Un modelo animal grande para la hipertensión pulmonar y la insuficiencia ventricular derecha: ligadura de la arteria pulmonar izquierda y bandas progresivas de la arteria pulmonar principal en ovejas

Este manuscrito describe la técnica quirúrgica y el enfoque experimental para desarrollar una sobrecarga severa de presión ventricular derecha para modelar sus fenotipos adaptativos y desadaptativos.

La insuficiencia ventricular derecha (FVR) descompensada en la hipertensión pulmonar (HP) es fatal, con opciones de tratamiento médico limitadas. El desarrollo y la prueba de nuevas terapias para la HP requieren un modelo animal grande clínicamente relevante de aumento de la resistencia vascular pulmonar y la FVR. Este manuscrito discute el último desarrollo del modelo ovino PH-RVF previamente publicado que utiliza la ligadura de la arteria pulmonar izquierda (AP) y la oclusión principal de PA. Este modelo de PH-RVF es una plataforma versátil para controlar no solo la gravedad de la enfermedad, sino también la respuesta fenotípica del RV.

Las ovejas adultas (60-80 kg) se sometieron a ligadura de PA izquierda (LPA), colocación del manguito de PA principal e inserción de monitor de presión de RV. El manguito de PA y el monitor de presión RV se conectaron a puertos subcutáneos. Los sujetos se sometieron a bandas progresivas de AF dos veces por semana durante 9 semanas con medidas secuenciales de presión de RV, presiones del manguito de PA y gaso sanguíneo venoso mixto (_SvO2). Al inicio y al punto final de este modelo, la función ventricular y las dimensiones se evaluaron mediante ecocardiografía. En un grupo representativo de 12 sujetos animales, la media de RV y la presión sistólica aumentaron de 28 ± 5 y 57 ± 7 mmHg en la semana 1, respectivamente, a 44 ± 7 y 93 ± 18 mmHg (desviación media ± estándar) en la semana 9. La ecocardiografía demostró hallazgos característicos de PH-RVF, notablemente dilatación de RV, aumento del grosor de la pared y inclinación septal. La tendencia longitudinal de la presión del manguito _svO2 y PA demuestra que la tasa de bandas PA se puede ajustar para provocar fenotipos de RV variables. Una estrategia de anillamiento de PA más rápida condujo a una disminución precipitada en _svO2 < 65%, lo que indica la descompensación de RV, mientras que una estrategia más lenta y de ritmo condujo al mantenimiento de SvO2 fisiológico en 70% -80%. Un animal que experimentó la estrategia acelerada desarrolló varios litros de derrame pleural y ascitis en la semana 9. Este modelo de PH-RVF crónico proporciona una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos moleculares, desarrollar biomarcadores de diagnóstico y permitir la innovación terapéutica para gestionar la adaptación y la inadaptación de RV a partir de PH.

La insuficiencia ventricular derecha (RV) descompensada es la causa predominante de morbilidad y mortalidad en pacientes con hipertensión pulmonar (HP). El fracaso de rv es responsable de más del 50% de las hospitalizaciones en pacientes con HP y es una causa común de muerte en esta población de ^pacientes1,2. Aunque los tratamientos médicos actuales para la HP pueden proporcionar medidas de temporización, no revierten la progresión de la enfermedad. Como tal, el único tratamiento a largo plazo es el trasplante de pulmón. Para explorar y probar nuevos tratamientos e intervenciones médicas para la HP y la FVR, se necesita un modelo animal clínicamente relevante para recapitular la compleja fisiopatología de la enfermedad. En particular, existe una gran necesidad clínica de desarrollar terapias dirigidas a RV para pacientes con HP para mejorar la función de RV. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios en animales publicados sobre la disfunción de PH y RV se han basado en pequeños mamíferos como ratones y ^ratas3. Por otro lado, solo ha habido un puñado de modelos animales grandes para estudiar la enfermedad y la fisiopatología de RV a partir de la poscarga anormal4,5,6,7. Además, ninguno de los modelos animales grandes publicados anteriormente incluye descripciones de procedimientos experimentales para la titulación controlada de la gravedad de la enfermedad que conduce diferencialmente a fenotipos de falla de RV compensados versus descompensados. Se necesita un modelo animal de HP que se pueda ajustar para inducir la insuficiencia aguda y crónica de RV con diversos grados de compensación para estudiar los mecanismos de la enfermedad y desarrollar, probar y traducir nuevos diagnósticos y terapias para PH y RVF en la práctica clínica. Tal modelo en un animal grande es especialmente valioso para el desarrollo de dispositivos mecánicos de soporte ^{circulatorio8}.

Aquí se presenta un modelo crónico de PH-RVF en animales grandes que utiliza ligadura de la arteria pulmonar izquierda (AF) y bandas de AF principal progresiva en ovejas ^adultas9,10. La ligadura de la AF izquierda (LPA) aumenta la resistencia vascular pulmonar y disminuye la capacitancia de la ^AF11,12. El enfoque progresivo de bandas pa permite una titulación precisa de la gravedad de la enfermedad y la adaptación a RV. Esta plataforma también se puede utilizar fácilmente para la investigación longitudinal de la progresión de la enfermedad hacia la descompensación de RV. Los procedimientos y procesos necesarios para ejecutar este modelo se presentan como un recurso para los investigadores interesados en una plataforma de animales grandes para desarrollar nuevos tratamientos para ph y RVF.

