطاقة يقدم مقايضة بين عمق الصورة والدقة المكانية. في تجربتنا، يتم تحقيق التصوير الأمثل بالموجات فوق الصوتية للشبكية باستخدام محولات الموجات فوق الصوتية عالية التردد (≥50 ميجاهرتز) في عيون صغيرة مع أعماق صور تبلغ <1 سم ومحولات التردد المنخفض (20-40 ميجاهرتز) في عيون أكبر مع أعماق صور تتراوح بين 1.5 و 3.0 سم. بالنسبة للفحص بالموجات فوق الصوتية 3D ، يتم تعيين دقة بعد الشريحة الإضافي من خلال حجم الخطوة بين عمليات الفحص في مكدس عمليات الفحص بالموجات فوق الصوتية 2D. في تجربتنا ، من الصعب إجراء فحص ثلاثي الأبعاد بحجم خطوة أصغر من 20 ميكرومتر.

الموجات فوق الصوتية 2D المعززة بالتدفق لديها دقة زمنية عالية. من الناحية المثالية ، هناك حاجة إلى ≥1000 إطار لكل صورة لتصوير الأوعية الدموية المحسن للتدفق ، لذلك يلزم وجود 8 ثوان على الأقل لكل مسح ضوئي للصورة. يتم تقليل الدقة الزمنية بشكل كبير عند إجراء الموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق 3D ، حيث يزداد وقت المسح الضوئي مع عدد الصور في مكدس عمليات المسح ثلاثي الأبعاد. بالنظر إلى الدقة الزمنية العالية ، يظهر سير عمل الموجات فوق الصوتية 2D المحسن للتدفق إمكانات قوية كوسيلة لتحديد التغيرات الزمنية في سرعات تدفق الدم النسبية وتوزيع تدفق الدم أثناء التلاعب التجريبي. وبالتالي ، يمكن للدراسات المستقبلية استخدام سير العمل لتحديد كيفية تأثير الظروف البيئية المتغيرة (على سبيل المثال ، درجة الحرارة ، pO2 ، pCO2) أو الإدارة الدوائية على تدفق الدم في العين والأعضاء الأخرى.

يعتمد سير عمل الموجات فوق الصوتية على التباين الإيجابي لخلايا الدم الحمراء النووية من معظم الفقاريات غير الثدييات. وهكذا، فإن خلايا الدم الحمراء المنبعثة من الثدييات البالغة وبعض أنواع ^{السمندل37} توفر تباينا ضئيلا جدا لتعزيز تدفق الدم بشكل فعال باستخدام سير العمل الحالي (الشكل 3E,F). في سير العمل التقليدي بالموجات فوق الصوتية، يوفر حقن الأوعية الدموية للفقاعات الدقيقة تباينا عاليا بما يكفي لتحديد الأوعية الدموية في الثدييات38، والتي تم استخدامها لتوليد تصوير الأوعية الدموية للأوعية الدموية داخل عين ^{الفئران39}. ومع ذلك ، تنفجر الفقاعات الدقيقة في غضون دقائق ، وبالتالي فإن توليد تصوير الأوعية الدموية 3D يتطلب حقن microbubble متتالية.

تعتمد الموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق على تسجيلات متسلسلة في نفس موضع العين ، وبالتالي فإن هذه التقنية غير ممكنة في الحيوانات المستيقظة ، حيث قد تعوض الحركات العشوائية البسيطة الصورة وتقوض حسابات تحسين التدفق. وبالتالي ، يجب إجراء الطريقة الحالية تحت التخدير المناسب لشل الحركة لتحسين جودة الصورة عن طريق تقليل الحركات العشوائية. ومع ذلك ، يمكن تعويض الحركات المنتظمة للعين التي تحدث أثناء الحركات التنفسية المنتظمة عن طريق الربط المحتمل أو بأثر رجعي بنمط التهوية للحيوان ، لذلك يتم استخدام تسجيل المسح الضوئي فقط من نفس الفترة الزمنية داخل دورة التهوية في تحليل البيانات. في حين أن نهج البوابة بأثر رجعي لتعويض الحركات التهوية للصورة يحسن بشكل كبير من استقرار الصورة ، فإنه يقلل بشكل واضح من عدد الإطارات المضمنة في حساب الانحراف المعياري لشدة الإشارة مما يؤدي إلى انخفاض في نسبة الإشارة إلى الضوضاء (قارن الشكل 4E بالشكل 2C والشكل 2I ). يتم تخفيف هذا التأثير باستخدام بوابة مستقبلية في الماسح الضوئي بالموجات فوق الصوتية ، حيث يتم الحصول على بيانات الصورة فقط عندما يكون الحيوان في المرحلة المطلوبة من التنفس. ومع ذلك ، يؤدي هذا إلى زيادة ملحوظة في وقت الاكتساب إذا كان يجب الحصول على العدد المطلوب من الإطارات ≥1000.

نرى تطبيقات متعددة في أبحاث علم الحيوان والطب البيطري لسير عمل الموجات فوق الصوتية المعزز بالتدفق لرسم خريطة لفسيولوجيا وتشريح الأوعية الدموية للعين. يتم وصف الأوعية الدموية للأسماك ذات الزعانف الشعاعية والثدييات والطيور بشكل جيد ^نسبيا1،³،⁴،⁸،9،¹²،¹⁵،⁴⁰ ، ولكن هذا ليس هو الحال بالنسبة للأسماك غير العظمية (الفقاريات بدون فك و chondrichthyans) ، والبرمائيات ^، والزواحف ^، التي تمثل مجموعاتها الشقيقة المتباينة السابقة. إن تنفيذ الموجات فوق الصوتية المعززة بالتدفق على هذه المجموعات الحيوانية غير المفهومة جيدا ودمج هذه البيانات مع المعرفة حول مجموعات الدراسات الأكثر جودة سيوفر نظرة ثاقبة أساسية حول تطور الأوعية الدموية للعين الفقارية. نظرا لأن الأوعية الدموية للعين متشابهة في الأنواع ذات الصلة الوثيقة ⁴ ، فإن هذه المعلومات التفصيلية عن الأوعية الدموية العينية في مجموعة واسعة من الأنواع ستوفر نقطة مرجعية للأطباء البيطريين لتحديد التشوهات في الأوعية الدموية في العين بسبب عيوب النمو أو الأمراض أو الإصابات الجسدية. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على الحصول على معلومات تدفق الدم 2D بدقة مكانية زمانية عالية توفر الوسائل لتحديد الآثار الدوائية على توزيع تدفق الدم في أسرة الأوعية الدموية العميقة ، مع تطبيقات واسعة في تطوير الأدوية واختبارها. يجب أن تركز الدراسات المستقبلية حول هذه التقنية على تحديد المركبات القابلة للحقن التي تعزز تباين الدم في الأنواع مع خلايا الدم الحمراء المنبعثة ، مما سيوسع نطاق تطبيق هذه التقنية على الثدييات ذات التطبيقات الواسعة في البحوث الطبية الحيوية والتشخيص السريري لخلل الأوعية الدموية في العين وغيرها من أسرة الأوعية الدموية العميقة.

ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا توجد مصالح كاملة.

وقد تلقى هذا العمل تمويلا من مؤسسة كارلسبرغ (CF17-0778; CF18-0658)، ومؤسسة لوندبيك (R324-2019-1470; R346-2020-1210) ، ومؤسسات Velux (00022458) ، ومؤسسة A.P. Møller لتقدم العلوم الطبية ، وبرنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie (رقم 754513) ، ومؤسسة أبحاث جامعة آرهوس.