Analisi dell'espettorato a qualità controllata mediante citometria a flusso

Questo protocollo descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula e la successiva caratterizzazione di sottoinsiemi cellulari su piattaforme citometriche a flusso standard.

L'espettorato, ampiamente utilizzato per studiare il contenuto cellulare e altre caratteristiche microambientali per comprendere la salute del polmone, viene tradizionalmente analizzato utilizzando metodologie basate sulla citologia. La sua utilità è limitata perché la lettura delle diapositive richiede molto tempo e richiede personale altamente specializzato. Inoltre, detriti estesi e la presenza di troppe cellule epiteliali squamose (VEC), o cellule della guancia, spesso rendono un campione inadeguato per la diagnosi. Al contrario, la citometria a flusso consente la fenotipizzazione ad alto rendimento delle popolazioni cellulari escludendo contemporaneamente detriti e SEC.

Il protocollo qui presentato descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula, colorare anticorpi e fissare popolazioni cellulari e acquisire campioni su una piattaforma citometrica a flusso. Una strategia di gating che descrive l'esclusione di detriti, cellule morte (compresi i SEC) e doppietti cellulari è presentata qui. Inoltre, questo lavoro spiega anche come analizzare le cellule vitali e singole dell'espettorato basate su un gruppo di differenziazione (CD)45 popolazioni positive e negative per caratterizzare i sottoinsiemi di lignaggio ematopoietico ed epiteliale. Una misura di controllo della qualità viene fornita anche identificando macrofagi polmonari specifici come prova che un campione è derivato dal polmone e non è saliva. Infine, è stato dimostrato che questo metodo può essere applicato a diverse piattaforme citometriche fornendo profili espettorati dello stesso paziente analizzati su tre citometri a flusso; Navios EX, LSR II e Lyric. Inoltre, questo protocollo può essere modificato per includere ulteriori marcatori cellulari di interesse. Qui viene presentato un metodo per analizzare un intero campione di espettorato su una piattaforma citometrica a flusso che rende l'espettorato suscettibile di sviluppare diagnostica ad alto rendimento della malattia polmonare.

I progressi tecnici nell'hardware e nel software dei citometri a flusso hanno permesso di identificare contemporaneamente molte popolazioni cellulari distinte1,2,3,4. L'utilizzo del citometro a flusso nella ricerca sulle cellule ematopoietiche, ad esempio, ha portato a una comprensione molto migliore del sistema ^immunitario2 e della gerarchia cellulare del sistema ematopoietico5, nonché alla distinzione diagnostica di una moltitudine di diversi tumori del ^sangue6,7,8. Sebbene la maggior parte delle cellule dell'espettorato siano di origine ematopoietica9,10,11, la citometria a flusso non è stata ampiamente applicata all'analisi dell'espettorato a fini diagnostici. Tuttavia, diversi studi suggeriscono che la valutazione delle popolazioni di cellule immunitarie nell'espettorato (il sottoinsieme più significativo di cellule) può essere di grande aiuto nella diagnosi e / o nel monitoraggio di malattie come l'asma e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)12,13,14,15. Inoltre, l'esistenza di marcatori epiteliali specifici che possono essere utilizzati nella citometria a flusso consente l'interrogazione del seguente sottoinsieme più significativo di cellule nell'espettorato, cellule epiteliali polmonari.

Oltre alla capacità di analizzare molte popolazioni cellulari distinte di diverse origini tissutali, un citometro a flusso può valutare un gran numero di cellule in un periodo relativamente breve. In confronto, i tipi di analisi citologiche basate su diapositive spesso richiedono personale e/o attrezzature altamente specializzati. Queste analisi possono essere laboriose, il che porta all'analisi solo di una parte del campione di ^{espettorato16}.

Tre criticità limitano l'uso diffuso dell'espettorato nella citometria a flusso. La prima questione riguarda la raccolta dell'espettorato. L'espettorato viene raccolto attraverso una tosse che espelle il muco dai polmoni nella cavità orale, sputando successivamente in una tazza di raccolta. Poiché il muco viaggia attraverso la cavità orale, c'è un'alta probabilità di contaminazione SEC. Questa contaminazione complica l'analisi del campione, ma il problema è facilmente risolvibile su una piattaforma citometrica a flusso, come mostrato in questo studio.

Non tutti possono produrre espettorato spontaneamente; pertanto, sono stati sviluppati diversi dispositivi per aiutare con la raccolta dell'espettorato in modo non ^invasivo17. Il nebulizzatore è uno di questi dispositivi e ha dimostrato di produrre campioni di espettorato affidabili18,19,20. Sebbene il nebulizzatore sia un modo molto efficace per raccogliere in modo non invasivo l'espettorato, il suo utilizzo richiede comunque un ambiente in una struttura medica con personale ^{specializzato21}. Al contrario, dispositivi portatili come ^{il flauto polmonare22,23,24} e l'acapella16,25 possono essere utilizzati a casa poiché sono molto user-friendly. Questi dispositivi di assistenza sono sicuri ed economici.

Per noi, l'acapella ha dato risultati costantemente migliori rispetto al flauto ^polmonare16 e, pertanto, il dispositivo a cappella è stato scelto per le collezioni di espettorato. È stato deciso un campione di raccolta di 3 giorni perché lo scopo principale per l'utilizzo dell'espettorato è quello di sviluppare un test di rilevamento del cancro del ^polmone16. È stato dimostrato che un campione di 3 giorni aumenta la probabilità di rilevamento del cancro del polmone rispetto a un campione di 1 o 2 giorni26,27,28. Tuttavia, altri metodi di raccolta dell'espettorato possono essere preferibili per scopi diversi. Se si utilizza un metodo di raccolta dell'espettorato diverso da quello qui descritto, si raccomanda di titolare attentamente ogni anticorpo o colorante utilizzato per l'analisi citometrica a flusso; sono disponibili pochissimi dati su come i diversi metodi di raccolta dell'espettorato influenzano le proteine mirate per la citometria a flusso.