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt aprobó el protocolo. Los procedimientos descritos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de los Estados Unidos para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, 8ª edición. La visión general y el cronograma del procedimiento experimental se proporcionan en la Figura 1. La Tabla suplementaria 1 describe el sexo, el peso, la raza, la fuente de las ovejas y otra información relevante que puede ser útil para fines de reproducibilidad.

1. Un día antes de la cirugía, preparación del animal

1. Retenga los alimentos durante 24-40 h antes del procedimiento quirúrgico para descomprimir el rumen del animal.
2. Aplique un parche de fentanilo de 50 μg / h en un área esquilada en el dorso de la oveja 12 h antes del procedimiento. Limpie el área con clorhexidina para eliminar los residuos de aceite de lanolina antes de la aplicación del parche. Cubra y proteja el parche con un apósito tubular elástico.

2. Día de la cirugía, pasos preoperatorios en la sala de preparación

1. Administrar tiletamine/zolazepam por vía intramuscular (2,2-5 mg/kg) y administrar 1%-3% de isoflurano mezclado con 80%-100% de oxígeno a través de una mascarilla para inducir la anestesia.
2. Coloque la oveja en decúbito supino en la mesa de preparación y asegure sus patas.
3. Intubar con un tubo endotraqueal de 10 mm e iniciar ventilación mecánica en modo de control de volumen (volumen corriente, TV = 10 ml/kg, frecuencia respiratoria, RR = 15 respiraciones por minuto).
4. Afeitar el campo quirúrgico desde el cuello de la oveja hasta la parte superior del abdomen, como se detalla a continuación.
   1. Afeitar el cuello anterior de la oveja para exponer la piel que recubre las venas yugulares para el cateterismo venoso central (ver paso 3.7).
   2. Afeitarse el tórax anterolateral bilateralmente en preparación para la toracotomía (ver paso 4.1).
   3. Afeitar el lado izquierdo del torso desde el pecho hasta la espalda (es decir, tan dorsalmente como la mesa lo permita con el sujeto en posición supina), y desde el pecho hasta el flanco posterior caudalmente, en preparación para la implantación de puertos subcutáneos (ver pasos 4.12-4.15).
5. Inserte un angiocatéter de 20 G en la arteria auricular para el monitoreo de la presión arterial y el muestreo de gases en sangre.
6. Coloque un tubo de silicona con un diámetro interior de 3/8 "-1/2" para la descompresión ruminal. El tubo orogástrico permanecerá en el rumen durante todo el procedimiento.
7. Transporte al animal desde la sala de preparación preoperatoria hasta la sala quirúrgica.

3. Día de la cirugía, pasos preoperatorios en el quirófano

1. Vuelva a conectar las ovejas al ventilador en la sala quirúrgica y continúe la ventilación en el mismo ajuste en el paso 2.3 (isoflurano 1% -3%, TV = 10 ml / kg, RR = 15 respiraciones por minuto)
2. Conecte la oximetría de pulso (_SpO2), la presión arterial, la temperatura, el capnógrafo de marea final y los sensores de electrocardiograma (ECG) al monitor anestésico.
3. Conecte los sensores de signos vitales al animal.
   1. Coloque el oxímetro de pulso en la lengua del animal.
   2. Coloque la sonda de temperatura en el recto.
