Determinazione spettrofotometrica del contenuto di Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

Qui, presentiamo un protocollo per determinare quantitativamente il contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio Synechocystis utilizzando un metodo spettrofotometrico. La procedura di estrazione è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di alghe e cianobatteri; Tuttavia, a causa delle variazioni negli spettri di assorbimento del pigmento, è necessario testare individualmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.

Si tratta di un semplice protocollo per la determinazione quantitativa del contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio modello Synechocystis. Ficobiliproteine sono i componenti più importanti di ficobilisomi, le antenne di luce-raccolta principali nei cianobatteri e diversi taxa di alghe. I ficobilisomi di Synechocystis contengono due ficobiliproteine: ficocianina e allophycocyanin. Questo protocollo descrive una semplice, efficiente e un metodo affidabile per la determinazione quantitativa di ficocianina e allophycocyanin in questo cianobatterio modello. Abbiamo confrontato i diversi metodi di phycobiliprotein estrazione e quantificazione spettrofotometrica. La procedura di estrazione come descritto in questo protocollo è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di cianobatteri come Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., e Nostoc SP., anche per quanto riguarda le alghe rosse Porphyridium cruentum. Tuttavia, i coefficienti di estinzione di specifici ficobiliproteine da vari taxa possono differire e pertanto, si raccomanda di convalidare il metodo di quantificazione spettrofotometrica per ogni singolo ceppo individualmente. Il protocollo richiede poco tempo e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di scienze biologiche standard poiché si richiede attrezzature solo standard.

fPhycobiliproteins sono complessi pigmento-proteina solubile in acqua che rappresentano i componenti principali delle antenne di luce-raccoglitrici in cellule procariotiche cianobatteri (Cyanophyta) e diversi taxa eucariotiche (Glaucophyta, Rhodophyta e Criptofite)¹. Si presentano principalmente come complessi sopramolecolari chiamati ficobilisomi e sono in genere collegati alla superficie delle membrane fotosintetiche sul lato stromale, ad eccezione di Cryptophyta, dove sono localizzate le ficobiliproteine nella thylakoid lumen². Sono stati identificati quattro tipi di ficobiliproteine fino a Data: allophycocyanin il nucleo e la periferica di ficocianina e ficoeritrina phycoerythrocyanin¹. Come i complessi di raccolta di luce principali, ficobilisomi rappresentano uno dei fattori cruciali di produttività di massa colture di alghe e cianobatteri. È stato dimostrato che il troncamento ficobilisomi può migliorare accumulo di biomassa sotto forte luce³. D'altra parte, sotto modesto o basso irraggiamento, il troncamento dell'antenna ha provocato i tassi di crescita e biomassa accumulo riduzione^3,4. Ficobiliproteine commercialmente sono utilizzati come coloranti per alimenti, prodotti farmaceutici e additivi alimentari, nell'industria cosmetica e come fluorescenza sonde con applicazioni in citometria a flusso, immunodosaggi fluorescente e di microscopia di fluorescenza⁵.

Questo protocollo è centrato sulla determinazione quantitativa di ficobiliproteine nel cianobatterio modello Synechocystis. I cianobatteri sono più presto autotrofi fotosintetici ossigenati; Essi hanno stato formando la biosfera terrestre per più di 2,4 miliardi di anni⁶. Giocano un ruolo cruciale nei cicli biogeochimici globali di azoto, carbonio, ossigeno e altri elementi. Tra i cianobatteri, un ceppo unicellulare Synechocystis guadagnato una posizione unica, poiché era il primo cianobatterio con l'intero genoma sequenziato^7,8, è naturalmente trasformabile da DNA esogeno⁹, e esegue una crescita stabile e relativamente veloce^10,11. In Synechocystis, il componente principale dell'antenna, allophycocyanin, è associato con le proteine integrali di membrana e la ficocianina annesso si trova alla periferia di membrana tilacoidale.

Diversi metodi per phycobiliprotein estrazione e quantificazione sono confrontati all'interno di questo protocollo. La procedura di estrazione finale è stata applicata con successo a Synechocystis, nonché ad altri ceppi di cianobatteri, tra cui Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP.e di Nostoc SP. ed è stato applicato con successo anche alghe rosse Porphyridium cruentum. Pertanto, il metodo sviluppato in questo protocollo può essere considerato come un metodo universale per estrazione phycobiliprotein. Anche se alcuni dei metodi di estrazione testata ha provocato i rendimenti più elevati di proteina totale, qui descritta procedura di estrazione purché il phycobiliprotein più alto produce insieme con il più basso contenuto di clorofilla un residuo nella Estratto di Phycobiliprotein. Riduzione del contenuto di clorofilla un era essenziale per la corretta ficocianina e quantificazione spettrofotometrica allophycocyanin.

