Un grande modello animale per l'ipertensione polmonare e l'insufficienza ventricolare destra: legatura dell'arteria polmonare sinistra e bendaggio progressivo dell'arteria polmonare principale nelle pecore

Questo manoscritto descrive la tecnica chirurgica e l'approccio sperimentale per sviluppare un grave sovraccarico di pressione ventricolare destra per modellare i loro fenotipi adattivi e disadattivi.

L'insufficienza ventricolare destra scompensata (RVF) nell'ipertensione polmonare (PH) è fatale, con opzioni di trattamento medico limitate. Lo sviluppo e la sperimentazione di nuove terapie per il PH richiede un modello animale di grandi dimensioni clinicamente rilevante di aumento della resistenza vascolare polmonare e della RVF. Questo manoscritto discute l'ultimo sviluppo del modello PH-RVF ovino precedentemente pubblicato che utilizza la legatura dell'arteria polmonare sinistra (PA) e l'occlusione PA principale. Questo modello di PH-RVF è una piattaforma versatile per controllare non solo la gravità della malattia, ma anche la risposta fenotipica del RV.

Le pecore adulte (60-80 kg) sono state sottoposte a legatura PA (LPA) sinistra, posizionamento del bracciale PA principale e inserimento del monitor di pressione RV. Il bracciale PA e il monitor di pressione RV sono stati collegati alle porte sottocutanee. I soggetti sono stati sottoposti a banding PROGRESSIVO PA due volte a settimana per 9 settimane con misure sequenziali di pressione RV, pressione del bracciale PA e gas ematico venoso misto (_SvO2). All'inizio e all'endpoint di questo modello, la funzione ventricolare e le dimensioni sono state valutate utilizzando l'ecocardiografia. In un gruppo rappresentativo di 12 soggetti animali, la pressione media e sistolica del RV è aumentata da 28 ± 5 e 57 ± 7 mmHg alla settimana 1, rispettivamente, a 44 ± 7 e 93 ± 18 mmHg (deviazione standard media ±) entro la settimana 9. L'ecocardiografia ha dimostrato risultati caratteristici del PH-RVF, in particolare la dilatazione del camper, l'aumento dello spessore della parete e l'incurvamento del setto. L'andamento longitudinale della pressione del bracciale _SvO2 e PA dimostra che il tasso di banding PA può essere titolato per suscitare fenotipi RV variabili. Una strategia di banding PA più veloce ha portato a un calo precipitoso di _SvO2 < 65%, indicando uno scompenso RV, mentre una strategia più lenta e più ritmata ha portato al mantenimento di SvO2 fisiologico al 70% -80%. Un animale che ha sperimentato la strategia accelerata ha sviluppato diversi litri di versamento pleurico e ascite entro la settimana 9. Questo modello ph-RVF cronico fornisce uno strumento prezioso per studiare i meccanismi molecolari, sviluppare biomarcatori diagnostici e consentire l'innovazione terapeutica per gestire l'adattamento e il disadattamento del RV dal PH.

L'insufficienza ventricolare destra scompensata (RV) è la causa predominante di morbilità e mortalità per i pazienti con ipertensione polmonare (PH). Il fallimento del camper è responsabile di oltre il 50% dei ricoveri in pazienti con PH ed è una causa comune di morte in questa popolazione di ^pazienti1,2. Sebbene gli attuali trattamenti medici per il PH possano fornire misure temporizzanti, non invertono la progressione della malattia. Come tale, l'unico trattamento a lungo termine è il trapianto di polmone. Per esplorare e testare nuovi trattamenti e interventi medici per PH e RVF, è necessario un modello animale clinicamente rilevante per ricapitolare la complessa fisiopatologia della malattia. In particolare, vi è una grande necessità clinica di sviluppare terapie mirate al camper per i pazienti con PH per migliorare la funzione del RV. Ad oggi, la maggior parte degli studi pubblicati sugli animali sulla disfunzione di PH e RV si sono basati su piccoli mammiferi come topi e ^ratti3. D'altra parte, ci sono stati solo una manciata di modelli animali di grandi dimensioni per studiare la malattia e la fisiopatologia RV da postcarico anormale4,5,6,7. Inoltre, nessuno dei modelli animali di grandi dimensioni precedentemente pubblicati include descrizioni di procedure sperimentali per la titolazione controllata della gravità della malattia che porta in modo differenziale a fenotipi di fallimento RV compensati rispetto a quelli scompensati. Un modello animale di PH che può essere titolato per indurre insufficienza RV acuta e cronica con vari gradi di compensazione è necessario per studiare i meccanismi della malattia e per sviluppare, testare e tradurre nuove diagnosi e terapie per PH e RVF nella pratica clinica. Un tale modello in un animale di grandi dimensioni è particolarmente prezioso per lo sviluppo di dispositivi di supporto circolatorio ^meccanico8.

Qui, viene presentato un modello PH-RVF cronico di grandi dimensioni che utilizza la legatura dell'arteria polmonare sinistra (PA) e il bendaggio PA principale progressivo nelle pecore ^adulte9,10. La legatura del PA sinistro (LPA) aumenta la resistenza vascolare polmonare e diminuisce la capacità ^pa11,12. L'approccio progressivo di banding PA consente una titolazione precisa della gravità della malattia e dell'adattamento RV. Questa piattaforma può anche essere prontamente utilizzata per l'indagine longitudinale della progressione della malattia verso lo scompenso del RV. Le procedure e i processi necessari per eseguire questo modello sono presentati come una risorsa per gli investigatori interessati a una grande piattaforma animale per sviluppare nuovi trattamenti per PH e RVF.

