Un nuovo paradigma pavloviano di condizionamento della paura per studiare il congelamento e il comportamento di volo

Le risposte comportamentali difensive dipendono dall'intensità della minaccia, dalla vicinanza e dal contesto di esposizione. Sulla base di questi fattori, abbiamo sviluppato un paradigma di condizionamento classico che suscita chiare transizioni tra congelamento condizionato e comportamento di volo all'interno dei singoli soggetti. Questo modello è fondamentale per comprendere le patologie coinvolte in ansia, panico e disturbi da stress post-traumatico.

I comportamenti legati alla paura e all'ansia contribuiscono in modo significativo alla sopravvivenza di un organismo. Tuttavia, le risposte difensive esagerate alla minaccia percepita sono caratteristiche di vari disturbi d'ansia, che sono la forma più diffusa di malattia mentale negli Stati Uniti. Scoprire i meccanismi neurobiologici responsabili dei comportamenti difensivi aivimenterà lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici. Il condizionamento della paura pavloviano è un paradigma di laboratorio ampiamente usato per studiare l'apprendimento e la memoria legati alla paura. Una delle principali limitazioni dei paradigmi tradizionali di condizionamento della paura pavloviano è che il congelamento è l'unico comportamento difensivo monitorato. Recentemente abbiamo sviluppato un paradigma pavloviano modificato per il condizionamento della paura che ci consente di studiare sia il congelamento condizionato che il comportamento di volo (noto anche come fuga) all'interno dei singoli soggetti. Questo modello utilizza calzini a maggiore intensità e un maggior numero di accoppiamenti tra lo stimolo condizionato e lo stimolo incondizionato. Inoltre, questo paradigma di volo condizionato utilizza la presentazione seriale di toni puri e stimoli uditivi del rumore bianco come stimolo condizionato. Seguendo il condizionamento in questo paradigma, i topi mostrano un comportamento di congelamento in risposta allo stimolo del tono e risposte di volo durante il rumore bianco. Questo modello di condizionamento può essere applicato allo studio di transizioni rapide e flessibili tra le risposte comportamentali necessarie per la sopravvivenza.

La paura è una risposta adattiva evolutivamente conservata a una minaccia^{immediata 1,2}. Mentre gli organismi possiedono risposte difensive innate a una minaccia, le associazioni apprese sono cruciali per ottenere risposte difensive appropriate agli stimoli predittivi del pericolo³. La disregolazione nei circuiti cerebrali che controllano le risposte difensive può contribuire a reazioni disadattative associate a molteplici disturbi d'ansia debilitanti, come il disturbo da stress post-traumatico (PTSD), il disturbo di panico⁴e fobie^{specifiche 5,6}. Il tasso di prevalenza negli Stati Uniti per i disturbi d'ansia è del 19,1% per gli adulti e del 31,9% negli adolescenti^7,8. Il peso di queste malattie è estremamente elevato sulla routine quotidiana degli individui e influisce negativamente sulla loro qualità di vita.

Negli ultimi decenni, il condizionamento della paura pavloviano è servito come un potente sistema modello per ottenere una visione straordinaria dei meccanismi neurali alla base dell'apprendimento^{e della memoria legati alla paura 9,10,11}. Il condizionamento della paura pavloviano comporta l'abbinamento di uno stimolo condizionato (CS, come uno stimolo uditivo) con uno stimolo avverso non condizionato (US; ad esempio, un footshock elettrico)¹². Poiché il congelamento è il comportamento dominante evocato e misurato nei paradigmi di condizionamento pavloviano standard, i meccanismi di controllo neurale delle forme attive di comportamento difensivo come le risposte di fuga / volo rimangono in gran parte inesplorate. Studi precedenti mostrano che diverse forme di comportamento difensivo, come il volo, vengono evocate a seconda dell'intensità della minaccia,^{della vicinanza e del contesto 13,14}. Studiare come il cervello controlla diversi tipi di comportamento difensivo può contribuire in modo significativo alla comprensione dei processi neuronali che sono disregolati nei disturbi della paura e dell'ansia.