Gli spettri di assorbimento di phycobiliprotein può variare significativamente tra varie alghe e cianobatteri specie^{12,13,14,15,16,17} e anche tra i diversi ceppi di un genere di cianobatteri singolo¹⁸. Pertanto, le lunghezze d'onda specifiche e coefficienti di assorbimento come usato per la determinazione della ficocianina e allophycocyanin in Synechocystis non sono generalmente applicabili ad altri ceppi. Inoltre, Synechocystis non contiene ficoeritrina e phycoerythrocyanin che può essere trovato in alcune altre alghe e cianobatteri. Ai fini della determinazione di ficobiliproteine in ceppi diversi da Synechocystis, si raccomanda di valutare singolarmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.

Sebbene il protocollo contiene due passi più lunghi (una notte liofilizzazione del pellet cellulare ed estrazione della proteina 1 ora), il tempo di lavoro totale per la quantificazione di ficobiliproteine è non più di 2 ore.

1. i cianobatteri coltivazione

1. Coltivare cellule Synechocystis in matracci di Erlenmeyer o in fotobioreattori^10,19 a tamponato BG11 medio²⁰ per mantenere un pH di < 10 (ad esempio, utilizzando 17 mM HEPES¹⁰).
   Nota: Condizioni di coltivazione Standard richiedono una temperatura controllata (30 ° C, la temperatura ottimale è in genere, 35 ° C)²¹, illuminazione (in genere, una luce bianca di intensità fino a 800 µmol [fotoni] / [m²p])²¹e un CO alimentazione ₂ (in fotobioreattore di piatto di 400 mL, la crescita saturando la concentrazione di CO₂ è 1.700 ppm)²¹.
2. Per determinare la densità di cultura, misurare la densità ottica di cultura spettrofotometricamente a 730 nm (OD₇₃₀) utilizzando una cuvetta con un percorso ottico di 1 cm. in alternativa, contare le cellule al microscopio usando un emocitometro o una cella automatizzata contatore.

2. preparazione di campioni

1. Lavorare sotto basso irraggiamento per prevenire il degrado phycobiliprotein.
2. Vendemmia: 3 x 1 mL di sospensione di cultura ai tubi di sicurezza bloccaggio. Utilizzare triplici copie per la stima di errori tecnici nella misurazione. Per eseguire il campionamento di cultura in condizioni sterili, raccogliere le cellule in una cappa laminare e seguire le pratiche di lavoro e di sicurezza adeguate.
3. Centrifugare le cellule a 15.000 x g a temperatura di laboratorio per 5 min, prestare attenzione al rotore della centrifuga correttamente bilanciata. Dopo la centrifugazione, eliminare i sovranatante. Essere sicuri di non disturbare il pellet.
4. Mettere i campioni in un congelatore. Per l'archiviazione a lungo termine, conservare i campioni a-80 ° C. Ciò è necessario per evitare la degradazione di phycobiliprotein. Per lo stoccaggio a breve termine, da-20 ° C è sufficiente.
5. Liofilizzare i campioni durante la notte. Per un corretto processo di liofilizzazione, mantenere la temperatura del condensatore liofilizzatore sotto-60 ° C e la pressione nella camera di liofilizzatore intorno 1 hPa.
6. Dopo aver terminato il ciclo di liofilizzazione, chiudere il tubo appena possibile per impedire il riassorbimento di acqua dall'aria.

3. cellula omogeneizzazione e pigmenti di estrazione

1. Aggiungere quattro pezzi di perle di vetro (con un diametro di 2 mm) per ogni provetta e chiudere i tubi.
   Nota: Quando il coperchio del tubo sicuro-blocco utilizzato per omogeneizzazione è troppo sottile, si può rompere durante l'omogeneizzazione; di conseguenza, solo il sicuro-blocco tubi con coperchi forte sono raccomandati per questo protocollo.
2. Omogeneizzare i campioni con i branelli di vetro per 15 s su un omogeneizzatore a temperatura di laboratorio.
   Nota: Un campione correttamente omogeneizzato si sviluppa sulla superficie interna di tutto dei tubi sicuro-blocco.
3. Aggiungere 1 mL di tampone PBS (pH 7,4), preraffreddata a 4 ° C, per i campioni al fine di estrarre ficobiliproteine.
   Nota: Da questo punto, mantenere i campioni sul ghiaccio per prevenire la degradazione delle proteine estratte. Questo è fondamentale.
4. Mescolare i campioni con PBS per 5 s sull'omogeneizzatore a temperatura di laboratorio.
   Nota: Dopo la miscelazione, i campioni sono verdastri.
5. Dopo la miscelazione, mantenere i campioni su ghiaccio per 60 min. copertura del bagno di ghiaccio con un coperchio per evitare il degrado di pigmenti.
6. Dopo 60 min di phycobiliprotein estrazione, centrifugare i campioni a 15.000 x g a 4 ° C per 5 min, prestare attenzione a bilanciare correttamente il rotore della centrifuga.
   Nota: Dopo la centrifugazione, il sovranatante ha un colore blu ciano.