Il secondo problema che smorza l'entusiasmo per l'uso dell'espettorato per la diagnostica, principalmente legato alla citometria a flusso, è il numero di cellule. Il problema è la raccolta di cellule vitali sufficienti per un'analisi affidabile. Due studi hanno dimostrato che i campioni di espettorato raccolti con metodi non invasivi, con l'aiuto di un dispositivo di assistenza, contengono abbastanza cellule vitali che possono essere utilizzate nella diagnosi clinica o negli studi di ^ricerca16,24. Tuttavia, nessuno di questi studi ha affrontato il problema del numero di cellule per quanto riguarda la citometria a flusso.

Per gli studi che costituiscono la base di questo protocollo, sono stati raccolti campioni di espettorato da partecipanti ad alto rischio di sviluppare il cancro del polmone seguendo le linee guida istituzionali approvate per ciascun sito di studio. I partecipanti ad alto rischio sono stati definiti come tra 55-75 anni, avendo fumato 30 anni e non avendo smesso di fumare negli ultimi 15 anni. Ai pazienti è stato mostrato come utilizzare il dispositivo a cappella secondo le istruzioni del ^produttore29 e hanno raccolto l'espettorato per tre giorni consecutivi a casa. Il campione è stato conservato in frigorifero fino all'ultima raccolta. L'ultimo giorno di raccolta, il campione è stato spedito al laboratorio durante la notte con un pacco freddo congelato. I campioni sono stati elaborati in una sospensione a cella singola il giorno in cui sono stati ricevuti. Con questo metodo di raccolta dell'espettorato, si ottengono più che sufficienti cellule vitali per un'analisi citometrica a flusso affidabile.

Infine, e in relazione al precedente problema del numero di cellule, è la questione di come rilasciare le cellule dell'espettorato dal suo ambiente mucinoso. Come si possono mantenere vitali le cellule e creare una sospensione monocellulare che non ostruisca il citometro a flusso? Basato sul lavoro iniziale di Pizzichini et ^al.30 e Miller et ^al.31, questo protocollo descrive un metodo semplice e affidabile per l'elaborazione dell'espettorato in una sospensione a singola cellula adatta per l'analisi citometrica a flusso. Questo metodo ha utilizzato linee guida consolidate nella citometria a ^{flusso32,33,34} per sviluppare un'efficiente strategia di etichettatura degli anticorpi per identificare le cellule ematopoietiche ed epiteliali nell'espettorato e fornire impostazioni dello strumento, misure di controllo della qualità e linee guida di analisi che standardizzano l'analisi dell'espettorato su una piattaforma citometrica a flusso.

Tutte le fasi della lavorazione dell'espettorato vengono eseguite in un armadio di sicurezza biologica con adeguati dispositivi di protezione individuale.

1. Preparazione del reagente prima di iniziare la dissociazione dell'espettorato

1. Scongelare l'1% di paraformaldeide (PFA), 25 ml per campione su ghiaccio e mantenere freddo fino all'uso.
   ATTENZIONE: il PFA è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Preparare il fissativo secondo le istruzioni del produttore e congelare a -20 °C in aliquote da 25 ml fino all'uso.
2. Approssimare il peso del campione e scongelare abbastanza 0,1% di ditiotreitolo (DTT) per il passaggio 2.2 e portarlo a 37 °C. (Le aliquote di DTT devono essere conservate a -20 °C prima dell'uso.)
3. Portare abbastanza 0,5% di N-acetil-L-cisteina (NAC) fino a 37 °C per il passaggio 2.2. (Il NAC deve essere prodotto fresco settimanalmente e conservato a 4 °C prima dell'uso.)

2. Dissociazione dell'espettorato

1. Pesare il campione di espettorato per determinare i volumi di reagenti di dissociazione.
   NOTA: un campione è considerato piccolo se il peso iniziale è ≤3 g, medio se >3 g ma ≤8 g, grande se >8 ma ≤16 g ed extra-large se un campione pesa >16 g. Le indicazioni small, medium, large ed extra-large saranno utilizzate in tutto il protocollo. La quantità di reagenti necessari per la dissociazione e l'etichettatura varia a seconda delle dimensioni del campione di espettorato.
2. Trasferire un piccolo campione in un tubo conico pulito da 50 ml, un campione medio in una bottiglia monouso di plastica pulita da 250 ml o un campione grande ed extra-large in una bottiglia monouso di plastica pulita da 500 ml. Aggiungere 1 mL/g di peso del campione dello 0,5% NAC e 4 mL/g di peso del campione dello 0,1% DTT.
3. Vortice alla massima velocità (per 15 s), e poi roccia a temperatura ambiente (alla massima velocità) per 15 min.
4. Diluire il campione con quattro volumi di Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (in base al volume totale del campione + reagenti) per neutralizzare il NAC e il DTT; vortice rapidamente alla massima velocità e roccia a temperatura ambiente per 5 minuti alla massima velocità.
5. Filtrare la sospensione cellulare attraverso filtri per celle a rete di nylon da 100 μm in uno o più tubi conici centrifughi da 50 mL per creare una sospensione a cella singola.
6. Centrifugare le celle a 800 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il surnatante, unire tutti i pellet in un tubo conico da 15 ml e quindi lavare i pellet con HBSS utilizzando le stesse condizioni.
7. Risospesso il pellet cellulare in un volume di tampone determinato dal peso iniziale del campione di espettorato.
   NOTA: un piccolo campione viene risospeso in 250 μL di HBSS. Un campione medio viene risospeso in 760 μL di HBSS. Campioni grandi ed extra-grandi vengono risospesi in 1460 μL di HBSS.
8. Prendere un'aliquota della sospensione cellulare per un conteggio di cellule vive / morte usando Trypan Blue.
   NOTA: per un piccolo campione, utilizzare 5 μL. Per un campione medio, grande o extra-large, utilizzare 10 μL. Diluire 1:10 con HBSS.
   1. Mescolare 10 μL della diluizione dell'espettorato con 30 μL di 0,4% trypan blue per ottenere una diluizione finale del campione di 1:40. Caricare nelle camere di conteggio di un emocitometro per un conteggio delle cellule.
      NOTA: potrebbe essere necessario regolare la diluizione finale se i numeri di cella sono troppo bassi o troppo alti per ottenere un conteggio accurato. Consultare Guiot et ^al.20 per distinguere correttamente le cellule dell'espettorato da SEC e detriti è fortemente raccomandato qui. Questo è essenziale per un conteggio accurato delle cellule.
9. Dal campione extra-large, rimuovere 50 x ¹⁰⁶ celle dal totale e aggiungerle a un nuovo tubo con abbastanza HBSS aggiunto per creare un volume totale di 1700 μL.
   Nota : considerare questo un campione di grandi dimensioni per il resto del protocollo. I campioni rimanenti possono essere scartati o utilizzati per altri scopi.