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Vanderbilt University Medical Center ha approvato il protocollo. Le procedure descritte sono state condotte in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche degli Stati Uniti, 8a edizione. La panoramica e la tempistica della procedura sperimentale sono fornite nella Figura 1. La tabella supplementare 1 descrive il sesso, il peso, la razza, la fonte di ovini e altre informazioni pertinenti che possono essere utili ai fini della riproducibilità.

1. Un giorno prima dell'intervento chirurgico, preparazione dell'animale

1. Trattenere il cibo per 24-40 ore prima della procedura chirurgica per decomprimere il rumine dell'animale.
2. Applicare un cerotto di fentanil da 50 μg/h su un'area tosata sul dorso della pecora 12 ore prima della procedura. Pulire l'area con clorexidina per rimuovere i residui di olio di lanolina prima dell'applicazione del cerotto. Coprire e proteggere il cerotto con una medicazione tubolare elastica.

2. Giorno dell'intervento, fasi pre-operatorie nella sala di preparazione

1. Somministrare tiletamina/zolazepam per via intramuscolare (2,2-5 mg/kg) e somministrare l'1%-3% di isoflurano miscelato con l'80%-100% di ossigeno tramite una maschera facciale per indurre l'anestesia.
2. Posizionare la pecora supina sul tavolo di preparazione e fissare le zampe.
3. Intubare con un tubo endotracheale da 10 mm e avviare la ventilazione meccanica in modalità di controllo del volume (volume di marea, TV = 10 ml / kg, frequenza respiratoria, RR = 15 respiri al minuto).
4. Rasare il campo chirurgico dal collo della pecora alla parte superiore dell'addome, come descritto di seguito.
   1. Rasare il collo anteriore della pecora per esporre la pelle sovrastante le vene giugulari per il cateterismo venoso centrale (vedere passo 3.7).
   2. Radere bilateralmente il torace anterolaterale in preparazione alla toracotomia (vedere fase 4.1).
   3. Radere il lato sinistro del busto dal torace alla schiena (cioè, dorsalmente come il tavolo permetterà con il soggetto in posizione supina), e dal seno al fianco posteriore caudalmente, in preparazione per l'impianto di porte sottocutanee (vedi passaggi 4.12-4.15).
5. Inserire un angiocatetere da 20 G nell'arteria auricolare per il monitoraggio della pressione arteriosa e il prelievo di gas nel sangue.
6. Posizionare un tubo di silicone con un diametro interno di 3/8 "-1/2" per la decompressione ruminale. Il tubo orogastrico rimarrà nel rumine durante l'intera procedura.
7. Trasportare l'animale dalla sala di preparazione pre-operatoria alla suite chirurgica.

3. Giorno dell'intervento chirurgico, fasi pre-operatorie nella suite operatoria

1. Ricollegare le pecore al ventilatore nella suite chirurgica e continuare la ventilazione con la stessa impostazione nel passaggio 2.3 (isoflurano 1%-3%, TV = 10 ml / kg, RR = 15 respiri al minuto)
2. Collegare i sensori di pulsossimetria (_SpO2), pressione arteriosa, temperatura, capnografo di fine marea ed elettrocardiogramma (ECG) al monitor anestetico.
3. Collegare i sensori per i segni vitali all'animale.
   1. Posizionare il pulsossimetro sulla lingua dell'animale.
   2. Posizionare la sonda di temperatura nel retto.