4. Phycobiliprotein quantificazione

1. Prima della misurazione spettrofotometrica, calibrare lo spettrofotometro alla linea di base utilizzando il tampone PBS come uno spazio vuoto.
2. Una volta lo spettrofotometro è calibrato, scartare il PBS da una cuvette spettrofotometro e pipettare il surnatante con estratti ficobiliproteine anziché con il buffer scartato.
3. Quantificare la concentrazione di phycobiliprotein spettrofotometricamente, utilizzando una larghezza di fessura di 0,5 nm.
   1. Misurare l'assorbanza di phycocyanobilins in ficocianina e allophycocyanin contro il tampone PBS in bianco a 615 nm (un₆₁₅) e 652 nm (un₆₅₂), rispettivamente, e misurare l'assorbanza di detriti cellulari a 720 nm (un₇₂₀).
   2. Calcolare la concentrazione di ficocianina e allophycocyanin secondo le equazioni (1) e (2) di Bennett e Bogorad¹²:
      
      
      Nota: Un₆₁₅, un₆₅₂e un₇₂₀ dovrebbe adattarsi alla gamma lineare assorbanza dello spettrofotometro. Se necessario, diluire il campione con il tampone PBS.
4. Ricalcolare la concentrazione di pigmento nei campioni originali. La concentrazione di pigmento nel campione corrisponde direttamente con i risultati delle equazioni (1) e (2) quando 1 mL di coltura e 1 mL di tampone di estrazione vengono utilizzati per l'analisi. In caso di utilizzo di diversi volumi di campioni di cianobatteri e/o tampone PBS, la concentrazione di pigmento finale deve essere calcolata secondo l'equazione (3):
   (3)
   Nota: In caso di un contenuto di phycobiliprotein normalizzante per peso a secco delle cellule, la concentrazione di pigmento finale dovrebbe essere calcolata secondo equazione (4) (4)

5. determinazione del peso secco cellulare (opzionale)

1. Pesano tre tubi vuoti di sicurezza bloccaggio su bilance analitiche.
   Attenzione: È fondamentale che i tubi di sicurezza bloccaggio siano asciutti. In caso di immagazzinare i tubi in un ambiente umido, asciugare i tubi per diverse ore in un essiccatore prima della pesatura loro congelamento. Manipolare le provette delicatamente e solo con i guanti senza polvere per evitare qualsiasi contatto tra il materiale e le dita del ricercatore. Tenere tutti i sostegni e centrifugare pulite per evitare il trasferimento di qualsiasi materiale per i tubi.
2. Esempio 1 x 15 mL di sospensione per provetta conica da 15 mL.
3. Centrifugare la sospensione di cultura nelle provette coniche da 15 mL a 4.000 x g a temperatura di laboratorio per 10 min. bilanciamento del rotore della centrifuga con tre ulteriori provette coniche da 15 mL, ciascuna contenente 15 mL di acqua. Dopo la centrifugazione, scartando 12 mL di surnatante.
4. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente e trasferire 3 x 1 mL di miscela a tre tubi di sicurezza bloccaggio 1,5 mL con una pipetta. Nel caso in cui alcuni avanzi del pellet rimangono nel tubo conico da 15 mL, aggiungere 1,5 mL di acqua deionizzata al tubo conico, vortice o agitare il tubo per risospendere il restante a pellet e trasferire i tre tubi di sicurezza bloccaggio di 1,5 mL (già containi 3 x 0,5 mL della miscela ng 3 x 1 mL del pellet) con una pipetta.
   Nota: Dividendo il pellet sopra tre tubi di sicurezza bloccaggio 1,5 mL consentirà la stima di qualsiasi errore tecnico di misura il peso a secco.
5. Centrifugare le cellule in 1,5 mL sicuro-blocco tubi a 15.000 x g a temperatura di laboratorio per 5 min, equilibrio del rotore della centrifuga con un tubo di sicurezza bloccaggio 1,5 mL aggiuntivo contenente 1 mL di acqua. Dopo la centrifugazione, eliminare i sovranatante.
6. Mettere i campioni nel congelatore. Per l'archiviazione a lungo termine, conservare i campioni a-80 ° C; per la memorizzazione a breve termine, da-20 ° C è sufficiente.
7. Liofilizzare i campioni durante la notte. Per un corretto processo di liofilizzazione, mantenere la temperatura del condensatore asciugatrice congelamento sotto-90 ° C e la pressione nella camera di liofilizzatore intorno 1 hPa.
8. Dopo liofilizzazione, chiudere le provette e pesare i campioni su bilance analitiche.
   Nota: Il valore di peso a secco può essere utilizzato per la normalizzazione del contenuto phycobiliprotein al peso a secco delle cellule.