3. Colorazione di anticorpi e coloranti vitali

1. Scelta di anticorpi e colorante colorante
   NOTA: La Tabella 1 mostra gli anticorpi e il colorante di vitalità utilizzati in questo protocollo e le popolazioni cellulari che identificano.
   1. Etichettare i tubi contenenti le cellule dell'espettorato (vedere tabella 2 per le etichette).
   2. Utilizzare provette citometriche a flusso da 5 ml (compatibili con il citometro a flusso utilizzato) per la provetta campione con le cellule non macchiate e la provetta con il controllo dell'isotipo. Utilizzare tubi conici da 15 ml per i campioni di sangue e di prove epiteliali.
      NOTA: Questi campioni saranno trasferiti in provette citometriche a flusso dopo la colorazione e la fissazione degli anticorpi.
2. Etichettare i tubi di compensazione (Tabella 3).
   NOTA: Utilizzare provette citometriche a flusso da 5 ml compatibili con il citometro a flusso utilizzato.
3. Aggiungere la quantità di HBSS, anticorpo e/o colorante a ciascuna delle cellule dell'espettorato e delle provette di compensazione come indicato rispettivamente nella Tabella 2 e nella Tabella 3.
   NOTA: aggiungere tampone (HBBS), anticorpi e colorante a tutti i tubi prima di aggiungere cellule o perline di compensazione per garantire che il tempo di colorazione di tutti i tubi sia coerente.
4. Aggiungere le quantità di volume delle cellule dell'espettorato elencate nella Tabella 2 ai tubi di dosaggio.
5. Aggiungere perline di compensazione ai tubi di compensazione elencati nella Tabella 3.
6. Incubare tutti i tubi (tubi di dosaggio e compensazione) su ghiaccio, al riparo dalla luce, per 35 min. Quindi, riempire i tubi con HBSS ghiacciato e centrifugare a 4 °C per 10 minuti a 800 x g.
7. Per i tubi di compensazione, aspirare il surnatante il più vicino possibile al pellet e far scorrere i pellet per allentare.
8. Aggiungere 0,5 ml di HBSS freddo ai tubi di compensazione, conservarli sul ghiaccio a 4 °C e proteggerli dalla luce fino a quando non sono necessari per l'analisi della citometria a flusso.
9. Aspirare il surnatante dall'isotipo non macchiato, dal sangue e dai tubi epiteliali dopo la centrifugazione (fase 3.6 dalla sezione di colorazione degli anticorpi) e allentare i pellet facendo scorrere i tubi.

4. Fissazione con 1% Paraformaldeide (PFA)

1. Aggiungere l'1% di PFA freddo (che dovrebbe essere scongelato ormai) ai tubi non macchiati, isotipo, sangue ed epiteliali; 2 mL ai tubi non macchiati e isotipici e 10 mL ai tubi del sangue e dell'epitelio.
2. Incubare i tubi sul ghiaccio, protetti dalla luce per 1 ora. Vortice rapidamente alla massima velocità dopo 30 min.
3. Riempire i tubi con HBSS ghiacciato. Quindi, centrifugare i tubi a 4 °C per 10 minuti a 1600 x g.
4. Aspirare il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e far scorrere il tubo con le dita per allentare le cellule.
5. Aggiungere 200 μL di HBSS freddo ai tubi non macchiati e isotipici.
6. Calcolare il volume di HBSS per la risospensione del sangue e del tubo epiteliale in base al numero totale di cellule.
   NOTA: volume di risospensione = 0,15 x [conteggio totale delle cellule (fase 8 della dissociazione dell'espettorato) / ¹⁰⁶]. Utilizzare 50 x ¹⁰⁶ come conteggio delle celle per un campione extra-large.
7. Conservare tutti i campioni e le provette di compensazione, al riparo dalla luce sul ghiaccio a 4 °C fino all'esecuzione dell'analisi citometrica a flusso.
   NOTA: questo protocollo non è stato testato per l'archiviazione per più di 24 ore.