   3. Collegare le sonde a elettrocardiogramma a 3 derivazioni: posizionare il piombo rosso sulla gamba posteriore sinistra, il piombo bianco sulla gamba anteriore destra e il piombo nero sulla gamba anteriore sinistra.
   4. Collegare l'estremità luer maschio del rubinetto a tre vie all'angiocatetere dell'arteria auricolare e collegare l'estremità luer femmina opposta al trasduttore di pressione per il monitoraggio della linea arteriosa utilizzando un tubo di pressione di dimensioni appropriate.
      1. Allineare il trasduttore al livello della tavola operatoria.
      2. Aprire il rubinetto a tre vie sul trasduttore.
      3. Scorrere la manopola principale del monitor vitals per evidenziare il canale della pressione arteriosa, quindi premere la manopola per selezionare il canale.
      4. Selezionate ZERO IBP per azzerare il trasduttore.
   5. Collegare il collegamento luer maschio della linea del monitor capnografico al collegamento luer femmina sul tubo del ventilatore per monitorare la _CO2 di fine marea.
4. Impostare le pompe IV per la somministrazione continua di fluidi e il supporto inotropo o vasopressore.
   1. Perforare il setto sulla sacca salina con il set di somministrazione endovenosa. Assicurarsi che il tubo IV sia bloccato prima di perforare il sacchetto per evitare fuoriuscite.
   2. Allineare e montare il tubo del set di somministrazione IV nella pompa a rulli IV e verificare se la direzione specificata sulla pompa corrisponde alla direzione di somministrazione del fluido.
      NOTA: assicurarsi che il set di somministrazione IV sia compatibile con la pompa IV.
   3. Accendere la pompa e specificare PRIME per rimuovere tutta l'aria nella linea.
5. Posizionare le pecore per la procedura operativa.
   1. Dalla posizione supina, ruotare la pecora in una posizione parziale laterale destra decubito.
   2. Fissare il piede anteriore destro verso il basso e fissare il piede anteriore sinistro mentre lo si ritrae cefalade e laterale con corda o cinghie atraumatiche.
   3. Eseguire l'ecocardiografia transtoracica per la valutazione al basale dell'anatomia e della funzione ventricolare. L'ecografia è utile anche per determinare lo spazio intercostale ottimale che facilita l'accesso chirurgico sia all'arteria polmonare principale che all'arteria polmonare sinistra.
6. Pulire il campo chirurgico privo di sporco e altri contaminanti usando sapone o spazzola scrub. Preparare il collo e il torace con soluzione di clorexidina o betadina e drappeggiare il campo chirurgico in modo sterile.
7. Utilizzando la guida ad ultrasuoni o punti di riferimento anatomici, accedere alla vena giugulare interna sinistra o destra utilizzando un ago del mirino o un angiocato. Utilizzando la tecnica Seldinger, inserire un catetere venoso centrale a 7 lumi francesi nella vena giugulare interna per l'accesso endovenoso e il monitoraggio della pressione venosa centrale.
   1. Utilizzare la porta prossimale per il monitoraggio della pressione e la porta distale per la somministrazione di liquidi e farmaci.
8. Somministrare 20 mg/kg di cefazolina e 5 mg/kg di enrofloxacina per via endovenosa. Ripetere il dosaggio di cefazolin ogni 2-4 ore durante la procedura.
9. Somministrare un bolo da 500 ml di soluzione salina normale per aumentare il precarico prima dell'intervento chirurgico. Iniziare una velocità di mantenimento del fluido per via endovenosa di 15 ml/ kg / h.