Per i test di metodo iniziale, Synechocystis era coltivata come batch colture in matracci di Erlenmeyer su un agitatore BG11 coltivazione medio²⁰ (completati con 17 mM HEPES) a 25 ° C, sotto una luce bianca calda di un'intensità di 50 µmol (fotoni) / (m p ²) e con 1% di CO₂ nell'atmosfera coltura. Durante la coltivazione, le culture sono state campionate a sicuro-blocco tubi e centrifugati (15.000 x g a temperatura di laboratorio per 5 min), il surnatante è stato scartato, e i campioni sono stati conservati a-80 ° C sia liofilizzati come preparazione per la singoli passaggi del presente protocollo o conservati a-20 ° C o da-80 ° C per l'analisi comparativa di estrazione e quantificazioni.

Le procedure di estrazione testata incluse distruzione cellulare tramite sonicazione, omogeneizzazione con microsfere di zirconio all'interno del tampone PBS e congelamento-scongelamento. I risultati di metodi di estrazione differenti sono riassunti nella Figura 1. Il metodo descritto all'interno di questo protocollo fornito che il più alto ficobiliproteine produce insieme con il più basso clorofilla una contaminazione nel buffer dell'estrazione. Clorofilla a è stato rilevato nel buffer dell'estrazione quando sonicazione è stato utilizzato per la rottura delle cellule. Ripetuti cicli di congelamento e scongelamento i campioni in un bagno ad ultrasuoni su ghiaccio ha provocato rendimenti più elevati di proteina nel tampone di estrazione. Tuttavia, allo stesso tempo, la concentrazione di clorofilla nel buffer dell'estrazione aumentata (Figura 1 inserto), che ha escluso una quantificazione del contenuto di phycobiliprotein corretto.

Il tempo ottimale omogeneizzazione era di 15 s. omogeneizzazione per entrambi più brevi (5 s) e più a lungo (20 s) previsti periodi rese phycobiliprotein leggermente inferiori, come mostrato nella Figura 2. Omogeneizzazione delle cellule con perle di vetro di diametro di 2 mm ha provocato i più alti rendimenti se confrontato con i branelli di vetro di diametro di 0,5 mm, 1 mm o 4 mm, con microsfere di zirconio di un diametro di 0,5 mm o con grani di sabbia del mare. Il tampone di estrazione di PBS è stato testato come il buffer ottimo per l'estrazione di ficobiliproteine (Figura 3). L'aggiunta di NaCl 100 mM o 150 mM KCl il tampone PBS oppure all'acqua non ha aumentato l'efficienza di estrazione di phycobiliprotein, e lo stesso è andato per l'utilizzo di soluzione tampone sodio acetato 20 mM per l'estrazione (Figura 3). Il tempo di estrazione ottimale phycobiliprotein era 60 minuti perché, dopo più tempo (fino a 240 minuti), la concentrazione di phycobiliprotein nel buffer dell'estrazione non è cambiato significativamente (Figura 4).

Abbiamo anche testato la gamma di linearità di spettrofotometro per la misura di phycobiliprotein (Figura 5) e confrontato diverse equazioni di phycobiliprotein quantificazione, utilizzando sia la ficocianina e allophycocyanin standard (Figura 6). Lo spettrofotometro utilizzato nel presente protocollo hanno mostrato una gamma di assorbanza lineare tra 0.1 - 3.0 (Figura 5). Poiché gli spettri della proteina estrarre ha avuto suo assorbimento massimo circa 620 nm (A.₆₂₀) e a 652 nm, l'assorbimento (un₆₅₂) era solo il 33% di un₆₂₀ (Figura 7), la linearità di spettrofotometro per un₆₅₂ (massimo assorbanza allophycocyanin) è stato testato solo fino a un₆₅₂ di 1.16. Le equazioni (1) e (2) di Bennett e Bogorad¹² fornito la migliore ricostruzione delle norme sia ficocianina e allophycocyanin tra tutte le equazioni testate (Figura 6). Solfato di streptomicina, utilizzato in parecchi studi precedenti per l'eliminazione della membrana frammenti contenenti clorofilla a, è stato indicato come non necessari per l'estrazione (Figura 7).