5. Acquisizione dati sul citometro a flusso

1. Applicare procedure di avvio appropriate per il citometro a flusso utilizzato.
   NOTA: Questa sezione del protocollo presuppone che la persona che utilizza il citometro a flusso sia addestrata all'uso dello strumento a sua disposizione, in particolare per quanto riguarda le procedure quotidiane tra cui il controllo della stabilità dei sistemi ottici e fluidici, le tecniche per standardizzare la diffusione della luce e l'intensità della fluorescenza, nonché il calcolo e l'applicazione della corretta matrice di compensazione.
2. Utilizzare la miscela di perline del National Institute of Standards and Technology (NIST) per garantire che le tensioni di dispersione diretta e di dispersione laterale siano impostate per posizionare le perle NIST per coprire l'intero grafico senza posizionare le perline troppo vicino agli assi.
   NOTA: questo passaggio è fondamentale per garantire che i detriti inferiori a 5 μm possano essere eliminati mediante l'analisi post-acquisizione. A seconda del citometro a flusso utilizzato, tenere presente che le perle più piccole non vengono escluse con la soglia (quando si utilizza LSR II o Lyric) o con il discriminatore elevato (utilizzando il citometro a flusso Navios EX). Per il Navios EX, è stato utilizzato un guadagno di 2 per lo scatter avanti e laterale, una tensione di 236 per lo scatter forward e 250 per lo scatter laterale. Per l'LSR II è stata utilizzata una tensione di diffusione diretta di 165 e una tensione di dispersione laterale di 190.
3. Impostare la portata su media (LSR II) o alta (Navios EX).
   NOTA: La portata media o alta per la maggior parte degli strumenti può essere utilizzata per acquisire i tubi dell'espettorato. È importante notare che l'uso di una portata troppo lenta o troppo diluita del campione può causare la sedimentazione delle cellule, con conseguente aumento del vortice che non è desiderato. Pertanto, l'adesione al volume di risospensione calcolato nel passaggio 4.6 dovrebbe comportare una densità cellulare che può essere acquisita rapidamente ma non ostruire la macchina.
4. Regolare le tensioni per ciascun parametro utilizzato per i parametri di dispersione e fluorescenti per posizionare le popolazioni cellulari sulla scala. Usa le cifre con la strategia di gating come guida su come regolare le tensioni di conseguenza.
   NOTA: assicurarsi che tutti i parametri necessari siano selezionati nella finestra di selezione dei parametri prima dell'acquisizione o che i dati non vengano acquisiti.
5. Acquisire prima i dati per il campione di espettorato non macchiato, seguito dal campione colorato di isotipo, quindi dalla sonda sanguigna e dalla tuba epiteliale.
   NOTA: Se la sospensione cellulare è troppo concentrata per consentire al citometro a flusso di eseguire i campioni senza intasamento, i campioni possono essere ulteriormente diluiti con HBSS.

Questo protocollo è stato sviluppato pensando a un ambiente di laboratorio clinico. Durante lo sviluppo del protocollo ci si è concentrati sulla semplicità, l'efficienza e la riproducibilità. Si è scoperto che la fase più dispendiosa in termini di tempo nell'elaborazione dell'espettorato era il conteggio delle cellule. Pertanto, il protocollo è impostato in modo tale che l'elaborazione dell'espettorato e l'etichettatura delle cellule possano essere eseguite indipendentemente dal conteggio delle cellule senza perdita di tempo. Un conteggio cellulare accurato, che è ancora necessario per diluire il campione in modo appropriato per una corsa senza ostacoli, può quindi essere ottenuto durante il periodo di incubazione dell'etichettatura degli anticorpi.

Questo protocollo utilizza una misura del peso dell'espettorato invece di un conteggio cellulare come indicazione di quanti anticorpi / coloranti utilizzare per l'etichettatura ottimale delle cellule. Tuttavia, c'è un grande grado di variazione nel peso dei campioni di espettorato; dei 126 campioni analizzati, il peso variava da 0,57 g a 38,30 g. La figura 1A mostra che la correlazione tra peso dell'espettorato e resa cellulare non è forte. Pertanto, i campioni sono stati suddivisi in quattro categorie; i pesi mediani dei campioni erano 2,1 g per i campioni piccoli, 5,0 g per i campioni medi, 11,2 g per i campioni di grandi dimensioni e 22,0 g per i campioni extra-large (Figura 1B). Tuttavia, c'erano ancora campioni che producevano molte più cellule del previsto in base al loro peso (Figura 1C), la maggior parte dei campioni si raggruppava bene. Per i campioni di piccole dimensioni, la resa cellulare mediana era di 8,0 x ¹⁰⁶ celle, per campioni medi 13,0 x ¹⁰⁶, per campioni di grandi dimensioni 35,4 x ¹⁰⁶ e campioni extra-large 93,0 x ¹⁰⁶.

Ogni anticorpo utilizzato in questo protocollo è stato titolato. Come concentrazione di lavoro è stata scelta una concentrazione sulla fase di plateau (Figura 2A) con il più alto indice di colorazione (Figura 2B) della curva di titolazione. Le variazioni nel numero di cellule non altereranno drasticamente l'intensità della colorazione. Questa titolazione e test degli anticorpi è essenziale e deve essere impostata con cura per ogni nuovo anticorpo o colorante utilizzato in questo ^{protocollo34,35}. Quando un anticorpo è titolato con cura, dovrebbe macchiare da 10 a 50 volte più cellule rispetto al numero di cellule su cui l'anticorpo è stato ^{titolato34,35}. Un esempio di questo principio è fornito nella tabella 4. L'anticorpo anti-umano CD45-PE è stato titolato su 1 x ¹⁰⁶ cellule in un volume totale di 400 μL. Se questo anticorpo al volume di colorazione viene estrapolato al protocollo (vedere tabella 2, che mostra la quantità di CD45-PE e i volumi di colorazione per ogni dimensione del campione), per un piccolo campione, 0,625 x ¹⁰⁶ cellule saranno colorate, 1,25 x ¹⁰⁶ cellule saranno colorate per un campione medio e 2,5 x ¹⁰⁶ cellule per un campione di grandi dimensioni (colonna A nella Tabella 4). Un eccesso di 50 volte nel numero di celle per ogni categoria viene calcolato rispettivamente in 31,25 x ¹⁰⁶, 62,5 x ¹⁰⁶ e 125 x ¹⁰⁶ celle (colonna B). Come mostrato nelle colonne C e D, il numero di celle mediano di ciascuna categoria di dimensioni e il campione più grande in ciascuna categoria rientrano nell'intervallo di 50 volte.