Per rispondere a questa esigenza critica, abbiamo sviluppato un paradigma di condizionamento pavloviano modificato che suscita salti di volo e fuga, oltre al congelamento¹⁵. In questo paradigma, i topi sono condizionati con uno stimolo composto seriale (SCS) costituito da un tono puro seguito da rumore bianco. Dopo due giorni di accoppiamento della SCS con un forte calzata elettrica, i topi mostrano congelamento in risposta al componente tono e al volo durante il rumore bianco. Gli interruttori comportamentali tra il congelamento condizionato e il comportamento di volo sono rapidi e coerenti. È interessante notare che i topi mostrano un comportamento di volo solo quando il rumore bianco CS è presentato nello stesso contesto di un footshock precedentemente consegnato (il contesto condizionante) ma non in un contesto neutro. Invece, le risposte di congelamento dominano in questo contesto neutro, con livelli significativamente maggiori di congelamento in risposta al rumore bianco rispetto al tono. Ciò è coerente con il ruolo del contesto nella modulazione dell'intensità della risposta difensiva e con il ruolo regolatore dell'informazione contestuale nell'apprendimento e nella memoria legati alla paura che si trovano nei paradigmi^{tradizionali di condizionamento delle minacce 16,17}. Questo modello consente confronti diretti all'interno del soggetto di più comportamenti difensivi in un modo specifico del contesto.

Le seguenti fasi/procedure sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali dopo l'approvazione da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Tulane.

1. Preparazione dei topi

1. Utilizzare topi adulti maschi e/o femmine di età compresa tra 3 e 5 mesi. Nel presente studio, abbiamo utilizzato topi maschi C57BL/6J ottenuti dal Jackson Laboratory, ma è possibile utilizzare qualsiasi ceppo di topo di un fornitore affidabile.
2. Almeno una settimana prima dell'esperimento, ospitare tutti i topi singolarmente su un ciclo chiaro/scuro di 12:12 ore durante lo studio. Fornire ai topi l'accesso ad libitum al cibo e all'acqua.
3. Eseguire tutti gli esperimenti comportamentali durante il ciclo della luce. Eseguire tutte le sessioni contemporaneamente all'ora del giorno all'interno di una singola coorte. Ad esempio, se si avvia l'esperimento alle 9 del mattino del giorno 1, continuare a partire da quel momento fino al completamento dell'esperimento.