   3. Conecte sondas de electrocardiograma de 3 derivaciones: Coloque la correa roja en la pierna trasera izquierda, la correa blanca en la pierna delantera derecha y la correa negra en la pierna anterior izquierda.
   4. Conecte el extremo luer macho de la llave de paso de tres vías al angiocatéter de la arteria auricular y conecte el extremo opuesto del luer hembra al transductor de presión para el monitoreo de la línea arterial utilizando un tubo de presión del tamaño adecuado.
      1. Alinee el transductor al nivel de la mesa de operaciones.
      2. Abra la llave de paso de tres vías en el transductor.
      3. Desplácese por la perilla principal del monitor de signos vitales para resaltar el canal de presión arterial y luego presione la perilla para seleccionar el canal.
      4. Seleccione CERO IBP para poner a cero el transductor.
   5. Conecte la conexión luer macho de la línea del monitor de capnografía a la conexión luer hembra en el tubo del ventilador para monitorear el _CO2 de marea final.
4. Configure las bombas intravenosas para la administración continua de líquidos y el soporte inotrópico o vasopresor.
   1. Perfore el tabique en la bolsa salina con el juego de administración IV. Asegúrese de que el tubo intravenoso esté sujeto antes de perforar la bolsa para evitar derrames.
   2. Alinee y ajuste el tubo del conjunto de administración IV en la bomba de rodillo IV y verifique si la dirección especificada en la bomba coincide con la dirección de administración del fluido.
      NOTA: Asegúrese de que el conjunto de administración IV es compatible con la bomba IV.
   3. Encienda la bomba y especifique PRIME para eliminar todo el aire de la línea.
5. Coloque las ovejas para el procedimiento operativo.
   1. Desde la posición supina, gire las ovejas a una posición de decúbito lateral derecho parcial.
   2. Asegure el pie delantero derecho hacia abajo y asegure el pie delantero izquierdo mientras lo retrae cefalada y lateral con cuerda o correas atraumáticas.
   3. Realizar ecocardiografía transtorácica para la evaluación basal de la anatomía y función ventricular. La ecografía también es útil para determinar el espacio intercostal óptimo que facilita el acceso quirúrgico tanto a la arteria pulmonar principal como a la arteria pulmonar izquierda.
6. Limpie el campo quirúrgico libre de suciedad y otros contaminantes con jabón o cepillo exfoliante. Prepare el cuello y el pecho con solución de clorhexidina o betadina y cubra el campo quirúrgico de manera estéril.
7. Usando guía de ultrasonido o puntos de referencia anatómicos, acceda a la vena yugular interna izquierda o derecha usando una aguja de búsqueda o angiocath. Usando la técnica de Seldinger, inserte un catéter venoso central de triple lumen de 7 franceses en la vena yugular interna para el acceso intravenoso y el monitoreo de la presión venosa central.
   1. Utilice el puerto proximal para la monitorización de la presión y el puerto distal para la administración de líquidos y fármacos.
8. Administrar 20 mg/kg de cefazolina y 5 mg/kg de enrofloxacina por vía intravenosa. Repita la dosificación de cefazolina cada 2-4 h durante el procedimiento.
9. Administre un bolo de 500 ml de solución salina normal para aumentar la precarga antes de la cirugía. Comience una tasa de líquido intravenoso de mantenimiento de 15 ml / kg / h.