Per l'esperimento rappresentativo, Synechocystis veniva coltivato in un fotobioreattore²⁵ in un regime di turbidostat, dove le cellule sono state mantenute in fase di crescita esponenziale entro un intervallo definito di densità ottica (misurata a 680 nm, OD ₆₈₀) da una diluizione controllata da un fresco coltivazione medio (medio BG11 tamponata con 17 mM HEPES)^11,26. Le colture erano coltivate a 32 ° C e l'aria ingresso contenuto 0,5% CO₂. Le culture sono state illuminate con una luce rossa (λ_max: 633 nm, λ_1/2: 20 nm) di intensità pari a 25-1100 µmol (fotoni) / (m²p.), insieme con una luce blu (λ_max: 445 nm, λ_1/2: 20 nm) di un'intensità di 25 µmol ( fotoni) / (m²p). La densità ottica della sospensione cultura è stata misurata dalla base fotobioreattore, e la gamma del OD₆₈₀ è stata impostata a 0,52 - 0,58 (2 x 10⁷ a 4 x 10⁷ cellule/mL). Le culture sono state coltivate sotto ogni specifica intensità della luce per almeno 24 ore per fornire tempo sufficiente per acclimatazione. Dopo aver raggiunto la stabilità di crescita, le culture sono state campionate per peso a secco (secondo step 2.1-2.8 di questo protocollo), conteggio delle cellule e ficocianina e allophycocyanin contenuti. I risultati della valutazione phycobiliprotein sotto la crescente intensità di luce sono mostrati in Figura 8. Synechocystis ha fatto diminuire il contenuto di phycobiliprotein dal 12% del peso secco cellulare (505 fg/cella) sotto l'irraggiamento minimo al 3% del peso secco cellulare (280 fg/cella) sotto l'irraggiamento più alto.