2. Preparazione di materiali di studio

1. Contesti di studio
   1. Scegli due contesti diversi in cui eseguire gli esperimenti.
   2. Utilizzare una camera cilindrica composta da plexiglas chiare (diametro 30 cm) come contesto A, con un pavimento in plexiglas liscio. L'altezza della camera dovrebbe essere sufficiente per evitare la fuga (alta almeno 30 cm).
   3. Per il contesto B utilizzare un involucro rettangolare (25 cm x 30 cm) con un pavimento a griglia elettrica utilizzato per fornire footshock a corrente alternata. L'altezza di questa camera è molto importante e dovrebbe essere alta almeno 35 cm. In alternativa, utilizzare un tetto trasparente (assicurarsi che il video possa essere registrato attraverso questo materiale).
      NOTA: utilizzare una camera con superfici pareti lisce che possono essere facilmente pulite.
   4. Utilizzare una soluzione di pulizia diversa per pulire i contesti. Ad esempio, contesto pulito A con 1% acido acetico e contesto B con 70% di etanolo. Pulire i contesti prima di iniziare la prima sessione, tra il test dei singoli mouse e dopo il completamento delle sessioni della giornata. Questo è vitale per rimuovere i segnali olfattivi dai topi precedenti. Una pulizia accurata aiuterà anche a prevenire il ridimensionamento delle urine sulla griglia d'urto, il che comprometterà le sessioni di condizionamento.
      NOTA: Le soluzioni di pulizia fungono anche da spunto olfattivo, quindi utilizzano lo stesso liquido detergente per un particolare contesto.
   5. Posizionare il contesto A o il contesto B in una casella attenuante del suono durante le rispettive sessioni di studio.
2. Generatore audio
   1. Montare un altoparlante sopra i contesti per fornire stimoli uditivi a 75 dB.
   2. Utilizzare un generatore audio programmabile per generare stimoli uditivi in base a una pianificazione predefiniti. Il tono puro a 7,5 kHz è un suono con una forma d'onda sinusoidale, mentre il rumore bianco è un segnale casuale con uguale intensità a frequenze diverse, che vanno da 1-20.000 Hz.
   3. Utilizzare impulsi TTL per fornire stimoli uditivi e segnali d'urto con precisione temporale.
      NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, misurare l'uscita dell'intensità sonora dall'altoparlante montato in ogni camera utilizzando un misuratore dB.
3. Ammortizzatore: collegare l'ammortizzatore con il pavimento della rete elettrica che viene utilizzato per esegnire lo shock CA da 0,9 mA. Definire la frequenza, l'inizio e la durata degli shock in un programma per computer. Fornire ogni stimolo d'urto alla fine di ogni SCS per una durata di 1 s, per un totale di cinque accoppiamenti SCS-shock per sessione di condizionamento.

3. Preparazione di programmi per computer e tracciamento video

1. Generare protocolli comportamentali utilizzando la codifica in un programma software.
2. Nel programma, definire lo stimolo composto seriale SCS. Questo stimolo è una presentazione seriale di un tono puro di 10 s (ogni pip è presentato per 500 ms, alla frequenza di 7,5 kHz e velocità di 1 Hz) e 10 s di rumore bianco (500 ms pips a 1 Hz).
3. Definire gli intervalli inter-trial (ITI) presentati dopo ogni prova, pseudocasualmente.
4. Durante lo studio, registrare tutto il comportamento del mouse in video per l'analisi successiva.
   NOTA: le scatole di condizionamento della paura disponibili in commercio potrebbero non essere configurate per registrare i comportamenti attraverso la fotocamera montata in alto. Questo è molto importante poiché il video registrato viene utilizzato per calcolare il movimento orizzontale, la velocità e la distanza totale percorsa dall'animale.
5. Per impostare il tracciamento software, posizionare un mouse di prova in ogni contesto pertinente, regolare la sensibilità di tracciamento del contorno e definire il centro di gravità. Ciò garantirà l'acquisizione di dati affidabili sulla posizione relativa. Inoltre, definire l'intera area di contesto accessibile al soggetto.
   NOTA: La regolazione della dimensione del contorno per entrambi i contesti è importante in quanto il cambiamento di luminosità in contesti diversi cambierà la dimensione del contorno.
6. Determinare un coefficiente di calibrazione utilizzando le dimensioni note delle camere e le dimensioni dei pixel della fotocamera che possono essere utilizzate per calcolare la velocità (cm/s).
7. Sincronizzare gli eventi timestamp del computer di acquisizione dati con le occorrenze in tempo reale.