4. Procedimiento operativo

1. Realizar una minitoracotomía con preservación muscular (longitud < 8 cm) en el cuarto espacio intercostal izquierdo para obtener exposición mediastínica. Elija la minitoracotomía para acelerar la recuperación postoperatoria.
   1. Después de dividir la piel, divida el músculo subyacente (pectoral mayor) longitudinalmente a lo largo de sus fibras, que corren ligeramente oblicuas al espacio intercostal. Coloque un retractor autocontenido para extender la capa muscular y exponer la pared torácica.
   2. Divida el serrato anterior y el músculo intercostal subyacente en el espacio intercostal seleccionado, teniendo cuidado de permanecer inmediatamente cefalado a la costilla.
   3. Ingrese al espacio pleural y luego continúe liberando completamente los músculos intercostales posteriormente hacia la columna vertebral y anteromedialmente hacia el esternón para evitar la fractura o dislocación inadvertida de la costilla en el esternón. Evite lesiones en los vasos mamarios medialmente.
   4. Coloque los retractores autocontenetivos para abrir el espacio de las costillas y el tejido blando suprayacente. Use un retractor Finochietto pequeño o mediano para separar las costillas y un retractor Tuffier (hoja retractora de 5 cm) para sentarse perpendicular al Finochietto dentro del espacio intercostal, que retrae el tejido blando dentro del espacio intercostal para mejorar la exposición.
2. Incise el pericardio anterior al nervio frénico sin lesionarlo y cree un pozo pericárdico con suturas de seda 2-0 para exponer el PA principal y RV. Identifique el apéndice auricular izquierdo dentro de la exposición como un punto de referencia para el nivel de la bifurcación PA.
   1. Evalúe la exposición y asegúrese de que se ha introducido el espacio intercostal adecuado. Idealmente, la AF proximal y el apéndice auricular izquierdo son fácilmente visibles directamente debajo de la incisión, lo que sugiere que se ha seleccionado el espacio intercostal óptimo para proporcionar exposición tanto a la AF principal como a la LPA.
   2. Si la exposición se considera inadecuada para llegar de forma segura tanto al PA principal como al LPA, no dude en abrir un espacio intercostal adicional para realizar todos los pasos necesarios de la operación; sin embargo, esto no será necesario con la selección adecuada de la incisión.
3. Diseccionar alrededor de la AP principal y aislarla con una cinta umbilical. Asegurar una disección posterior adecuada para la eventual colocación del oclusor y la sonda de flujo de PA lo más distal posible en la PA principal.
   1. Coloque una sonda de flujo estéril en un recipiente con agua o solución salina en el campo estéril para calibrar el software de adquisición de datos. Entregue el enchufe eléctrico en el otro extremo a una persona designada no estéril para conectar la sonda al medidor.
      1. Consulte los documentos complementarios para obtener detalles sobre la conexión y calibración de la sonda de flujo de PA y el medidor.
   2. Aplique una cantidad generosa de gel de ultrasonido estéril en la ranura de la sonda de flujo pa.
   3. Coloque el revestimiento de silicona en la ranura de la sonda de flujo PA y aplique una capa adicional de gel de ultrasonido en el revestimiento.
   4. Coloque la sonda de flujo de PA en el PA y adquiera lecturas de flujo de PA en el medidor de flujo y la interfaz de adquisición de datos.
      1. La colocación de la sonda de flujo de PA puede causar oclusión parcial de la AP que puede disminuir la precarga del ventrículo izquierdo y la presión arterial media. Preste mucha atención a la hemodinámica durante la adquisición del flujo de PA.
      2. Compruebe en la pantalla del medidor de flujo para asegurarse de que la intensidad de la señal de flujo pa es de 5 bares. Si el medidor muestra menos de 5 bares, asegúrese de un contacto adecuado entre la sonda de flujo y la megafonía principal. Aplique gel de ultrasonido adicional si es necesario.
4. Completa la disección intraperiocárdica de LPA y rodearla con una cinta umbilical.
   1. Use un pequeño palo de esponja o un retractor maleable delgado para la retracción caudal del apéndice auricular izquierdo.
      NOTA: La exposición al LPA se ve facilitada por la retracción caudal del apéndice auricular izquierdo, la retracción cefálica de la AP principal y la retracción lateral del pericardio justo antes de donde el LPA sale del pericardio.
5. Coloque un oclusor vascular de silicona de alta resistencia alrededor de la AP principal (Figura 2A, B, círculo). El tamaño del oclusor se puede ajustar en función del diámetro de PA; asegúrese de que el ajuste sea ajustado. Use una sutura de seda 0 en una aguja Keith para asegurar los extremos del oclusor vascular junto con una puntada en U. Una vez asegurado alrededor del PA principal, deslice el oclusor distalmente a lo largo del PA principal.
6. Rodear la AP principal proximal con un drenaje de Penrose de 1/2" para facilitar la disección y reservar espacio para colocar una sonda de flujo en la cirugía reoperatoria posterior. Recorte el desagüe de Penrose para que quepa holgadamente alrededor del PA y asegure el Penrose a sí mismo con una sutura de Prolene 4-0 (Figura 2B).
7. Establezca una línea de presión de RV para monitorear las presiones de RV (Figura 2B, flecha blanca).
   1. Seleccione una ubicación para la línea de presión de RV en la pared sin tracto de salida de RV. Coloque una sutura de cuerda de monedero de polipropileno no absorbible de 5-0 monofilamento con prendas que rodean la ubicación seleccionada y coloque una trampa vascular. Haga las promesas con un guante quirúrgico estéril.