4. Procedura operativa

1. Eseguire una mini-toracotomia che risparmia i muscoli (lunghezza < 8 cm) nel quarto spazio intercostale sinistro per ottenere l'esposizione al mediastino. Scegli la mini-toracotomia per accelerare il recupero postoperatorio.
   1. Dopo aver diviso la pelle, dividere il muscolo sottostante (pettorale maggiore) longitudinalmente lungo le sue fibre, che corrono leggermente oblique allo spazio intercostale. Posizionare un riavvolgitore auto-trattenuto per diffondere lo strato muscolare ed esporre la parete toracica.
   2. Dividere il serrato anteriore e il muscolo intercostale sottostante nello spazio intercostale selezionato, avendo cura di rimanere immediatamente cefalad alla costola.
   3. Entra nello spazio pleurico e poi continua a rilasciare completamente i muscoli intercostali posteriormente verso la colonna vertebrale e anteromedialmente verso lo sterno per prevenire fratture involontarie della costola o lussazione allo sterno. Evitare lesioni ai vasi mammari medialmente.
   4. Posizionare i riavvolgitori auto-trattenibili per aprire lo spazio delle costole e il tessuto molle sovrastante. Utilizzare un divaricatore Finochietto piccolo o medio per separare le costole e un divaricatore Tuffier (lama retrattile da 5 cm) per sedersi perpendicolarmente al Finochietto all'interno dello spazio intercostale, che ritrae i tessuti molli all'interno dello spazio intercostale per migliorare l'esposizione.
2. Incidere il pericardio anteriore al nervo frenico senza ferirlo e creare un pozzo pericardico con suture di seta 2-0 per esporre il PA e il RV principali. Identificare l'appendice atriale sinistra all'interno dell'esposizione come punto di riferimento per il livello della biforcazione PA.
   1. Valutare l'esposizione e assicurarsi che sia stato inserito lo spazio intercostale appropriato. Idealmente, il PA prossimale e l'appendice atriale sinistra sono facilmente visibili direttamente sotto l'incisione, suggerendo che lo spazio intercostale ottimale è stato selezionato per fornire esposizione sia al PA principale che all'LPA.
   2. Se l'esposizione è ritenuta inadeguata per raggiungere in sicurezza sia il PA principale che l'LPA, non esitare ad aprire uno spazio intercostale aggiuntivo per compiere tutti i passaggi necessari dell'operazione; tuttavia, questo non sarà necessario con un'appropriata selezione dell'incisione.
3. Sezionare intorno al PA principale e isolarlo con un nastro ombelicale. Garantire un'adeguata dissezione posteriore per l'eventuale posizionamento dell'occlusore e la sonda di flusso PA il più distale possibile sul PA principale.
   1. Posizionare una sonda di flusso sterile in una ciotola d'acqua o soluzione salina sul campo sterile per calibrare il software di acquisizione dati. Consegnare la spina elettrica all'altra estremità a un designato non sterile per collegare la sonda al misuratore.
      1. Fare riferimento ai documenti supplementari per i dettagli sul collegamento e la calibrazione della sonda di flusso e del misuratore PA.
   2. Applicare una generosa quantità di gel ad ultrasuoni sterile nella scanalatura della sonda di flusso PA.
   3. Inserire il rivestimento in silicone nella scanalatura della sonda di flusso PA e applicare uno strato aggiuntivo di gel ad ultrasuoni sul rivestimento.
   4. Posizionare la sonda di flusso PA sul PA e acquisire le letture del flusso PA sul misuratore di portata e sull'interfaccia di acquisizione dati.
      1. Il posizionamento della sonda di flusso PA può causare un'occlusione parziale del PA che può ridurre il precarico ventricolare sinistro e la pressione arteriosa media. Prestare particolare attenzione all'emodinamica durante l'acquisizione del flusso PA.
      2. Controllare sullo schermo del flussometro per assicurarsi che la potenza del segnale di flusso PA sia di 5 bar. Se il misuratore visualizza meno di 5 bar, garantire un contatto adeguato tra la sonda di flusso e il PA principale. Applicare ulteriore gel ad ultrasuoni, se necessario.
4. Completare la dissezione intrapericardica di LPA e circondarla con un nastro ombelicale.
   1. Utilizzare un piccolo bastoncino di spugna o un sottile divaricatore malleabile per la retrazione caudale dell'appendice atriale sinistra.
      NOTA: L'esposizione all'LPA è facilitata dalla retrazione caudale dell'appendice atriale sinistra, dalla retrazione cefalade del PA principale e dalla retrazione laterale del pericardio appena anteriore a dove l'LPA esce dal pericardio.
5. Posizionare un occlusore vascolare in silicone per impieghi gravosi attorno al PA principale (Figura 2A,B, cerchio). La dimensione dell'occlusore può essere regolata in base al diametro del PA; assicurarsi che la vestibilità sia aderente. Utilizzare una sutura di seta 0 su un ago Keith per fissare le estremità dell'occlusore vascolare insieme a un punto U. Una volta fissato attorno al PA principale, far scorrere l'occlusore distalmente lungo il PA principale.
6. Circondare il PA principale prossimale con uno scarico Penrose da 1/2" per facilitare la dissezione e riservare spazio per posizionare una sonda di flusso al successivo intervento chirurgico ri-operatorio. Tagliare lo scarico Penrose per adattarlo liberamente al PA e fissare il Penrose a se stesso con una sutura Prolene 4-0 in esecuzione (Figura 2B).
7. Stabilire una linea di pressione RV per il monitoraggio delle pressioni RV (Figura 2B, freccia bianca).
   1. Selezionare una posizione per la linea di pressione del camper nella parete priva di tratto di deflusso del camper. Posizionare un monofilamento 5-0, sutura a cordone di borsa in polipropilene non assorbibile con pegni che circondano la posizione selezionata e posizionare un laccio vascolare. Prendi le promesse da un guanto chirurgico sterile.