Nonostante le apparenti differenze di dimensioni e resa cellulare tra le varie dimensioni dei campioni di espettorato, la percentuale mediana di contaminazione SEC in ciascuna categoria è molto simile. La figura 3A mostra la percentuale di SEC trovati in singoli campioni, stratificati in base alla loro categoria di peso dell'espettorato. La preoccupazione principale era con i SEC poiché queste cellule non sono rappresentative del tessuto polmonare ma della cavità orale. Tuttavia, la contaminazione media SEC è inferiore al 20% per tutte le categorie. La Figura 3B mostra la percentuale di cellule vitali trovate in questi campioni. Escludendo i SEC, la redditività media è stata di circa il 72% per le categorie di campioni di piccole, medie e grandi dimensioni. Era leggermente più alto (79%) per la categoria extra-large.

La Figura 4 mostra una tipica strategia di gating per separare le cellule dell'espettorato di interesse da detriti, cellule morte (che include anche i SEC ^{contaminanti36}) e grumi cellulari. La Figura 4A mostra l'uso di perline NIST per impostare cancelli per eliminare detriti più piccoli di 5 μm o più grandi di 30 μm, mentre la Figura 4B applica questo gate sulle cellule dell'espettorato. La Figura 4C mostra un tipico profilo dell'espettorato se visto come larghezza di dispersione laterale (SSC-W) contro larghezza di dispersione in avanti (FSC-W), il cancello di larghezza. Questo profilo viene utilizzato per eliminare piccoli detriti che si presentano lungo gli assi SSC-W e FSC-W. L'eliminazione delle cellule morte è mostrata nelle Figure 4D e Figura 4E. Il controllo non macchiato (Figura 4D) viene utilizzato per determinare il cut-off per la positività di FVS510; le cellule che si colorano positive per FVS510 al di sopra del controllo negativo sono considerate morte e non saranno utilizzate nell'analisi delle cellule dell'espettorato (Figura 4E). Infine, viene applicato un cancello singoletto per rimuovere i doppietti cellulari dall'analisi, come mostrato nella Figura 4F. Pertanto, le cellule che hanno superato le porte di selezione mostrate nelle Figure 4B, Figura 4C, Figura 4E e Figura 4F rappresentano cellule di espettorato singole e vive pronte per la successiva analisi con gli anticorpi utilizzati in questo protocollo.

L'uso dell'anticorpo anti-CD45 in questo protocollo di etichettatura consente la separazione di cellule espettorato singole vive in un compartimento cellulare del sangue (CD45⁺) e in un compartimento cellulare non ematico (CD45^-). Quest'ultima categoria comprende le cellule epiteliali e altre cellule non del sangue. Il profilo superiore nella Figura 5A mostra l'uso di un campione di espettorato non macchiato per impostare il cut-off per la positività CD45, rendendo le porte per catturare le cellule CD45⁺ e le cellule CD45^-. Il profilo inferiore della Figura 5A mostra entrambe queste porte applicate a un campione di espettorato colorato con l'anticorpo anti-CD45. La colorazione con anticorpi aggiuntivi viene quindi utilizzata per identificare le popolazioni specifiche delle cellule del sangue all'interno del gate CD45⁺ (Figura 5B) e altre popolazioni non di cellule del sangue, comprese le popolazioni epiteliali nel CD45-gate (Figura 5C). In entrambe le figure, i profili superiori mostrano come l'espettorato colorato con isotipo viene utilizzato per impostare le doppie popolazioni negative, mentre i profili inferiori mostrano le cellule dell'espettorato macchiate di anticorpi. La Figura 5B (in basso) mostra sei diverse popolazioni cellulari CD45⁺ create con il cocktail di anticorpi rilevabili nel canale fluorescenza (FL) 1 canale (anticorpi anti-CD66b, CD3, CD19) e l'anti-CD206 rilevabile nel canale FL3. Esperimenti di smistamento hanno rivelato che i macrofagi polmonari specifici risiedono nelle porte identificate con M. La presenza di cellule in queste porte indica quindi che il campione di espettorato era derivato dal polmone e non era saliva (Bederka et al., manoscritto in preparazione). La Figura 5C (in basso) mostra i quadranti di gating creati con gli anticorpi anti-pan-citocheratina (panCK) rilevabili nel canale FL1 e gli anticorpi anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) rilevabili nel canale FL3 tra le ^cellule dell'espettorato CD45-.

Questo protocollo di etichettatura è stato ampiamente testato su Navios EX e LSR II. Alcuni esperimenti preliminari sono stati eseguiti sul Lyric, ma senza l'ampia ottimizzazione dello strumento che è stata fatta per le altre due macchine. Pertanto, le impostazioni dettagliate dello strumento sono fornite per il Navios EX e l'LSR II nella scheda Materiali, ma non per il Lyric. Per comprendere le somiglianze e le variazioni tra queste tre piattaforme citometriche a flusso che possono essere utilizzate per analizzare le cellule dell'espettorato, i profili ottenuti dalle varie macchine possono essere confrontati in Figura 6 e Figura 7. Due grandi campioni di espettorato sono stati elaborati, raggruppati, etichettati, separati in tre porzioni uguali e successivamente acquisiti su ciascun citometro a flusso sopra menzionato. La Figura 6, simile alla Figura 4, confronta la strategia di gating per eliminare detriti, cellule morte e grumi cellulari. La Figura 7, che è identica alla Figura 5, confronta i profili ematici e non ematici dai dati acquisiti sui vari citometri a flusso.

Confrontando i vari profili ottenuti dai tre diversi citometri a flusso si evince che con ogni strumento si possono osservare gli stessi profili di base. Le differenze a cui prestare attenzione sono i grafici SSC-W/FSC-W (width gate) (Figura 6, seconda riga) e le scale lineari dei grafici a dispersione (Figure 6 e 7). Il grafico della larghezza di dispersione generato sul Navios EX mostra un cancello di inclusione (riquadro rosso), il che significa che tutte le celle incluse nel cancello vengono ulteriormente analizzate; sono esclusi gli eventi lungo gli assi nell'angolo in basso a sinistra. I grafici a larghezza di dispersione sull'LSR II e lyric non mostrano un deposito simile di eventi lungo questi stessi assi. Questa discrepanza è probabilmente dovuta alla soglia molto sensibile utilizzata sul Navios EX, che porta ad alcuni piccoli detriti nel precedente cancello di esclusione delle dimensioni (fila superiore della Figura 6). A volte, i detriti sono visti lungo gli assi nel profilo di larghezza di dispersione generato sull'LSRII, ma si trovano nell'angolo in basso a destra. In questi casi, un gate di esclusione (come indicato dalla casella rossa tratteggiata nel profilo centrale nella riga 2 della Figura 6) viene utilizzato per eliminare questi eventi da ulteriori analisi.