   2. Prepare la línea de presión RV: corte el extremo masculino del tubo de presión estéril de 36 '' en un ángulo de 30 ° para facilitar la inserción a través del miocardio. Use una corbata de seda 2-0 para marcar la línea de presión a una profundidad óptima para su colocación dentro del RV.
   3. Usando un bisturí de 11 cuchillas, haga una pequeña cardiotomía en la pared libre de RVOT dentro de la sutura de cuerda de bolso colocada previamente. Controle el sangrado con presión manual o apretando la trampa en la sutura de la cuerda del bolso.
      NOTA: Obtenga una biopsia basal de la pared libre de RV en este paso mediante el muestreo de tejido de RV dentro de la sutura de cuerda de bolsa. Este sitio de biopsia puede servir como punto de entrada para la línea de presión de RV.
   4. Inserte y asegure el extremo de corte del tubo de presión en el tracto de salida de RV (RVOT). Ate la cuerda del bolso y luego asegure la cuerda del bolso al tubo de presión para asegurar la línea de presión.
8. Extienda el tubo RVOT conectando un tubo de presión adicional a la línea de presión RVOT.
9. Entregue el tubo de presión adicional a una persona designada no estéril para conectar el tubo a un transductor de presión y monitorear la medición de la presión de RV de referencia. Configure el transductor de presión de la siguiente manera.
   1. Conecte el extremo luer macho del conjunto de administración IV al extremo luer femenino del transductor.
   2. Conecte el extremo luer hembra del tubo de presión al extremo luer macho del transductor.
   3. Pico de la administración iv puesta en una bolsa de solución salina heparinizada (2 UI/ml).
   4. Coloque la bolsa salina en una bolsa de presión y bombee la bolsa de presión a 250-300 mmHg como se indica en el medidor.
   5. Imprima completamente la línea liberando la válvula en el transductor, asegurando una desaireación adecuada.
   6. Siga los métodos complementarios para la calibración del transductor.
10. Después de diseccionar cuidadosamente alrededor del LPA, rodearlo con una cinta umbilical. Ligar el LPA atando la cinta umbilical. Tenga en cuenta la respuesta hemodinámica del animal a la ligadura si es relevante para el estudio. Aumente la ventilación minuto para compensar el aumento de la ventilación del espacio muerto creado tras la ligadura de LPA. Estos ajustes del ventilador mitigan la acidosis respiratoria.
11. Inyecte lentamente hasta 3 ml de solución salina en el oclusor de PA principal para asegurarse de que no haya fugas mientras monitorea la presión de RV desde la línea de presión RVOT. Una vez que se confirme la respuesta del RV, retire la solución salina inculcada.
12. Saque la línea de presión RVOT y el tubo oclusor PA del tórax un espacio intercostal debajo de la incisión de toracotomía.
13. Formar dos bolsas subdérmicas a lo largo de la capa fascial en el dorso izquierdo de las ovejas tan posteriormente hacia la columna vertebral como sea posible dentro del campo estéril. Estos sirven como sitios para los puertos de residencia (Figura 2C).
14. Usando un extractor de tubo torácico, tunelice la línea de presión RVOT y el tubo oclusor desde la incisión torácica hasta los sitios del puerto del dorso izquierdo.
15. Asegure tanto el tubo del oclusor como la línea de presión del RV a las conexiones de púas del puerto. Anclar el oclusor y el tubo de presión alrededor de los conectores del puerto con lazos adicionales. Utilice la conexión de conector de púas proporcionada para proteger la conexión (Figura 1C). Coloque los puertos dentro de los bolsillos subdérmicos preformados.
16. Anclar los puertos en tres ubicaciones alrededor de su borde a la fascia subyacente con suturas de polipropileno 3-0 para evitar la migración del puerto. Reapproximar el tejido subcutáneo, la dermis y la piel en capas con suturas de poliglactina 910. Reconfirmar las lecturas de presión a través del acceso percutáneo de los puertos. Enjuague el puerto RVOT con 5 ml (1000 UI/ml, 5000 unidades) de heparina sódica.
17. Coloque un tubo torácico de 16 franceses en la cavidad pleural izquierda a través de una incisión separada, asegúrelo a la piel y luego conéctelo a una unidad de drenaje de tubo torácico cerrada a una presión de -20 cm · _H2O. Coloque un punto en U desatado alrededor del tubo para facilitar el cierre después de la extracción del tubo torácico.
18. Administrar un bloqueo nervioso intercostal (0,5-1 mg/kg de bupivacaína) para la analgesia postoperatoria.
19. Cierre la toracotomía con suturas de figura de ocho, #2 poliglactina 910. Cierre la capa muscular pectoral con la poliglactina #0 910. Cierre el tejido subcutáneo en capas de suturas de poliglactina 910 y grape la piel.
20. Reposicione al animal a la recosta dorsal, retire el tubo orogástrico y luego suspenda el isoflurano.
21. Continuar con la ventilación mecánica y los cuidados de apoyo hasta que el pH de la sangre arterial > 7,35 y el _pCO2 < 55 mmHg.
22. Extubar una vez que el animal esté respirando espontáneamente, levantando la cabeza y masticando el tubo endotraqueal. Retire el tubo torácico antes de la recuperación anestésica completa. Ate la puntada en U para cerrar la incisión del tubo torácico.
23. Transfiera al animal a su jaula mientras monitorea su recuperación de la anestesia. Asegúrese de que el oxígeno suplementario (3-5 L / min por máscara facial) esté disponible en todo momento mientras las ovejas permanecen inmóviles. Controle los signos vitales cada hora durante las primeras 4 h, cada 8 h durante las siguientes 24 h, y una vez al día después de eso.