   2. Preparare la linea di pressione del camper: tagliare l'estremità maschile del tubo di pressione sterile da 36 '' con un angolo di 30 ° per facilitare l'inserimento attraverso il miocardio. Utilizzare una cravatta di seta 2-0 per contrassegnare la linea di pressione a una profondità ottimale per il posizionamento all'interno del camper.
   3. Usando un bisturi a 11 lame, fai una piccola cardiotomia nella parete libera di RVOT all'interno della sutura a cordone di borsa precedentemente posizionata. Controllare il sanguinamento con la pressione manuale o stringendo il laccio sulla sutura del cordone della borsa.
      NOTA: Ottenere una biopsia di base della parete libera da camper in questa fase campionando il tessuto RV all'interno della sutura della stringa della borsa. Questo sito di biopsia può quindi fungere da punto di ingresso per la linea di pressione RV.
   4. Inserire e fissare l'estremità tagliata del tubo di pressione nel tratto di deflusso RV (RVOT). Legare il cordone della borsa e quindi fissare il cordone della borsa al tubo di pressione per fissare la linea di pressione.
8. Estendere il tubo RVOT collegando un tubo di pressione aggiuntivo alla linea di pressione RVOT.
9. Consegnare il tubo di pressione aggiuntivo a un designato non sterile per collegare il tubo a un trasduttore di pressione e monitorare la misurazione della pressione RV di base. Impostare il trasduttore di pressione come segue.
   1. Collegare l'estremità luer maschile del set di somministrazione IV all'estremità luer femminile del trasduttore.
   2. Collegare l'estremità luer femmina del tubo di pressione all'estremità luer maschile del trasduttore.
   3. Inserire la somministrazione endovenosa in una sacca salina eparinizzata (2 UI/mL).
   4. Inserire il sacchetto salino in un sacchetto a pressione e pompare il sacchetto a pressione a 250-300 mmHg come indicato sul manometro.
   5. Innescare completamente la linea rilasciando la valvola sul trasduttore, garantendo una corretta de-airing.
   6. Seguire i metodi supplementari per la calibrazione del trasduttore.
10. Dopo aver accuratamente sezionato intorno all'LPA, circondarlo con un nastro ombelicale. Ligate l'LPA legando il nastro ombelicale. Si noti la risposta emodinamica dell'animale alla legatura, se rilevante per lo studio. Aumentare la ventilazione minima per compensare l'aumento della ventilazione dello spazio morto creato dalla legatura dell'LPA. Queste regolazioni del ventilatore mitigano l'acidosi respiratoria.
11. Iniettare lentamente fino a 3 ml di soluzione salina nell'occlusore PA principale per garantire che non vi siano perdite durante il monitoraggio della pressione RV dalla linea di pressione RVOT. Una volta confermata la risposta RV, ritirare la soluzione salina instillata.
12. Portare la linea di pressione RVOT e il tubo dell'occlusore PA fuori dal torace uno spazio intercostale sotto l'incisione toracotomia.
13. Formare due tasche sottodermiche lungo lo strato fasciale sul dorso sinistro della pecora per quanto possibile verso la colonna vertebrale all'interno del campo sterile. Questi servono come siti per le porte interne (Figura 2C).
14. Utilizzando un estrattore di tubi toracici, tunnel la linea di pressione RVOT e tubi occlusi dall'incisione toracica verso i siti della porta del dorso sinistro.
15. Fissare sia il tubo dell'occlusore che la linea di pressione del camper alle connessioni barbe del porto. Ancorare l'occlusore e il tubo di pressione attorno ai connettori della porta con fascette aggiuntive. Utilizzare il raccordo del connettore spinato fornito per proteggere la connessione (Figura 1C). Posizionare le porte all'interno delle tasche sottodermiche preformate.
16. Ancorare le porte in tre posizioni attorno al bordo alla fascia sottostante con suture in polipropilene 3-0 per impedire la migrazione del porto. Riassegnare il tessuto sottocutaneo, il derma e la pelle in strati con suture di poliglattina 910. Riconfermare le letture della pressione attraverso l'accesso percutaneo delle porte. Lavare la porta RVOT con 5 mL (1000 UI/mL, 5000 unità) di eparina sodica.
17. Posizionare un tubo toracico a 16 francesi nella cavità pleurica sinistra attraverso un'incisione separata, fissarlo alla pelle e quindi collegarlo a un'unità di drenaggio del tubo toracico chiuso ad una pressione di -20 cm·_H2O. Posizionare un punto a U slegato attorno al tubo per facilitare la chiusura dopo la rimozione del tubo toracico.
18. Somministrare un blocco del nervo intercostale (0,5-1 mg/kg di bupivacaina) per l'analgesia postoperatoria.
19. Chiudi la toracotomia con figure-of-eight, #2 poliglactin 910 suture. Chiudere lo strato muscolare pettorale con running #0 polyglactin 910. Chiudere il tessuto sottocutaneo in strati di suture di poliglactina 910 #2-0 in esecuzione e pinzare la pelle.
20. Riposizionare l'animale alla reclinazione dorsale, rimuovere il tubo orogastrico e quindi interrompere l'isoflurano.
21. Continuare la ventilazione meccanica e le cure di supporto fino a quando il pH del sangue arterioso > 7,35 e il _pCO2 < 55 mmHg.
22. Estubare una volta che l'animale respira spontaneamente, sollevando la testa e masticando il tubo endotracheale. Rimuovere il tubo toracico prima del recupero anestetico completo. Legare il punto a U per chiudere l'incisione del tubo toracico.
23. Trasferire l'animale nella sua gabbia mentre si monitora il recupero dell'anestesia. Assicurarsi che l'ossigeno supplementare (3-5 L / min con maschera facciale) sia disponibile in ogni momento mentre le pecore rimangono immobili. Monitorare i segni vitali ogni ora per le prime 4 ore, ogni 8 ore per le successive 24 ore e una volta al giorno dopo.