Mentre le scale di log appaiono leggermente diverse sulle trame tra il Navios EX e i citometri Lyric e LSR II, il Navios EX ha la possibilità di acquisire dati utilizzando più decenni. L'implementazione di più decenni dipende dal contesto dell'esperimento e dalla sensibilità desiderata per visualizzare le popolazioni di interesse.

Un'ulteriore differenza notevole tra i citometri Navios EX e LSR II e Lyric è l'aspetto del profilo della porta singoletto. Il citometro Navios EX è dotato di una cella a flusso rettangolare con un angolo di raccolta diverso rispetto all'LSR II. Navios EX contiene tre angoli di raccolta controllati da software per ottimizzare la diffusione della luce nell'angolo in avanti per ottenere la sensibilità appropriata per la dimensione delle particelle da analizzare. Il gate poligonale per il citometro Navios EX dovrà essere regolato con un angolo leggermente inferiore rispetto al gate singoletto per LSRII. Il cancello singoletto per il Lyric può essere ottimizzato per ottenere un profilo simile a quello visto con l'LSR II. Utilizzando il campione di espettorato, il fattore di scala dell'area dovrebbe essere ottimizzato per ciascun laser sul Lyric per ottenere un cancello singoletto simile all'LSR II.

Tutti i profili mostrati in Figura 4 a Figura 7 sono stati analizzati con il software FlowJo, versione 10.6. I file .fcs possono essere trovati nel FlowRepository (https://flowrepository.org), sotto gli ID FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ e FR-FCM-Z3MM e possono essere utilizzati per praticare l'analisi dell'espettorato come illustrato in queste figure.

Figura 1: Pesi dell'espettorato e resa cellulare. (A) Viene illustrata la relazione tra il peso dell'espettorato, determinato prima dell'elaborazione, e la resa cellulare totale, determinata dopo l'elaborazione utilizzando un emocitometro. Ogni proiettile rappresenta un singolo campione, 126 in totale. (B) I campioni di espettorato sono stati stratificati in quattro categorie in base al loro peso: piccoli per campioni di peso fino a 3 g, medi per campioni di peso superiore a 3 g fino a 8 g, grandi per campioni di peso superiore a 8 g fino a 16 g e campioni extra-large per quelli di peso superiore a 16 g. (C) È indicata la distribuzione della resa cellulare per i campioni di ciascuna categoria. Le barre rosse di (B) e (C) rappresentano i valori mediani in ogni categoria. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Titolazione degli anticorpi per CD45-PE anti-umano. (A) La curva di titolazione CD45-PE (IgG1) con l'intensità media di fluorescenza (IFM) della popolazione positiva tracciata rispetto alla concentrazione degli plateau degli anticorpi CD45-PE a 1 μg/mL. (B) La curva di titolazione che rappresenta l'indice di colorazione rispetto alla concentrazione di anticorpi mostra che l'indice di colorazione più alto è a 1 μg/mL. L'indice di colorazione è stato calcolato come: [POPOLAZIONE POSITIVA MFI CD45 - Popolazione CFM CD45 negativa] / [2 * Deviazione standard]. Sulla base della Figura 2A e della Figura 2B, è stato scelto 1 μg/mL come concentrazione ottimale per l'anticorpo CD45-PE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La proporzione di SEC e cellule morte nei campioni di espettorato è coerente tra le quattro categorie di peso. (A) La proporzione di SEC nei campioni di espettorato è classificata in base alla loro categoria di peso. La percentuale di contaminazione SEC è stata determinata dall'emocitometro come parte del conteggio totale delle cellule. (B) Vitalità cellulare dei campioni di espettorato escluse le SECS, determinate mediante emocitometro e il metodo di esclusione del tripano blu. Per ogni grafico, le linee rosse rappresentano i valori mediani. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Strategia di Gating per escludere detriti, cellule morte e doppietti in un campione di espettorato. (A) Le perle NIST di dimensioni 5 μm, 20 μm e 30 μm sono state utilizzate per impostare il cancello indicato dalla scatola rossa per escludere detriti più piccoli di 5 μm e detriti più grandi sopra 30 μm e vicini all'asse. (B) Un campione di espettorato è stato acquisito utilizzando le stesse tensioni per lo scatter avanti e laterale di quello delle perle NIST. Il cancello creato in (A) è stato applicato per escludere i detriti. (C) Piccoli detriti vicini all'asse sono stati esclusi in questo grafico a larghezza di dispersione. (D) Un campione di espettorato non macchiato è stato utilizzato per impostare il cut-off (linea rossa) per la popolazione negativa e non macchiata per il colorante di vitalità. (E) Il cut-off creato in D è stato applicato al campione di espettorato colorato per formare un cancello (scatola rossa) per includere cellule vive e vitali. (F) La porta singoletto indicata dal poligono rosso esclude le celle che non cadono sulla diagonale, eliminando doppietti e/o grumi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Strategia di gating delle cellule dell'espettorato nei compartimenti del sangue e delle cellule non del sangue. (A) Le cellule dell'espettorato non macchiate derivate dalla porta singoletto vengono utilizzate per impostare il cut-off (linea rossa) sulla popolazione negativa per CD45 (in alto). Il cut-off dal profilo superiore viene applicato al campione di espettorato colorato (in basso) per differenziare le popolazioni CD45 positive (CD45⁺) e negative (CD45^-). (B) Le cellule dell'espettorato CD45⁺ colorate con anticorpi isotipici per FITC/AF488 sono utilizzate per impostare le porte sulla popolazione negativa (in alto). Le stesse porte vengono applicate alle cellule dell'espettorato CD45⁺ colorate con marcatori di cellule del sangue CD3, CD19, CD66b e CD206 (in basso). (C) Le porte del quadrante sono posizionate sulle cellule dell'espettorato CD45^- colorate con controlli isotipici (in alto) e applicate alle cellule CD45^- dal campione di espettorato colorato con i marcatori epiteliali pan-citocheratina (panCK) ed EpCAM (in basso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Strategia di Gating per escludere detriti, grumi e cellule morte di cellule dell'espettorato colorate su tre piattaforme citometriche a flusso. Due grandi campioni di espettorato sono stati elaborati, raggruppati, etichettati e divisi in tre porzioni uguali per l'acquisizione sui citometri a flusso Navios EX (A), LSR II (B) e Lyric (C). Riga superiore: i campioni di espettorato sono stati recintati (scatola rossa) per escludere detriti molto piccoli e grandi. Seconda fila: la grande scatola rossa nella trama Navios EX rappresenta un cancello di inclusione che include le celle ma esclude i detriti. La piccola scatola rossa tratteggiata vista nel grafico LSR II rappresenta un cancello di esclusione per eliminare i detriti da ulteriori analisi. È necessaria un'ulteriore ottimizzazione con il Lyric per determinare dove è necessario il gating di esclusione dei detriti. Pertanto, nessun cancello è presente in quella trama. Terza fila: i cancelli rettangolari rossi includono celle vive per ulteriori analisi. Riga inferiore: il cancello poligonale ha celle singole escludendo i doppietti che cadono al di fuori della diagonale del cancello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Strategia di Gating per l'espettorato colorato per i marcatori del sangue e epiteliali su tre piattaforme citometriche a flusso. L'analisi mostrata nella Figura 6 è proseguita nella Figura 7; tutte le singole cellule vitali (riga inferiore, Figura 6) sono state divise in popolazioni CD45⁺ e CD45^- (prima riga, Figura 7), in modo che i marcatori specifici delle cellule del sangue e i marcatori specifici delle cellule epiteliali potessero delineare ulteriormente queste popolazioni. Seconda riga: profilo dei marcatori delle cellule del sangue CD3/CD19/CD66b e CD206 da cellule CD45⁺ . Terza fila: marcatori cellulari epiteliali panCK ed EpCAM da cellule CD45^- . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Anticorpi e macchie di vitalità utilizzati. Elenco degli anticorpi e del colorante di vitalità utilizzati in questo protocollo. Sono indicati i sottoinsiemi cellulari che ciascuno di essi identifica.