5. Recuperación postoperatoria

1. Monitoree diariamente los sitios de toracotomía e implantación portuaria para detectar signos de infección. Administrar antibiótico de acción prolongada (ceftiofur, 5 mg/kg por vía intramuscular) dentro de las 24 h posteriores al procedimiento y cada 3-4 días después de eso durante 1 semana.
2. Continúe el parche de fentanilo después de la operación durante un total de 72 h. Después de eso, proporcione analgesia adicional (por ejemplo, meloxicam, 1 mg / kg una vez al día por vía intramuscular) si el animal continúa mostrando signos de dolor (es decir, rechinar los dientes, frecuencia cardíaca elevada).
3. Retire las suturas externas y las grapas de la piel 10-14 días después de la cirugía o según lo recomendado por el personal veterinario.
4. Asegurar la protección del sitio del puerto contra el animal frotando o raspando los sitios del puerto contra las estructuras circundantes utilizando un apósito tubular (Figura 2D).

6. Anillamiento crónico de AF (9 - 10 semanas)

1. Transfiera las ovejas a un pequeño recinto. Cortar el exceso de lana alrededor de los puertos implantados.
2. Limpie las áreas afeitadas con alcohol isopropílico al 70%. Aplique el aerosol tópico de lidocaína para el anestésico local.
3. Prepare dos transductores de presión para monitorear las presiones de RV y manguito de oclusor (Figura 3A).
   1. Para ambos transductores: Conecte el extremo luer hembra del tubo de presión (36 pulgadas o más) al extremo luer macho del transductor. Conecte el extremo luer macho del tubo de presión a una de las conexiones luer hembra en una llave de paso de tres vías. Finalmente, conecte una aguja Huber de 22 G al extremo luer macho de esa llave de paso de tres vías.
   2. Para el transductor de presión RV: Cuelgue una bolsa salina heparinizada (2 UI / ml), perfore la bolsa con el conjunto de administración IV y conecte la conexión luer macho del conjunto de administración IV a la conexión luer hembra del transductor de presión RV. Luego, presurice la bolsa salina (por ejemplo, bolsa a presión).
   3. Para el transductor de oclusión: Cebar completamente el transductor y el tubo de presión. Coloque una tapa de luer macho en el extremo luer hembra del transductor de presión para evitar que el líquido del manguito se filtre de regreso al transductor.
   4. Conecte ambos transductores al hardware de adquisición de datos mediante un cable o adaptador adecuado.
4. Calibre los transductores como se especifica en el archivo complementario 1.
5. Haga clic en Inicio en la parte superior derecha de la ventana del software para comenzar a registrar el software de adquisición de datos para capturar formas de onda de presión de manguito rv y PA a 400 Hz.
6. Haga que un asistente proporcione una restricción leve del animal antes del acceso al puerto. Inserte la aguja Huber desde el transductor de presión RV hasta el puerto RV. Conecte una jeringa de 10 ml a la llave de paso de tres vías e intente extraer sangre de nuevo en la jeringa desde el puerto de RV (Figura 3B).
   1. Si es difícil tirar hacia atrás de la jeringa, primero inyecte solución salina de 5-10 ml en el puerto de RV para desalojar la fuente de oclusión.
   2. Si la obstrucción persiste, instila 2 mg de activador tisular del plasminógeno (tPA) en el puerto como agente fibrinolítico y déjelo durante la noche. Verifique al día siguiente para aspirar el tPA.
7. Una vez establecida la línea de presión RV, conecte la aguja Huber desde el transductor del manguito PA.
8. Capture los valores iniciales de las presiones del manguito RV y PA (Figura 3C). Tenga en cuenta cualquier cambio drástico con respecto a las lecturas anteriores.
   1. Si la presión del manguito de PA y / o RV disminuyó sustancialmente con respecto a la lectura anterior, puede ser una señal de que el manguito de PA está goteando.
   2. Observe otro signo obvio de fuga del manguito pago estudiando la forma de onda del manguito PA. Si la presión promedio del manguito de PA cae a una velocidad discernible, entonces hay una alta probabilidad de que el manguito tenga fugas.
      NOTA: Vuelva a comprobar que todas las conexiones luer del transductor de presión, el tubo y la llave de paso estén apretadas. El contenido de fluido altamente presurizado del manguito de PA puede fluir hacia atrás y filtrarse de las conexiones de luer sueltas.
      1. Si el manguito de PA tiene fugas, determine el alcance de la fuga. Si la tasa de fugas es lenta, entonces una estrategia de bandas más frecuente puede superar la fuga para que el modelo de enfermedad siga siendo efectivo.
9. Inyecte lentamente solución salina hipertónica al 3% en el puerto del oclusor mientras presta atención a las presiones de RV y manguito.
   1. Ajuste la cantidad de inyección en función de la gravedad deseada de la enfermedad de PH y el fenotipo de RV. Un aumento semanal de la presión del manguito en 100-150 mmHg es un objetivo razonable para desarrollar un fenotipo de RV compensador adaptativo.
   2. Los aumentos más rápidos en la presión del manguito (>250 mmHg por semana) probablemente producirán un fenotipo rv descompensante.
10. Una vez que el manguito país esté inflado a la cantidad deseada, retire la aguja Huber del puerto del manguito.
11. Obtenga una muestra de sangre del puerto de RV.
    1. Aspire 10 ml de sangre fuera del puerto de RV de manera estéril y reserve.
    2. Coloque una jeringa nueva en lugar de la jeringa de aspiración y aspire tanta sangre como sea necesario sin exceder el límite semanal de extracción de sangre del 7,5% del volumen total de sangre.
    3. Vuelva a conectar la jeringa original con sangre aspirada y devuélvala a través del puerto de RV.
    4. Tire de la palanca de la válvula del transductor de presión para enjuagar la solución salina heparinizada de la bolsa salina al puerto de RV. Continúe enjuagando hasta que toda la línea se vuelva clara e incolora.
12. Enjuague el puerto de RV con 10 ml de solución salina. Luego, enjuague aún más el puerto con 5 ml de 1000 U / ml de heparina sódica.
13. Repita los pasos 6.1-6.12 cada 1-4 días durante 9-10 semanas.