5. Recupero postoperatorio

1. Monitorare quotidianamente i siti di toracotomia e impianto delle porte per rilevare eventuali segni di infezione. Somministrare antibiotici a lunga durata d'azione (ceftiofur, 5 mg/kg per via intramuscolare) entro 24 ore dalla procedura e ogni 3-4 giorni dopo quella per 1 settimana.
2. Continuare il cerotto di fentanil postoperatoriamente per un totale di 72 ore. Successivamente, fornire ulteriore analgesia (ad esempio, meloxicam, 1 mg / kg una volta al giorno per via intramuscolare) se l'animale continua a mostrare segni di dolore (ad esempio, digrignamento dei denti, frequenza cardiaca elevata).
3. Rimuovere le suture esterne e le graffette cutanee 10-14 giorni dopo l'intervento chirurgico o come raccomandato dal personale veterinario.
4. Garantire la protezione del sito portuale dall'animale che sfrega o raschia i siti portuali contro le strutture circostanti utilizzando una medicazione tubolare (Figura 2D).

6. Bendaggio PA cronico (9 - 10 settimane)

1. Trasferisci le pecore in un piccolo recinto. Tagliare la lana in eccesso attorno alle porte impiantate.
2. Pulire le aree rasate con alcool isopropilico al 70%. Applicare spray topico alla lidocaina per anestetico locale.
3. Preparare due trasduttori di pressione per il monitoraggio delle pressioni dei polsini RV e occlusori (Figura 3A).
   1. Per entrambi i trasduttori: collegare l'estremità luer femmina del tubo a pressione (36 in o più) all'estremità luer maschio del trasduttore. Collegare l'estremità luer maschio del tubo di pressione a una delle connessioni luer femmina su un rubinetto a tre vie. Infine, collega un ago Huber da 22 G all'estremità luer maschio di quel rubinetto a tre vie.
   2. Per il trasduttore di pressione per camper: appendere un sacchetto salino eparinizzato (2 UI/mL), forare il sacchetto con il set di somministrazione IV e collegare la connessione luer maschio del set di somministrazione IV alla connessione luer femmina del trasduttore di pressione RV. Quindi, pressurizzare il sacchetto salino (ad esempio, sacchetto a pressione).
   3. Per il trasduttore dell'occlusore: innescare completamente il trasduttore e il tubo di pressione. Mettere un cappuccio luer maschio sull'estremità luer femmina del trasduttore di pressione per evitare che il fluido del bracciale fuoriesca verso il trasduttore.
   4. Collegare entrambi i trasduttori all'hardware di acquisizione dati utilizzando un cavo o un adattatore appropriato.
4. Calibrare i trasduttori come specificato nel file supplementare 1.
5. Fare clic su Start in alto a destra della finestra del software per avviare la registrazione del software di acquisizione dati per acquisire forme d'onda di pressione del bracciale RV e PA a 400 Hz.
6. Chiedi a un assistente di fornire una leggera moderazione dell'animale prima dell'accesso al porto. Inserire l'ago Huber dal trasduttore di pressione RV alla porta RV. Attaccare una siringa da 10 mL al rubinetto a tre vie e tentare di aspirare il sangue nella siringa dalla porta RV (Figura 3B).
   1. Se è difficile tirare indietro la siringa, prima iniettare 5-10 ml di soluzione salina nella porta RV per rimuovere la fonte di occlusione.
   2. Se l'intasamento persiste, instillare 2 mg di attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) nella porta come agente fibrinolitico e lasciarlo durante la notte. Controllare il giorno seguente per aspirare il tPA.
7. Una volta stabilita la linea di pressione del camper, collegare l'ago Huber dal trasduttore del bracciale PA.
8. Acquisire i valori iniziali delle pressioni dei polsini RV e PA (Figura 3C). Nota eventuali cambiamenti drastici rispetto alle letture precedenti.
   1. Se la pressione del bracciale PA e / o del camper è scesa sostanzialmente rispetto alla lettura precedente, potrebbe essere un segno che il bracciale PA sta perdendo.
   2. Osserva un altro segno evidente di perdita del bracciale PA studiando la forma d'onda del bracciale PA. Se la pressione media del bracciale PA scende a una velocità distinguibile, allora c'è un'alta probabilità che il bracciale stia perdendo.
      NOTA: controllare nuovamente che tutte le connessioni luer sul trasduttore di pressione, sul tubo e sul rubinetto di arresto siano serrate. Il contenuto di fluido altamente pressurizzato dal bracciale PA può fluire indietro e fuoriuscire da connessioni luer allentate.
      1. Se il bracciale PA perde, determinare l'entità della perdita. Se il tasso di perdita è lento, una strategia di banding più frequente può superare la perdita per rendere il modello di malattia ancora efficace.
9. Iniettare lentamente il 3% di soluzione salina ipertonica nella porta dell'occlusore prestando attenzione alle pressioni del camper e del bracciale.
   1. Regolare la quantità di iniezione in base alla gravità della malattia PH desiderata e al fenotipo RV. Un aumento settimanale della pressione del bracciale di 100-150 mmHg è un obiettivo ragionevole per sviluppare un fenotipo RV compensativo adattivo.
   2. Aumenti più rapidi della pressione del bracciale (>250 mmHg a settimana) produrranno probabilmente un fenotipo RV scompensante.
10. Una volta che il bracciale PA è gonfiato alla quantità desiderata, rimuovere l'ago Huber dalla porta del bracciale.
11. Ottenere un campione di sangue dalla porta RV.
    1. Aspirare 10 ml di sangue dalla porta del camper in modo sterile e mettere da parte.
    2. Posizionare una nuova siringa al posto della siringa di aspirazione e aspirare tutto il sangue necessario senza superare il limite settimanale di prelievo di sangue del 7,5% del volume totale del sangue.
    3. Ricollegare la siringa originale con sangue aspirato e restituirla attraverso la porta RV.
    4. Tirare la leva della valvola del trasduttore di pressione per lavare la soluzione salina eparinizzata dal sacchetto salino nella porta RV. Continuare a lavare fino a quando l'intera linea diventa chiara e incolore.
12. Lavare la porta RV con 10 ml di soluzione salina. Quindi, lavare ulteriormente la porta con 5 mL di 1000 U / mL di eparina sodica.
13. Ripetere i passaggi 6.1-6.12 ogni 1-4 giorni per 9-10 settimane.