4. Esperimento comportamentale

1. Accendi tutte le apparecchiature: computer, controller della scatola di condizionamento della paura, shocker e software di registrazione video e timestamp. Assicurarsi che gli strumenti siano accesi nell'ordine appropriato.
2. Controlla tutte le funzioni, tra cui tono, rumore bianco e consegna degli urti, e configura il sistema per l'acquisizione dei dati.
3. Trasporta gli animali dal loro ripostiglio al locale di condizionamento. Consentire loro di acclimatarsi lì per almeno 10 minuti.
4. Portare l'animale fuori dalla gabbia di casa, posizionarlo delicatamente nel rispettivo contesto e quindi attivare immediatamente i programmi per computer.
   NOTA: L'inizializzazione del sistema di condizionamento della paura e del software di raccolta dati (timestamp, tracciamento del mouse e registrazione video) alla volta può essere sincronizzata utilizzando attivazioni mediate da impulsi TTL.
5. Precondizione/Pre-esposizione
   1. Il primo giorno, inserire il soggetto nel contesto A (contesto neutro). Lasciare che si acclimati alla camera per 3 minuti (il periodo di riferimento), quindi esporla a 4 prove di un SCS della durata totale di 20 s(Figura 1A-1B).
   2. Mantenere uno pseudocasuale medio di 90 s ITI (intervallo 80-100 s). La durata totale di ogni sessione di pre-esposizione è di 590 s.
6. Condizionamento della paura
   1. Il giorno 2 e il giorno 3, inserire il soggetto nel contesto B. Dopo un periodo di riferimento di 3 minuti, esporre il soggetto a cinque accoppiamenti della co-terminazione SCS con un footshock CA da 1 s, 0,9 mA.
   2. Mantenere uno pseudocasuale medio di 120 s ITI (intervallo 90-150 s). Fare in modo che ogni sessione di condizionamento abbia una durata totale di 820 s (Figura 1A).
   3. A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, sottoseni i topi il giorno 4 a un test di richiamo (vedi fase 4.7) o a temere l'estinzione (vedi fase 4.8).
7. Richiamo della paura (per testare la dipendenza dal contesto)
   1. Il giorno 4, inserire il soggetto nel contesto A. Dopo il periodo di riferimento di 3 minuti, presentarlo con 4 prove della SCS senza piede, oltre 590 s.
   2. Mantenere uno pseudocasuale medio di 90 s ITI (intervallo 80-100 s).
8. Estinzione della paura
   1. Il giorno 4, inserire il soggetto nel contesto B. Dopo il periodo di riferimento di 3 minuti, presentare 16 prove della SCS senza piede, oltre gli anni '1910.
   2. Mantenere uno pseudocasuale medio di 90 s ITI (intervallo 60-120 s).
9. Riportare l'animale nella sua gabbia di casa e ripetere la procedura per tutti gli animali.

5. Quantificazione del comportamento

1. Fare in modo che un osservatore cieco all'esperimento segni i video registrati per il comportamento di congelamento utilizzando la soglia automatica del rilevatore di congelamento seguita da un'analisi fotogramma per fotogramma delle modifiche ai pixel.
   NOTA: altri pacchetti software possono anche essere utilizzati per calcolare automaticamente il congelamento utilizzando il sistema a 2 telecamere. È anche possibile per un osservatore segnare manualmente il comportamento di congelamento.
2. Definire il congelamento come una cessazione completa dei movimenti corporei, ad eccezione di quelli necessari per la respirazione, per un minimo di 1 s.
3. Il punteggio salta quando tutte e 4 le zampe lasciano il pavimento, con conseguente movimento verticale e/o orizzontale.
4. Esportare il file contrassegnato con marcatori di blocco, salto ed eventi.
5. Estrarre eventi rilevanti (congelamento e salti) da periodi di tempo definiti (ad esempio, durata di 10 s di rumore pre-SCS, tono e bianco, per ogni prova).
6. Utilizzando le durate di inizio-arresto estratte degli eventi in un file di foglio di calcolo, calcolare la durata del blocco (in s) sottraendo l'ora di inizio dall'ora di fine, dai rispettivi periodi di prova.
7. Rappresenta questi dati per quanto riguarda la prova o il giorno, sommando la durata di congelamento di tutte le prove.
   NOTA: A seconda dello scopo dello studio, i comportamenti di volo o congelamento possono essere segnati e calcolati da qualsiasi prova / durata dalla sessione di studio.
8. Sommare il numero totale di salti da una particolare durata di prova.
9. Estrarre il file generato dalle coordinate di tracciamento del mouse dal fotogramma per fotogramma il movimento dell'asse X-Y del centro di gravità del mouse e calcolare la velocità del mouse (cm/s).
   NOTA: I dati sulla velocità possono essere presenti nel formato cm/s o pixel/s. Convertire l'unità pixel/s in cm/s utilizzando il valore inch o cm/pixel definito nel video per tale contesto di test (vedere la sezione 3.6).
10. Dopo aver estratto i dati sulla velocità per il movimento fotogramma per fotogramma dell'animale, in base alla frequenza fotogrammi del video (preferibilmente 30 fotogrammi /s), calcolare la velocità media dell'animale in una specifica staffa del numero di fotogramma (moltiplicare i tempi di inizio e fine in s per 30 per ottenere il numero di fotogramma iniziale e finale).
11. Calcola i punteggi di volo dividendo la velocità media durante ogni SCS per la velocità media durante i 10 s pre-SCS (linea di base, BL) e quindi aggiungendo 1 punto per ogni salto di fuga (speedCS / speedBL + # di salti). Un punteggio di volo di 1 indica quindi nessun cambiamento nel comportamento di volo rispetto al periodo pre-SCS.
12. Facoltativamente, segna i video manualmente per altri comportamenti come l'allevamento e la toelettatura.