Tabella 2: Contenuto di tubi con cellule dell'espettorato. Utilizzare questa tabella come indicato nel protocollo per aggiungere i volumi specificati di anticorpi e la colorazione di vitalità per la dimensione del campione appropriata.

Tabella 3: Contenuto dei tubi di compensazione. Utilizzare questa tabella come indicato nel protocollo per aggiungere i volumi specificati di anticorpi alle perle di compensazione.

Tabella 4: Concentrazione anti-umana di CD45-PE per tutti i campioni in ciascuna categoria di dimensioni del campione.

Il contenuto cellulare dell'espettorato comprende una grande varietà di cellule ad ampio raggio, spesso accompagnate da molti ^detriti37. Inoltre, l'analisi dell'espettorato richiede un controllo di qualità che confermi che il campione viene raccolto dal polmone anziché dalla cavità ^orale38. Pertanto, non è così semplice analizzare l'espettorato mediante citometria a flusso come lo è per il sangue, ad esempio, che rilascia una sospensione cellulare molto più pulita e omogenea. Questo protocollo ha affrontato tutti questi problemi: fornire impostazioni dello strumento utilizzando perline di dimensioni specifiche per garantire che possano essere rilevate sia le popolazioni cellulari più piccole che quelle più grandi, una strategia di gating per eliminare detriti, grumi cellulari, SEC contaminanti e altre cellule morte e, infine, una misura di controllo della qualità per garantire che un campione di espettorato provenga dal polmone invece di essere per lo più saliva.

Ci sono passaggi critici nel protocollo nel lavorare con l'espettorato che vale la pena sottolineare. In primo luogo, la resa cellulare può essere drasticamente influenzata dal numero di filtri per cellule di nylon utilizzati nella fase 2.5 della parte di dissociazione dell'espettorato del protocollo. Possono essere necessari più filtri per evitare di perdere troppe cellule a causa dell'intasamento del filtro. Quando il flusso attraverso i filtri è rallentato notevolmente, è necessario utilizzare un nuovo filtro. In secondo luogo, il pellet cellulare di campioni di espettorato può essere molto sciolto, specialmente se c'è un'elevata contaminazione dei SEC. Pertanto, è essenziale non aspirare troppo vicino al pellet quando si rimuove il surnatante dopo aver centrifugato i campioni. Aspirare troppo vicino al pellet può comportare la perdita di cella, se non la perdita dell'intero pellet. In terzo luogo, questo protocollo richiede un passaggio di fissazione. Ciò preserva le cellule e il loro profilo di colorazione e funge da misura di sicurezza per proteggere l'operatore del citometro a flusso. L'esecuzione di campioni su determinati citometri a flusso può presentare maggiori rischi biologici a causa del potenziale di produzione di ^aerosol39. La fissazione del PFA aiuta a proteggere l'operatore da potenziali agenti patogeni nel campione di espettorato. Quarto, e forse l'aspetto più impegnativo della preparazione di campioni di espettorato per l'analisi citometrica a flusso, è il conteggio delle cellule. Il conteggio delle cellule è complicato a causa della grande varietà di tipi di cellule presenti nell'espettorato. Le macchine di conteggio sono spesso limitate dall'intervallo di dimensioni delle celle che possono catturare e sono quindi meno affidabili di un emocitometro. Tuttavia, il conteggio cellulare dei campioni di espettorato mediante emocitometro, che è ottimamente descritto da Guiot et ^al.20, è noioso e richiede pratica per diventare competente. Un numero di cellule accurato è fondamentale per determinare il volume di risospensione finale del campione per consentire una portata ragionevole e prevenire gli intasamenti nel citometro a flusso. La presenza dei SEC molto grandi nell'espettorato e dei molti grumi cellulari più piccoli che non vengono spezzati dal tampone di dissociazione, né catturati dai filtri, aumentano la probabilità di intasare il citometro a flusso. Pertanto, si consiglia di dedicare un po 'di tempo a determinare la migliore concentrazione / portata cellulare per l'acquisizione dei dati utilizzando il citometro a flusso disponibile. Inoltre, assicurarsi che il citometro a flusso abbia la dimensione appropriata della cellula di flusso e dell'ugello (o sonda) in grado di misurare le popolazioni cellulari più grandi presenti nell'espettorato.