Se utiliza un grupo representativo de 12 ovejas para mostrar la eficacia de este modelo para desarrollar diversos grados de PH-RVF. Entre estas ovejas, la presión media del manguito de PA aumentó de 32 ± 20 mmHg en la semana 1 a 1002 ± 429 mmHg en la semana 9. Esto resultó en el aumento de la media de RV y las presiones sistólicas de 28 ± 5 y 57 ± 7 mmHg en la semana 1, respectivamente, a 44 ± 7 y 93 ± 18 mmHg en la semana 9. Además, el perfil de presión del manguito de PA se superpuso a la saturación venosa mixta de oxígeno (_SvO2) para demostrar la eficacia del modelo afinando el fenotipo de la enfermedad (Figura 4). Específicamente, las bandas de PA más rápidas condujeron a una disminución más rápida de _SvO2. En comparación, aquellos que experimentaron una estrategia de bandas de PA más gradual mantuvieron un rango fisiológico de _SvO2 entre el 70% y el 80%. Un ecocardiograma transtorácico representativo adquirido después de 9 semanas de bandas progresivas de AF muestra dilatación de RV y arco septal debido a la sobrecarga de presión (Video suplementario 1). En un informe de caso publicado ^{anteriormente10}, el modelo también se puede utilizar para inducir la falla de RV en etapa terminal, lo que conduce a derrames pleurales y ascitis abdominal.

Figura 1: Visión general y cronograma para el experimento general. (A) Línea de tiempo experimental para el modelo de insuficiencia ventricular derecha (FVR) de hipertensión pulmonar crónica (HP) y la estrategia de adquisición de datos sugerida. (B) El diagrama esquemático para la primera cirugía de supervivencia para establecer las bases para el modelo de insuficiencia ventricular derecha (FVR) de hipertensión pulmonar crónica (HP). Se implanta el oclusor principal de la arteria pulmonar (AP), se liga la arteria pulmonar izquierda (LPA) y se coloca un tubo de presión en el tracto de salida del ventrículo derecho (RVOT). Finalmente, las líneas de presión del manguito RVOT y PA están conectadas a sus respectivos puertos, los cuales se implantan por vía subcutánea para el acceso y monitoreo recurrentes. (C) Fotografía del manguito de megafonía, el puerto subcutáneo y el accesorio de plástico para proteger su conexión de púas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Fotografías de los pasos quirúrgicos clave para establecer el modelo de hipertensión pulmonar ovina (HP). (A) Aislamiento de la arteria pulmonar principal (AP) e implantación del manguito pa (círculo). (B) Manguito de PA implantado (círculo), tubo de Penrose (estrella) y tubo de presión del tracto de salida del ventrículo derecho (RVOT) (triángulo blanco). (C) Implantación subcutánea de puertos para manguito RVOT y PA. (D) Apósito tubular y acolchado de espuma colocado alrededor del cuerpo de la oveja para proteger los puertos implantados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Abordaje experimental para el anillamiento crónico de la arteria pulmonar (AP). (A) Esquema para configurar transductores de presión para medir y ajustar los valores de presión del manguito ventricular derecho (RV) y PA. (B) Representación fotográfica del acceso al tracto de salida de RV (RVOT) y a los puertos de manguito de PA. (C) Rastreo de presión representativo de las presiones de manguito RV y PA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Presión del manguito de la arteria pulmonar (AP) y la correspondiente saturación venosa mixta de oxígeno (_SvO2). Las tendencias longitudinales entre la presión del manguito de la arteria pulmonar (AF) y la correspondiente saturación venosa mixta de oxígeno (_SvO2) muestran diferenciación en el fenotipo del ventrículo derecho basada en la estrategia de bandas de PA. El perfil de color varía considerablemente entre los sujetos que experimentaron una estrategia de bandas pa más rápida en comparación con los sujetos que se sometieron a una estrategia de bandas más gradual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video complementario 1: Ecocardiogramas transtorácicos representativos entre el estado basal saludable y después del modelo de enfermedad de insuficiencia ventricular derecha por hipertensión pulmonar (PH-RVF). El modelo PH-RVF recapitula las características clave de la enfermedad, incluida la dilatación e hipertrofia de RV, y la inclinación septal. Haga clic aquí para descargar este video.

Archivo complementario 1: Pasos de configuración y calibración de la adquisición de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Información relevante sobre el tema animal para esta plataforma.

Tabla complementaria 2: Complicaciones durante el modelo de hipertensión pulmonar ovina.

El modelo PH-RVF presentado puede inducir de manera confiable diferentes niveles de gravedad de la enfermedad para que coincida con los objetivos de la investigación. Se utilizan dos enfoques diferentes en combinación para inducir este modelo de enfermedad. En primer lugar, la ligadura LPA sirve para aumentar la resistencia vascular pulmonar y disminuir la capacitancia de ^PA11,12, estableciendo así el punto de partida del modelo crónico en un estado de poscarga de RV ya aumentado. Luego, la implantación del manguito de PA y su inflación progresiva sirve para desarrollar un fenotipo objetivo de PH-RVF. El control de la presión del manguito de PA y su tasa de cambio puede crear diferencialmente rvs compensadores o descompensantes, demostrados por el mantenimiento o la disminución de _SvO2 (Figura 4). Al aumentar la presión del manguito en 250-300 mmHg por semana, las ovejas comenzarán a mostrar signos tempranos de descompensación alrededor de 5-6 semanas. El aumento de la presión del manguito en 100-150 mmHg por semana, por otro lado, permite un perfil más adaptativo durante toda la duración de 9 semanas.