6. Analisi statistica

1. Analizzare i dati per la significatività statistica utilizzando il software di analisi statistica. Per tutti i test, la definizione di significatività statistica è P<0.05.
2. Controllare i dati per la distribuzione normale utilizzando il test di normalità Shapiro-Wilk (α=0,05).
3. Per testare l'effetto dei segnali, effettuare i confronti a coppie utilizzando l'appropriato test parametrico (test t accoppiato) o non parametrico (test di classificazione firmato Wilcoxon).
4. Per valutare l'interazione a 2 modi dei fattori (prova cue X), eseguire un ANOVA a 2 modi seguito da test post-hoc (ad esempio, il test di confronto multiplo di Bonferroni / test di Tukey).

Come descritto nel diagramma (Figura 1A), la sessione inizia con la pre-esposizione (Giorno 1), seguita dal condizionamento della paura (Giorni 2 e 3), e poi l'estinzione o il recupero (Giorno 4).

Le presentazioni dell'SCS nella sessione di pre-esposizione (giorno 1) non hanno suscitato la risposta al volo o al congelamento nei topi(figura 2A-2B). L'analisi comportamentale durante il condizionamento (Giorni 2 e 3) ha rivelato che il componente tonale del SCS ha notevolmente migliorato il congelamento rispetto al congelamento durante il pre-SCS (Figura 2B,2E). I punteggi dei voli sono cambiati in modo significativo tra le sessioni (dal primo al giorno 3, n = 20; Figura 2A). I topi hanno mostrato una velocità più elevata e più salti, e quindi punteggi di volo maggiori, al segnale di rumore bianco rispetto al tono(Figura 2C-2D). I topi hanno mostrato una chiara transizione del comportamento difensivo, mostrando punteggi di volo più bassi durante il tono, seguiti da punteggi di volo più alti durante il rumore bianco (Figura 2F) e viceversa per le risposte di congelamento (Figura 2G).

Per verificare l'effetto della vicinanza e del contesto delle minacce sul volo condizionato, i topi sono stati divisi in due gruppi: un gruppo è stato sottoposto ad addestramento all'estinzione nel contesto del condizionamento (Figura 3A-3B) e un altro gruppo è stato testato per il richiamo della memoria della paura esponendoli al SCS in un contesto neutro (Figura 3C-3D). I topi sottoposti ai 16 studi di addestramento all'estinzione mostrarono una rapida estinzione del volo condizionato (n = 12). I punteggi di volo durante il primo blocco di quattro prove sono stati più alti durante il rumore bianco rispetto al tono(Figura 3A). Il comportamento di volo non è stato più suscitato da nessuno dei due segnali alla fine della sessione di estinzione. C'è stata una diminuzione complessiva del congelamento indotto dal tono e un aumento del congelamento bianco mediato dal rumore durante la sessione di estinzione. Il congelamento per il primo blocco di quattro prove è stato significativamente più elevato del tono rispetto al rumore bianco (Figura 3B). Ciò suggerisce che l'imminenza della minaccia è vitale per la risposta al volo.