Figura 1 : Confronto tra l'efficienza di estrazione del metodo descritto in questo protocollo con diversi metodi di riferimento. La concentrazione di ficocianina (barre nere) e allophycocyanin (barre bianche) nell'estratto di proteina grezza è stata misurata dopo estrazione nel tampone PBS per 60 min. il metodo A è descritto all'interno di questo protocollo. Metodo B è modificato come segue: dopo la raccolta, le cellule erano centrifugato (15.000 x g a temperatura di laboratorio per 5 min) e conservati a-20 ° C durante la notte. I campioni congelati sono stati sonicati per 120 s a 4 ° C e le ficobiliproteine sono stati estratti in tampone PBS per 60 min. Metodo C è stato modificato dal metodo B memorizzando il pellet di cellule prelevate a-80 ° C per 30 min, liofilizzazione il pellet cellulare e aggiungendo il tampone di lavaggio per i pellet asciutti. Metodo D è stato modificato da Chung et al. ¹⁶: dopo liofilizzazione (stesso come metodo C), 0,25 mL di acetato di Na con 1% streptomicina solfato soluzione tampone (pH 5.5) è stato aggiunto al pellet cellulare asciutto, insieme a 0,25 mL di perline di zirconio (con un diametro di 0,5 mm), e i campioni sono stati omogeneizzati due volte per 60 s sull'omogeneizzatore. Dopo omogeneizzazione, un altro 0,5 mL di acetato di Na con tampone di solfato di streptomicina 1% (pH 5.5) è stato aggiunto al campione, i tubi erano agitati con vortex e le proteine sono state estratte sul ghiaccio per 30 min. Metodo E consisteva di un singolo ciclo di congelamento-scongelamento in tampone PBS e estrazione di proteine per 24 h a 4 ° C. Metodo F (figura inserto) ha consistito di uno e sei cicli di congelamento delle cellule (inizialmente, liofilizzati e risospesi in tampone PBS) in azoto liquido, seguita da sonicazione sul ghiaccio. A causa di significativi clorofilla una presenza nell'estratto di proteina grezza, la ficobiliproteine non sono stati quantificati nel metodo F. I valori raffigurati rappresentano medie da tre replicati tecnici, con le barre di errore che rappresentano deviazioni standard. Le concentrazioni di pigmento sono state calcolate secondo le equazioni (1) e (2) del presente protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Effetto del tempo omogeneizzazione sull'efficienza di estrazione phycobiliprotein. I pellet liofilizzati di Synechocystis cellule (secondo passi 3.1-3.5 del presente protocollo) sono stati interrotti con perline di vetro su omogeneizzatore per 5 s, 15 s e 20 s. I valori raffigurati rappresentano medie da tre replicati tecnici, con le barre di errore che rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Phycobiliprotein efficienza di estrazione nei vari buffer di estrazione. Le ficobiliproteine sono stati estratti nel tampone PBS il tampone PBS con un'aggiunta di NaCl 100 mM o 150 mM KCl, in acqua deionizzata con NaCl 100 mM o 150 mM KCl, secondo Melman e Ferrara²²e in acetato di sodio 20 mM secondo Chung et al. < / C4 >. ¹⁶. l'estrazione è stata eseguita a 4 ° C secondo la procedura 4.1-4.3 del presente protocollo. I valori raffigurati rappresentano medie da tre replicati tecnici, con le barre di errore che rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Phycobiliprotein stabilità nel buffer dell'estrazione in tempo. Dopo la procedura di estrazione, effettuata come descritto ai punti 4.1-4.3 del presente protocollo, l'Estratto di phycobiliprotein in tampone PBS (pH 7,4) è stato conservato a 4 ° C fino a 4 ore, senza significativa ficocianina (cerchi) e degradazione di allophycocyanin (piazze). La linea tratteggiata rappresenta la misura lineare dei punti tempo calcolata con il metodo dei minimi quadrati. I valori raffigurati rappresentano medie da tre replicati tecnici, con le barre di errore che rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Misurazioni rappresentative delle concentrazioni di ficocianina e allophycocyanin in Synechocystis. Una sospensione di cultura densa (ficocianina: 456 µ g/mL, allophycocyanin: 106 µ g/mL) è stata diluita gradualmente fino ad una concentrazione di 19 µ g/mL per entrambi ficocianina e allophycocyanin. I valori raffigurati rappresentano medie da tre replicati tecnici, con le barre di errore che rappresentano deviazioni standard. La linea tratteggiata rappresenta la misura lineare dei punti di concentrazione calcolata con il metodo dei minimi quadrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : La stima delle concentrazioni di ficocianina e allophycocyanin in standard di pigmenti. Il contenuto di ficocianina e allophycocyanin in standard di pigmento è stato misurato spettrofotometricamente secondo le equazioni di Bennett e Bogorad¹², Lüder et al. ¹³, Sampath-Wiley e Neefus¹⁵, Evans¹⁴e Chung et al. ¹⁶. contenuto proteico delle norme (come necessario per la determinazione di ficobiliproteine) è stato quantificato utilizzando una soluzione di acido bicinconinico, carbonato di sodio, tartrato di sodio e bicarbonato di sodio in 0,1 N NaOH (con un pH finale di 11,25), in reazione con 4% (p/v) di rame (II) solfato pentaidrato²⁷, utilizzando albumina di siero bovino come una proteina standard. Le equazioni di Bennett e Bogorad fornito la ricostruzione più alta di due pigmenti: 96% della ficocianina standard e il 99% di allophycocyanin standard. I valori raffigurati rappresentano medie da tre replicati tecnici, con le barre di errore che rappresentano deviazioni standard. La linea tratteggiata evidenzia il punto 100%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : L'effetto del solfato della streptomicina sullo spettro di assorbimento della proteina grezza dell'estratto nel tampone PBS. Procedura (A) l'estrazione come descritto ai punti 4.1-4.3 di questo protocollo o (B) mediante sonicazione, come descritto nella legenda della Figura 1 per il metodo F è stato effettuato in tampone PBS (cerchi) e in tampone PBS supplementato con 1% solfato di streptomicina (piazze). La quantificazione di phycobiliprotein è stata eseguita secondo passi 5.1-5.4 del presente protocollo. I valori raffigurati rappresentano medie da tre replicati tecnici, con le barre di errore che rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8 : Concentrazione di ficocianina (cerchi) e allophycocyanin (piazze) in Synechocystis coltivata sotto la luce rosso-arancio di un'intensità di µmol(photons)/(m2·s) 25-1100. Synechocystis culture sono state coltivate in un fotobioreattore a 32 ° C, con 0,5% CO₂ nell'aria ingresso, nel medium di coltivazione BG11 completati con 17 mM HEPES in un regime di turbidostat secondo Zavrel et al. ¹¹. le concentrazioni di phycobiliprotein sono state misurate secondo questo protocollo e il contenuto di phycobiliprotein finale è stato normalizzato per cellulare di peso secco, come descritto nella sezione 2 del presente protocollo. Le linee tratteggiate rappresentano la misura della potenza dei punti misurati, calcolata con il metodo dei minimi quadrati. I valori raffigurati rappresentano medie da tre replicati tecnici, con le barre di errore che rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo descrive un metodo semplice, veloce e riproducibile per la quantificazione del contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio modello Synechocystis. Diversi metodi di omogeneizzazione delle cellule, estrazione di proteine e quantificazione di ficocianina e allophycocyanin vengono confrontati e protocollo finale rappresenta una combinazione della procedura ottima di ogni singola procedura. Come dati rappresentativi, il contenuto di ficobiliproteine è stato quantificato in Synechocystis cellule sotto la crescente intensità della luce. Anche se l'analisi richiede tempo simile e apparecchiature di laboratorio alcuni dei metodi precedentemente pubblicati^{12,13,14,15,16}, il vantaggio di questo protocollo è che nessun clorofilla a è rilasciata il tampone di estrazione e, quindi, la misura di phycobiliprotein può essere stimata con alta precisione.