Un gruppo rappresentativo di 12 pecore viene utilizzato per mostrare l'efficacia di questo modello per lo sviluppo di vari gradi di PH-RVF. Tra queste pecore, la pressione media del bracciale PA è aumentata da 32 ± 20 mmHg alla settimana 1 a 1002 ± 429 mmHg alla settimana 9. Ciò ha comportato un aumento della media RV e delle pressioni sistoliche da 28 ± 5 e 57 ± 7 mmHg alla settimana 1, rispettivamente, a 44 ± 7 e 93 ± 18 mmHg entro la settimana 9. Inoltre, il profilo di pressione del bracciale PA è stato sovrapposto alla saturazione mista di ossigeno venoso (_SvO2) per dimostrare l'efficacia del modello nel mettere a punto il fenotipo della malattia (Figura 4). In particolare, un banding PA più veloce ha portato a un declino più rapido di _SvO2. In confronto, quelli che hanno sperimentato una strategia di banding PA più graduale hanno mantenuto un intervallo fisiologico di _SvO2 tra il 70% e l'80%. Un ecocardiogramma transtoracico rappresentativo acquisito dopo 9 settimane di banding PROGRESSIVO PA mostra dilatazione RV e inchino del setto a causa del sovraccarico di pressione (Video supplementare 1). In un case report pubblicato in ^precedenza10, il modello può anche essere utilizzato per indurre il fallimento del RV allo stadio terminale, che porta a versamenti pleurici e ascite addominale.

Figura 1: Panoramica e tempistica per l'esperimento complessivo. (A) Sequenza temporale sperimentale per il modello di insufficienza ventricolare destra (RVF) dell'ipertensione polmonare cronica (PH) e la strategia di acquisizione dati suggerita. (B) Il diagramma schematico per il primo intervento chirurgico di sopravvivenza per stabilire le basi per il modello di insufficienza ventricolare destra (RVF) dell'ipertensione polmonare cronica (PH). Viene impiantato l'occlusore principale dell'arteria polmonare (PA), l'arteria polmonare sinistra (LPA) viene legata e un tubo di pressione viene posizionato nel tratto di efflusso ventricolare destro (RVOT). Infine, entrambe le linee di pressione del bracciale RVOT e PA sono collegate alle rispettive porte, entrambe impiantate per via sottocutanea per l'accesso e il monitoraggio ricorrenti. (C) Fotografia del bracciale PA, della porta sottocutanea e del raccordo in plastica per proteggere la loro connessione spinata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fotografie dei passaggi chirurgici chiave per stabilire il modello di ipertensione polmonare ovina (PH). (A) Isolamento dell'arteria polmonare principale (PA) e impianto del bracciale PA (cerchio). (B) Bracciale PA impiantato (cerchio), tubo Penrose (stella) e tubo di pressione del tratto di deflusso ventricolare destro (RVOT) (triangolo bianco). (C) Impianto sottocutaneo di porte per RVOT e bracciale PA. D) Medicazione tubolare e imbottitura in schiuma montate attorno al corpo delle pecore per proteggere le porte impiantate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Approccio sperimentale per il bendaggio dell'arteria polmonare cronica (PA). (A) Schema per l'impostazione di trasduttori di pressione per misurare e regolare i valori di pressione del ventricolo destro (RV) e pa. (B) Rappresentazione fotografica dell'accesso al tratto di deflusso RV (RVOT) e alle porte del bracciale PA. (C) Tracciamento rappresentativo della pressione delle pressioni dei polsini RV e PA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Pressione del bracciale dell'arteria polmonare (PA) e corrispondente saturazione mista di ossigeno venoso (_SvO2). Le tendenze longitudinali tra la pressione del bracciale dell'arteria polmonare (PA) e la corrispondente saturazione mista di ossigeno venoso (_SvO2) mostrano una differenziazione nel fenotipo ventricolare destro in base alla strategia di banding PA. Il profilo colore varia considerevolmente tra i soggetti che hanno sperimentato una strategia di banding PA più rapida rispetto ai soggetti che hanno subito una strategia di banding più graduale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare 1: Ecocardiogrammi transtoracici rappresentativi tra lo stato basale sano e dopo il modello di malattia da insufficienza ventricolare destra dell'ipertensione polmonare (PH-RVF). Il modello PH-RVF ricapitola le caratteristiche chiave della malattia, tra cui la dilatazione e l'ipertrofia del camper e l'inchino del setto. Clicca qui per scaricare questo video.

File 1 supplementare: Impostazione dell'acquisizione dati e fasi di calibrazione. Fare clic qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Informazioni rilevanti sull'argomento animale per questa piattaforma.

Tabella supplementare 2: Complicanze durante il modello di ipertensione polmonare della pecora.

Il modello PH-RVF presentato può indurre in modo affidabile diversi livelli di gravità della malattia per soddisfare gli obiettivi dell'indagine. Due diversi approcci sono utilizzati in combinazione per indurre questo modello di malattia. In primo luogo, la legatura LPA serve ad aumentare la resistenza vascolare polmonare e diminuire la capacità ^PA11,12, stabilendo così il punto di partenza del modello cronico in uno stato di postcarico RV già aumentato. Quindi, l'impianto del bracciale PA e il suo progressivo gonfiaggio servono a sviluppare un fenotipo mirato di PH-RVF. Il controllo della pressione del bracciale PA e del suo tasso di variazione può creare in modo differenziale RV compensatori o scompensanti, dimostrati dal mantenimento o dal declino di _SvO2 (Figura 4). Aumentando la pressione del bracciale di 250-300 mmHg a settimana, le pecore inizieranno a mostrare i primi segni di scompenso intorno alle 5-6 settimane. L'aumento della pressione del bracciale di 100-150 mmHg a settimana, d'altra parte, consente un profilo più adattivo per l'intera durata di 9 settimane.