La risposta al volo è stata diminuita in modo dipendente dal contesto. L'esposizione al rumore bianco nel contesto neutro non ha suscitato il volo (n = 8). Al contrario, le presentazioni di rumore bianco nel contesto neutro hanno suscitato risposte di congelamento superiori a quelle suscitate dal tono (Figura 3C-3D). Ciò dimostra l'importanza del contesto nella modulazione della risposta difensiva.

Figura 1: Progettazione dello studio per valutare il congelamento e il paradigma di volo.
A) Diagramma delle sessioni comportamentali. B) Diagramma che descrive in dettaglio la composizione dello stimolo composto seriale (SCS), così come la tempistica degli Stati Uniti. C) Contesto A - servito come contesto neutro, e utilizzato durante le sessioni di pre-esposizione e richiamo. D) Contesto B – utilizzato per il condizionamento della paura. Questo dato è stato modificato da Fadok et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risposta di volo condizionata.
A) Confronto dei punteggi medi dei voli di prova (n = 20) dopo la presentazione del tono e del rumore bianco nei giorni 1-3. È stato notato un cambiamento significativo nei punteggi di volo tra le sessioni (dal primo al giorno 3; misure ripetute a due modi ANOVA, cue × interazione di prova, F (13, 266) = 5,795; P<0,0001). Il test di confronto multiplo post-hoc di Bonferroni rivela una differenza significativa tra i punteggi di volo indotti dal rumore tono e bianco al condizionamento della paura Giorno 1 (prova 4, P < 0,05) e Giorno 2 (prove 2-5, P < 0,001). B)Confronto del congelamento medio in % durante i periodi di rumore tono e bianco nei giorni 1-3. Si noti una variazione statisticamente significativa del congelamento in % durante le sessioni (giorno 1 al giorno 3, n = 20; misure ripetute a due modi ANOVA, cue × interazione di prova, F (13, 266) = 20,81; P < 0,001; Figura 2B). Il test di confronto multiplo di Bonferroni post-hoc rivela una differenza significativa tra il tono e il rumore bianco indotto dal congelamento al condizionamento della paura Giorno 1 (prova 4 e 5, P < 0,001) e Giorno 2 (tutte le prove, P < 0,001). C) Confronto del numero di risposte di fuga dal salto durante i periodi pre-SCS, tono, rumore bianco e shock il giorno 3. L'ANOVA uni-way seguito dal test di confronto multiplo di Bonferroni ha mostrato che i salti di fuga erano significativamente più alti durante il rumore bianco e lo shock rispetto al periodo di tono (rispettivamente P < 0,01 e P < 0,001). D)Confronto dei punteggi dei voli durante la presentazione del tono e del rumore bianco il giorno 3. Si noti un punteggio di volo significativamente più alto il giorno 3 durante il periodo di rumore bianco (P < 0,001, test di grado firmato coppie abbinate Wilcoxon). E) Confronto del % di congelamento durante il rumore pre-SCS, tono e bianco il giorno 3. Il comportamento di congelamento del giorno 3 rivela un effetto significativo del tono e del rumore bianco (misure ripetute uni-way ANOVA, F = 56.82, P<0.01). Il test di confronto multiplo di Bonferroni ha mostrato che la presentazione del tono aumenta significativamente il congelamento % rispetto alla durata pre-SCS (P < 0,01), mentre il congelamento in % è stato significativamente ridotto rispetto alle durate pre-SCS e tono (sia P < 0.001). I dati rappresentativi per quanto riguarda la prova mostrano le transizioni del comportamentodi volo( F ) econgelamento (G) dopo la presentazione del tono e del rumore bianco nel mouse il giorno 3. ± *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.01, ***P <0.001. Pre-exp, Pre-esposizione. I pannelli A-E sono modificati da Fadok et al., 2017. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Estinzione e richiamo dopo il condizionamento del volo (Giorno 4).