La quantità di sospensione cellulare necessari per l'analisi di phycobiliprotein può variare con la densità di cultura. Il volume di campione da 1 mL è ottimizzato per le culture con un OD₇₃₀ di 1.5, una densità di cella di circa 2 x 10⁷ cellule/mL, o per le culture con un contenuto di phycobiliprotein di circa 20 mg/L. Nel caso di culture diluite, raccogliere un più grande volume di cultura. D'altra parte, nel caso di culture dense, raccogliere una cultura più basso volume-in culture ad alta densità, c'è un rischio che ficobiliproteine rimangono parzialmente nelle cellule dopo l'estrazione. Allo stesso modo, la quantità di sospensione cellulare necessaria per la determinazione del peso secco può variare con la densità di cultura. Il volume di campionamento di 15 mL è ottimizzato per le culture con un OD₇₃₀ di 1,5 o con una densità di cella di circa 2 x 10⁷ cellule/mL. Con le culture di densità inferiore o con volumi inferiori, può aumentare l'errore di misurazione. Al contrario, più grandi volumi di coltura o più dense culture forniscono migliore metodo risoluzioni.

Fasi critiche del protocollo sono l'estrazione di omogeneizzazione e phycobiliprotein cella che dovrebbe fornire rendimenti elevati sia alta specificità. La massima resa e purezza degli estratti con conservazione simultanea massima della proteina è stata realizzata da liofilizzazione i campioni, omogeneizzare il pellet cellulare secco dai branelli di vetro ed esegue l'estrazione di phycobiliprotein in tampone PBS ( Figura 1). Dal momento che anche una piccola contaminazione dell'estratto di clorofilla una proteina grezza può portare ad una sovrastima del contenuto di phycobiliprotein, è necessario evitare qualsiasi estrazione clorofilla un aggiungendo il tampone PBS. Clorofilla a è stato rilevato in greggio estratto quando la sonicazione è stato usato per distruzione cellulare. Come mostrato nella rientranza della Figura 1, con ripetuti cicli di sonicazione, la quantità di clorofilla nell'estratto è aumentato. D'altra parte, la quantità di estratti di proteine (come rilevato dall'assorbanza a 280 nm) è aumentato anche dopo ripetuti cicli di sonicazione. Pertanto, l'uso di sonicazione (in combinazione con cicli di congelamento-scongelamento in azoto liquido) appare come un metodo adatto per estrazione della proteina totale (libera e membrana-limiti le proteine vengono rilasciate dalle cellule); Tuttavia, non è consigliabile ai fini della quantificazione spettrofotometrica phycobiliprotein. Chung et al. consigliato l'uso del solfato di streptomicina 1% per eliminare frammenti di membrana con clorofilla a¹⁶. Qui, l'uso del solfato di streptomicina non sembrava essere necessario poiché non ha portato ad una riduzione della clorofilla nell'estratto della proteina (Figura 7). Anche se un singolo sonicazione ciclo per 120 s non ha rovinato le cellule in modo efficiente (metodi B e C, Figura 1), altri metodi (ad es., metodo F come presentato nella Figura 1 o i metodi presentati in figura 7B) confermato risultati precedenti di sonicazione essendo un efficiente cella perturbazione metodo^22,28. D'altra parte, semplici cicli gelo-disgelo, anche precedentemente segnalati come un metodo efficiente per ficobiliproteine estrazione^22,28, fornito i rendimenti più bassi nelle prove descritte qui (metodo E, Figura 1 ). Cella di omogeneizzazione (all'interno del buffer di estrazione, 2 x 60 s) di zirconio perline è stato testato come meno efficiente l'omogeneizzazione di 15-s del pellet cellulare liofilizzato (metodo D, Figura 1). La procedura di omogeneizzazione all'interno del buffer di estrazione è stato descritto in precedenza con una maggiore omogeneizzazione tempo (10 min)²⁹. Non abbiamo provato l'omogeneizzazione per più di 2 min dai campioni riscaldato significativamente durante ogni ciclo di omogeneizzazione. Nella letteratura, altri metodi di rottura delle cellule inoltre sono stati descritti, compreso l'utilizzo di una pressa francese¹⁶ o griding^13,15,30; Tuttavia, tali metodi non sono stati testati in questo studio.

L'estrazione di proteine è stato effettuato per 15 s (Figura 2) in tampone PBS. Il pH del tampone era 7.4, che è stato segnalato precedentemente come ottimale per phycobiliprotein estrazione²². L'aggiunta di NaCl o KCl non ha migliorato l'efficienza di estrazione di phycobiliprotein (Figura 3), che sta contraddicendo la precedente osservazioni²². Tuttavia, come indicato nella Figura 3, la soluzione salina tampone fosfato come utilizzato nel presente protocollo contenuto 154 mM NaCl (oltre 5,6 mM Na₂HPO₄ e 1 mM KH₂PO₄), che non ci permettono di stabilire la Privo di NaCl tampone PBS estrazione come controllo. Abbiamo confrontato anche tampone PBS e sodio acetato buffer¹⁶ estrazione efficienza. La combinazione di fosfato di sodio e fosfato di potassio all'interno del buffer di PBS fornito ficobiliproteine più elevati rendimenti (Figura 3). Ciò che trova ha corrisposto con i risultati precedenti di Noi2incoppia et al. ²².