Anche quando la competenza nel conteggio delle cellule è stata raggiunta, è ancora un processo che richiede tempo. Pertanto, la determinazione dei reagenti per l'etichettatura delle cellule in questo protocollo si basa sulla dimensione del campione (come giudicato in base al peso) piuttosto che sul numero di cellule. Ciò consente un uso più efficiente del tempo poiché il conteggio manuale delle cellule può essere completato durante il tempo necessario per la colorazione del colorante anticorpale e di vitalità. Tuttavia, ci sono tre notevoli eccezioni a questo. Se un campione è >16 g (i cosiddetti campioni extra-large), il conteggio manuale delle cellule dovrebbe avvenire prima della colorazione in modo che i reagenti costosi possano essere conservati colorando solo 25 x ¹⁰⁶ cellule ciascuna per il sangue e le tube epiteliali. Questo numero di cella fornisce profili molto affidabili nelle impostazioni descritte in questo protocollo. Un'altra potenziale eccezione è il caso di un campione molto piccolo. La stima è che sia necessario un minimo di 1-2 x ¹⁰⁶ cellule per l'analisi della citometria a flusso come presentato in questo protocollo per generare profili affidabili (dati non mostrati). Pertanto, se un campione contiene meno di 1-2 x ¹⁰⁶ cellule, potrebbe non valere la pena continuare con la procedura poiché il risultato finale sarà probabilmente inaccettabile.

Specifici reagenti di etichettatura che funzionano bene sulle cellule del sangue periferico o sulle linee cellulari possono funzionare in modo molto diverso sulle cellule del sangue contenute nell'espettorato (osservazioni non pubblicate). Pertanto, si raccomanda di titolare ciascun anticorpo o altro reagente di etichettatura secondo protocolli ^{consolidati34,35} prima che vengano utilizzati negli esperimenti di citometria a flusso. La maggior parte delle titolazioni anticorpali dovrebbe dare risultati comparabili quando si colora fino a 10-50 volte; tuttavia, si consiglia di effettuare titolazioni aggiuntive con numeri di cella superiori a tale ^intervallo34. Quando è stata determinata una concentrazione di reagente, è essenziale mantenere il tempo di incubazione di quel reagente lo stesso dell'esperimento vero e proprio. Per questo motivo, il protocollo sottolinea l'aggiunta di tutto il tampone e i reagenti ai tubi prima che vengano aggiunte le cellule o le perle di compensazione. Questo ordine di aggiunta di reagenti e cellule / perline insieme consente una maggiore coerenza nei tempi di etichettatura. Se, per qualche motivo, il tempo di incubazione sperimentale non può essere mantenuto simile a quello utilizzato per la titolazione anticorpo/colorante, quest'ultimo deve essere ripetuto con un tempo di incubazione fattibile durante gli esperimenti.

I campioni di espettorato sono stati ampiamente utilizzati come campione diagnostico per studiare la fisiopatologia di varie malattie che colpiscono il polmone. La ^{tubercolosi40,41}, la ^BPCO13,42, l'asma43, la fibrosi ^cistica44,45, il cancro ai ^{polmoni46,47,48} e l'artrite reumatoide49 sono tra le molte malattie in cui l'espettorato è stato studiato a causa del vantaggio di essere un campione ottenuto in modo non invasivo. Più recentemente, durante la pandemia di coronavirus, l'espettorato è stato utilizzato per rilevare lo spargimento virale prolungato nei pazienti ricoverati in ospedale con malattia da coronavirus 2019 (COVID-19)⁵⁰.

Varie tecnologie, tra cui la reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR), l'analisi delle proteine, la microscopia e la citometria a flusso, sono state utilizzate per identificare i marcatori specifici della malattia nell'espettorato. L'utilizzo di una piattaforma citometrica a flusso per analizzare campioni di espettorato non è ampiamente utilizzato, ma il suo uso aumenta. Con i recenti progressi nella tecnologia dei citometri a flusso3,51,52, così come i progressi nella chimica dei fluorofori, la generazione di nuovi cloni di anticorpi e lo sviluppo di vari coloranti per identificare le popolazioni di cellule ^{morte51,53,54}, la possibilità di progettare pannelli anticorpali volti a diagnosticare le malattie umane è aumentata drasticamente. Inoltre, la recente spinta per automatizzare l'analisi dei dati citometrici a ^flusso55,56 eliminerà il potenziale pregiudizio nella lettura e nell'interpretazione manuale dei dati di flusso. Questi nuovi sviluppi nella citometria a flusso faciliteranno significativamente l'esplorazione dell'espettorato come diagnostica clinica.

Tutti gli autori sono dipendenti passati o attuali di bioAffinity Technologies.

Vogliamo ringraziare David Rodriguez per la sua assistenza nella preparazione della figura. I campioni di espettorato sono stati eseguiti sul BD LSR II presso l'UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, supportati da UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) e UL1 TR001120 (sovvenzione CTSA).