A) Il confronto dei punteggi di volo durante l'addestramento all'estinzione ha mostrato una rapida estinzione del volo condizionato (n = 12; 16 prove, misure ripetute × due modi ANOVA, cue × interazione di prova, F(15.165) = 3,05, P < 0,01). I punteggi di volo del primo blocco di quattro prove (prova 1-4) di estinzione osservati significativamente più alti per il rumore bianco rispetto al tono (P < 0,05, wilcoxon coppie abbinate test di rango firmato). B)Il confronto del congelamento ha mostrato un effetto statisticamente significativo sul congelamento (%) seguente rumore bianco (n = 12; 16 prove, misure ripetute a due modi ANOVA, cue × interazione di prova, F(15.165) = 3,55, P < 0,01). Il congelamento per il primo blocco di quattro prove (prova 1-4) durante l'estinzione è stato significativamente inferiore durante il periodo di rumore bianco rispetto al tono (test t accoppiato, P < 0,01). C) I cambiamenti nel contesto influenzano significativamente i punteggi di volo (n = 8; 4 prove, misure ripetute a due modi ANOVA, cue × interazione di prova, F(1,7) = 27,44, P < 0,01). I punteggi di volo si sono significativamente ridotti durante il rumore bianco rispetto al periodo di tono nel contesto neutro (test t accoppiato a due code, P < 0,01) D). Anche le risposte di congelamento tra le prove durante il recupero sono state significative (n = 8, 4 prove, misure ripetute bidizionali ANOVA, effetto del cue F(1,7) = 27,67, P < 0,01). L'esposizione del WN in un contesto neutro ha aumentato significativamente le risposte di congelamento rispetto al tono (test t accoppiato a due code, P < 0,001). ± *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.01, ***P <0.001. I pannelli A-D sono modificati da Fadok et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I parametri di suono e shock descritti sono elementi importanti di questo protocollo. È quindi fondamentale testare l'ampiezza degli urti e il livello di pressione sonora prima di iniziare gli esperimenti. Gli studi sul condizionamento della paura utilizzano in genere 70-80 dB di livelli di pressione sonora e 0,1-1 mA di intensità^{d'urto 18;} pertanto, i parametri descritti sono entro i limiti dei paradigmi tradizionali di condizionamento della paura. In un precedente esperimento di controllo solo CS (senza piede), non abbiamo osservato risposte di volo o congelamento nei topi, indicando che gli stimoli uditivi non sono avversi se presentati^{come descritto 15}. L'aumento del livello dB del rumore bianco superiore a 80 dB può indurre avversione innata. Tuttavia, gli stimoli al rumore presentati a 75 dB non provocano stress sotto forma di attività comportamentale soppressa nei topi¹⁹.

Gli stimoli uditivi che compongono il SCS devono essere accuratamente selezionati. Nel nostro studio precedente, abbiamo determinato che il condizionamento single-CS con rumore bianco induce punteggi di volo più alti rispetto al condizionamento con un tono^{puro 15}. Ciò illustra l'importanza della salienza dello stimolo in questo protocollo²⁰. Tuttavia, un recente studio ha dimostrato che il condizionamento con un'inversione della sequenza SCS (tono di rumore bianco) si traduce in volo verso il tono e congelamento al rumore^{bianco 21}. Questi dati avallano che anche la relazione temporale appresa degli spunti è un fattore importante.