Existen pocos modelos animales grandes de PH crónico y RVF en la literatura. La embolización de la arteria pulmonar en ovejas ha sido la más ampliamente reportada y ^discutida4,5. Sin embargo, este enfoque tiene una alta tasa de mortalidad, superior al 86%⁴ dependiendo de la frecuencia de dosificación y el tamaño de las perlas, sin embargo, produce solo un cambio marginal en la hemodinámica y la función de RV. Por otro lado, el modelo presentado puede inducir un rango mucho mayor de sobrecarga de presión de RV con muertes mínimas relacionadas con el procedimiento. Un animal que murió debido a este modelo PH-RVF desarrolló varios litros de derrame pleural y ^ascitis10, correlacionándose con los hallazgos clínicos y de investigación de insuficiencia cardíaca derecha en humanos13,14,15 y animales ^grandes16. Estos signos se observaron sin ninguna evidencia de insuficiencia cardíaca izquierda. Por lo tanto, este modelo puede servir como una plataforma de animales grandes clínicamente traducible con la capacidad de producir fisiopatología titulable.

Hay varios desafíos notables para ejecutar este modelo. En primer lugar, si bien el uso de una minitoracotomía izquierda facilita la recuperación postoperatoria oportuna, la exposición quirúrgica simultánea tanto de la AF principal como de la LPA es técnicamente desafiante a través de esta incisión mínimamente invasiva. Seleccionar el espacio intercostal óptimo es esencial y la ecografía puede ser una guía útil. La bifurcación PA es más distal y posterior en comparación con la anatomía humana, lo que hace que la ligadura del LPA sea el paso más desafiante de este procedimiento. Si bien la ligadura sirve como un paso crítico para aumentar la resistencia vascular pulmonar y disminuir la capacitancia de PA, es factible que la banda principal de PA por sí sola pueda lograr una presión de RV suficientemente alta.

La infección de los puertos de morada y la dehiscencia de la herida en el sitio del puerto pueden ser difíciles de abordar y conducir a complicaciones devastadoras. En este modelo de hipertensión pulmonar, las infecciones podrían ser el insulto metabólico agudo que desencadena el compromiso cardiopulmonar, el colapso y la mortalidad temprana. Los altos estándares para la técnica estéril, el cierre meticuloso de la piel y la protección del sitio del puerto limitan significativamente la incidencia y el impacto de estos casos.

La ruptura del manguito es un problema específico con el modelo que podría conducir a una disminución de la presión del RV. Aunque es poco común, este problema se ha observado anteriormente. Hay algunos pasos preventivos y correctivos para este problema. Primero, se debe tener cuidado para evitar perforar el manguito mientras se asegura alrededor de la AP con sutura. Probar el manguito antes de cerrar el pecho asegura su integridad al final de la operación inicial. A continuación, el tamaño del manguito de PA debe elegirse en función del tamaño principal del diámetro de PA. Si el manguito tiene fugas, entonces será importante evaluar la magnitud de la fuga. Si el inflado más frecuente de la banda PA puede superar la tasa de fuga, entonces el modelo aún puede lograr un PH-RVF moderado, aunque es posible que ya no induzca la gravedad deseada de PH-RVF.

En nuestra experiencia, este modelo tiene una tasa de éxito general del 78% (Tabla suplementaria 2), pero la mayoría de las complicaciones han sido en la mitad anterior de estos ensayos. La cohorte más reciente de 13 sujetos ha tenido una tasa de éxito del 100%, lo que sugiere que este modelo puede ser reproducible y libre de complicaciones con suficiente experiencia.

Finalmente, una limitación científica clave del modelo animal presentado es que no transmite una característica clave de la hipertensión arterial pulmonar, a saber, la remodelación vascular pulmonar. Por lo tanto, este modelo no es la plataforma ideal para desarrollar y probar terapias que se centran únicamente en la vasculatura pulmonar. En cambio, es una plataforma efectiva para estudiar la disfunción de RV y la falla de la poscarga anormal de RV. Los resultados de los pacientes en PH son impulsados en gran medida por la función de RV, y los resultados favorables se asocian con la preservación de esta función de ^RV17. Aunque este modelo no captura todos los aspectos de la HP, es un modelo valioso para comprender las vías moleculares que conducen a la FVR y desarrollar terapias dirigidas a la FVR para mejorar la FVR.

La ligadura LPA y el modelo principal de bandas de PA incrementales pueden recapitular con éxito la fisiopatología compleja de rvF secundaria a PH. Este modelo proporcionará a los investigadores una plataforma experimental para desarrollar nuevos biomarcadores de diagnóstico que diferencien entre respuestas adaptativas y desadaptativas a la HP en la RV, diluciden las vías de respuesta crítica en la FVR y permitan innovaciones terapéuticas para tratar la FVR.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud R01HL140231. Agradecemos a la División de Cuidado de Animales por su cría de animales y atención veterinaria. Agradecemos al SR Light Laboratory y a su personal, Jamie Adcock, Susan Fultz, Codi VanRooyen y José Díaz, por su dedicado apoyo técnico con cirugías de animales grandes.