Il tempo di estrazione di phycobiliprotein è stato ottimizzato per 1 h. estrazione più lungo non ha portato a significativi phycobiliprotein degradazione o estrazione miglioramento (Figura 4), che corrispondeva con il precedente lavoro di Lawrenz et al. ²⁸. un tempo di estrazione più breve di 1 h non è stato testato. Allo stesso modo, estrazione per più di 4 h non è stato testato dal momento che è stato trovato in precedenza che i ficobiliproteine estratti nel buffer fosfato sono stabili per almeno 48 h²⁸.

Abbiamo confrontato diverse equazioni di quantificazione spettrofotometrica ficocianina e allophycocyanin come descritto precedentemente nella letteratura, ricalcolando il contenuto di entrambi ficobiliproteine in standard commerciali con proteina nota concentrazioni (Figura 6). La migliore ricostruzione di due pigmenti è stata realizzata con le equazioni di Bennett e Bogorad¹². Questo risultato non era specifico per il fosfato tampone di estrazione poiché tale buffer è stato utilizzato in precedenza^12,13,15. Nessuno dei due era specifico per gli standard di pigmento poiché la differenza tra un₆₁₅, un₆₁₈e un₆₂₀ (lunghezze d'onda utilizzate per la stima della ficocianina nei lavori precedenti) nella ficocianina standard era 1% e la differenza tra un ₆₅₀ e un₆₅₂ (lunghezze d'onda utilizzato in precedenza per allophycocyanin stima^12,13,14,16) nella allophycocyanin standard era 3%. Allo stesso modo, la differenza tra un₆₁₅ e un₆₂₀ nell'estratto proteico di Synechocystis era solo il 2%. Tali piccole differenze negli spettri di assorbimento non possono comportare una variazione di pigmento finale fino al 36% (Figura 6). Pertanto, le differenze tra le singole equazioni erano piuttosto connessi alle variazioni di coefficienti di estinzione phycobiliprotein di organismi specifici^{12,13,14, 15 , 16 , 17}. è interessante notare che, le equazioni di Chung et al. anche se gli autori hanno usato anche Synechocystis per loro esperimenti¹⁶, fornito la ricostruzione più bassa di ficocianina (Figura 6).

Invece la determinazione delle lunghezze d'onda singola, si consiglia di misurare uno spettro continuo dell'estratto di phycobiliprotein fra 280-720 nm, per stimare la presenza di clorofilla nell'estratto, che poteva interferire con entrambi i allophycocyanin e l'assorbimento di ficocianina. Inoltre, misurando l'assorbanza a 280 nm (A₂₈₀), una purezza di entrambi ficocianina (un₆₁₅/A₂₈₀ o un₆₂₀/A₂₈₀)^21,22 e allophycocyanin (un /A₆₅₂₂₈₀) ²⁴ entro l'estratto può essere stimato (0,7: commestibile, 3.9: grado reattiva, > 4.0: grado analitico)²¹.

Come dati rappresentativi, è stata determinata la concentrazione di ficocianina e allophycocyanin in Synechocystis sotto la crescente intensità della luce. Mantenere la densità di cultura ad un livello costante all'interno di un regime di coltivazione turbidostat^11,21 era essenziale per l'esperimento comparativo diretto. Le concentrazioni di ficocianina e allophycocyanin del 2,4% - 10,2% e 0,6% - 1,7% del peso secco cellulare, rispettivamente, erano simili come i valori precedentemente segnalati^11,31,32. Inoltre, la base per cella contenuto phycobiliprotein era simile come riferito precedentemente^11,33. Con la luce crescente, il contenuto di ficobiliproteine diminuito. È interessante notare che, anche sotto la massima intensità di luce di 1100 µmol (fotoni) / (m²p.), le ficobiliproteine non erano completamente sbiancato.

Poiché il protocollo richiede attrezzature solo standard ed è relativamente veloce, può essere facilmente adottato in tutti i laboratori in cui ficobiliproteine ordinariamente sono analizzati.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo è stato adottato da una precedente pubblicazione¹¹. T. Z., ch. D. e J. Č. sono stati sostenuti dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e dello sport della Repubblica Ceca all'interno del programma di sostenibilità nazionale ho (NPU ho), concedere il numero LO1415. J. Č. fu appoggiato anche dal GA CR, concessione numero 18-24397S. Accesso a strumenti e altre strutture è stata sostenuta dall'infrastruttura di ricerca ceco per la biologia dei sistemi C4SYS (non progetto LM2015055). M. A. S. è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Fondazione scienza russa [n. 14-14-00904].