Pochi modelli animali di grandi dimensioni di PH cronico e RVF esistono in letteratura. L'embolizzazione dell'arteria polmonare nelle pecore è stata ampiamente riportata e ^discussa4,5. Tuttavia, questo approccio ha un alto tasso di mortalità, verso l'alto dell'86%⁴ a seconda della frequenza di dosaggio e delle dimensioni delle perline, ma produce solo un cambiamento marginale nell'emodinamica e nella funzione del camper. D'altra parte, il modello presentato può indurre una gamma molto più ampia di sovraccarico di pressione del camper con morti minime proceduralmente correlate. Un animale morto a causa di questo modello PH-RVF ha sviluppato diversi litri di versamento pleurico e ^ascite10, in correlazione con i risultati clinici e di ricerca dell'insufficienza cardiaca destra negli esseri umani13,14,15 e negli animali di grandi ^dimensioni16. Questi segni sono stati osservati senza alcuna evidenza di insufficienza cardiaca sinistra. Questo modello può quindi servire come una piattaforma animale di grandi dimensioni clinicamente traducibile con la capacità di produrre fisiopatologia titolabile.

Ci sono diverse sfide notevoli per l'esecuzione di questo modello. In primo luogo, mentre l'utilizzo di una mini-toracotomia sinistra facilita il recupero postoperatorio opportuno, l'esposizione chirurgica simultanea sia della PA principale che dell'LPA è tecnicamente impegnativa attraverso questa incisione minimamente invasiva. La selezione dello spazio intercostale ottimale è essenziale e l'ecografia può essere una guida utile. La biforcazione PA è più distale e posteriore rispetto all'anatomia umana, rendendo la legatura dell'LPA il passo più impegnativo di questa procedura. Mentre la legatura funge da passo critico per aumentare la resistenza vascolare polmonare e diminuire la capacità PA, è possibile che la banda PA principale da sola possa raggiungere una pressione RV sufficientemente elevata.

L'infezione delle porte interne e la deiscenza delle ferite del sito portuale possono essere difficili da affrontare e portare a complicazioni devastanti. In questo modello di ipertensione polmonare, le infezioni potrebbero essere l'insulto metabolico acuto che innesca la compromissione cardiopolmonare, il collasso e la mortalità precoce. Standard elevati per la tecnica sterile, la chiusura meticolosa della pelle e la protezione del sito portuale limitano significativamente l'incidenza e l'impatto di questi eventi.

La rottura del bracciale è un problema specifico con il modello che potrebbe portare a una diminuzione della pressione del camper. Anche se raro, questo problema è stato osservato in precedenza. Esistono alcuni passaggi preventivi e correttivi per questo problema. In primo luogo, è necessario prestare attenzione per evitare di forare il bracciale mentre lo si fissa intorno al PA con la sutura. Testare il bracciale prima di chiudere il torace ne garantisce l'integrità al termine dell'operazione iniziale. Successivamente, la dimensione del bracciale PA deve essere scelta in base alla dimensione principale del diametro PA. Se il bracciale perde, sarà importante valutare l'entità della perdita. Se l'inflazione più frequente della banda PA può superare il tasso di perdita, il modello può ancora raggiungere un PH-RVF moderato, sebbene non possa più indurre la gravità desiderata di PH-RVF.

Nella nostra esperienza, questo modello ha un tasso di successo complessivo del 78% (Tabella supplementare 2), ma la maggior parte delle complicanze sono state nella prima metà di questi studi. La coorte più recente di 13 soggetti ha avuto un tasso di successo del 100%, il che suggerisce che questo modello può essere riproducibile e privo di complicazioni con sufficiente esperienza.

Infine, un limite scientifico chiave del modello animale presentato è che non trasmette una caratteristica chiave dell'ipertensione arteriosa polmonare, vale a dire il rimodellamento vascolare polmonare. Quindi, questo modello non è la piattaforma ideale per sviluppare e testare terapie focalizzate esclusivamente sulla vascolarizzazione polmonare. Invece, è una piattaforma efficace per studiare la disfunzione del camper e il fallimento da postcarico anormale del camper. Gli esiti dei pazienti nel PH sono in gran parte guidati dalla funzione RV e gli esiti favorevoli sono associati alla conservazione di questa funzione ^RV17. Sebbene questo modello non catturi tutti gli aspetti del PH, è un modello prezioso per comprendere i percorsi molecolari che portano alla RVF e sviluppare terapie mirate al camper per migliorare la RVF.

La legatura LPA e il principale modello di banding incrementale della PA possono ricapitolare con successo la complessa fisiopatologia della RVF secondaria al PH. Questo modello fornirà ai ricercatori una piattaforma sperimentale per sviluppare nuovi biomarcatori diagnostici che distinguono tra risposte adattive e disadattive al PH sul RV, chiariscono i percorsi di risposta critica nella RVF e consentono innovazioni terapeutiche per il trattamento della RVF.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health R01HL140231. Ringraziamo la Divisione di Animal Care per la loro zootecnia e cure veterinarie. Ringraziamo l'SR Light Laboratory e il suo staff, Jamie Adcock, Susan Fultz, Codi VanRooyen e José Diaz, per il loro supporto tecnico dedicato con grandi interventi chirurgici sugli animali.