Poiché i cambiamenti della gabbia sono una potenziale fonte di stress, si consiglia di iniziare a condizionare almeno 2 giorni dopo l'ultimo cambio di gabbia. Per ridurre ulteriormente l'impatto dello stress nei topi in fase di studio, è necessario fare attenzione a ridurre gli spunti olfattivi rimanenti dai soggetti precedenti, incluso l'odore delle feci e delle urine. Pertanto, la pulizia della camera prima e dopo ogni mouse è fondamentale. Per evitare altre potenziali fonti di disturbo, è meglio condurre questo protocollo in una stanza separata da qualsiasi altro esperimento in corso. I topi dovrebbero presentare un congelamento di base^{molto basso 15}. Per testare le condizioni sperimentali, ogni laboratorio deve condurre un esperimento pilota per testare il congelamento di base in ciascun contesto.

Oltre al C57BL/6J e ad altre linee transgeniche utilizzate da Fadok et al. Dati recenti (Borkar et al. 2020)^{22 suggeriscono che sia} i topi maschi che quelli femmine mostrano risposte di volo comparabili, quindi il paradigma è adatto a entrambi i sessi. Come accennato nel passaggio 2.1.2, in risposta a shock ad alta intensità, i topi saltano molto in alto, quindi seleziona attentamente l'altezza della camera per evitare che i topi sfuggano al contesto. È anche importante garantire la tempistica costante e accurata degli spunti e degli stimoli d'urto. Sia gli shock AC che DC sono efficaci; tuttavia, quando si utilizzano urti CC, potrebbe essere necessario aumentare l'intensità del piede per raggiungere punteggi di volo simili a quello degli shock CA. Poiché gli shock CC hanno un effetto meno dannoso sulle registrazioni elettrofisiotiche, l'uso di shock CC è raccomandato per studi che richiedono dati di elettrofisiologia. È importante notare che la diminuzione dell'intensità del piede può diminuire l'intensità della risposta di volo.

Come indicato nel protocollo, i punteggi di volo vengono calcolati normalizzando i dati sulla velocità durante il rumore di tono e bianco dividendoli con i singoli valori di velocità pre-SCS di prova. Tuttavia, se un mouse presenta livelli estremamente elevati di congelamento durante il pre-SCS, i punteggi di volo risultanti possono essere molto alti, aumentando così la variabilità dei dati. Questo può essere aggirato utilizzando una misurazione di base diversa, come i dati sulla velocità media del periodo di base di 3 minuti all'inizio della sessione o utilizzando la velocità media del pre-SCS complessivo (media di 5 prove), anziché i singoli valori Pre-SCS di prova.

Un adattamento comportamentale flessibile e rapido alla minaccia è fondamentale per la sopravvivenza. La maggior parte dei protocolli classici di condizionamento della paura usano condizioni che inducono il congelamento come unico fattore determinante dell'apprendimento della paura. Il vantaggio di questo protocollo è che consente lo studio di complesse transizioni di stato difensive all'interno dei soggetti. In precedenza, questo modello è stato utilizzato per scoprire che le transizioni comportamentali vengono elaborate da circuiti inibitori ricorrenti locali nell'amigdala^{centrale 15,23}. Questo paradigma ha anche permesso ai ricercatori di chiarire i circuiti cortico-talamici per la selezione del comportamento^{difensivo 21}. Questi studi dimostrano che questo metodo faciliterà gli studi che studiano il controllo del circuito neurale delle transizioni rapide tra i comportamenti difensivi all'interno di un soggetto. Questo ha potenziali applicazioni per sviluppare una migliore comprensione delle basi neurobiologiche di ansia, disturbo di panico o PTSD^24,25.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Louisiana Board of Regents attraverso il Fondo di sostegno del Board of Regents (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) e il National Institute of Mental Health dei National Institutes of Health con il numero di premio R01MH122561. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.