Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di

Qui si descrive un protocollo per l'estrazione di metaboliti da Staphylococcus aureus e la loro successiva analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa.

Nel tentativo di contrastare i batteri patogeni, ospita spesso limitano la disponibilità di nutrienti nel sito di infezione. Questa limitazione può alterare le abbondanze dei metaboliti principali alle quali fattori regolatori rispondono, regolando il metabolismo cellulare. Negli ultimi anni, un certo numero di proteine ​​e RNA sono emersi come importanti regolatori dell'espressione genica virulenza. Ad esempio, la proteina CODY risponde a livelli di amminoacidi ramificati e GTP ed è ampiamente conservato in basso G + C batteri Gram-positivi. Come regolatore globale Staphylococcus aureus, Cody controlla l'espressione di decine di virulenza e geni metabolici. Ipotizziamo che S. aureus utilizza Cody, in parte, per alterare il suo stato metabolico nel tentativo di adattarsi alle condizioni di nutrienti limitativo potenzialmente presenti nell'ambiente ospitante. Questo manoscritto descrive un metodo per l'estrazione e l'analisi metaboliti da S. aureus mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massaspettrometria, un protocollo che è stato sviluppato per verificare questa ipotesi. Il metodo evidenzia anche migliori pratiche che garantiranno rigore e riproducibilità, come il mantenimento stato stazionario biologica e costante aerazione senza l'uso di colture chemostato continue. Rispetto alle USA200 meticillina-sensibili S. aureus isolare UAMS-1 ceppo parentale, il isogenico CODY mutante esposto aumenti significativi amminoacidi derivati da aspartato (ad esempio, treonina e isoleucina) e diminuisce nei loro precursori (ad esempio, aspartato e O -acetylhomoserine ). Queste scoperte correlano bene con i dati trascrizionali ottenuti con l'analisi di RNA-seq: geni in questi percorsi sono up-regolata tra 10 e 800 volte nel mutante nullo Cody. Accoppiamento analisi globali del trascrittoma e il metaboloma può rivelare come i batteri alterano il loro metabolismo di fronte a stress ambientale o nutrizionale, permettono di approfondire il potenziale nelle Physmodifiche iological associati a esaurimento degli elementi nutritivi sperimentato durante l'infezione. Queste scoperte possono aprire la strada per lo sviluppo di nuovi agenti anti-infettivi e terapeutica.

batteri patogeni devono affrontare molte sfide all'interno dell'ambiente host. Oltre a attacco diretto da parte delle cellule immunitarie, l'host sequestra anche nutrienti essenziali per la sopravvivenza batterica e la replicazione, generando immunità nutrizionale ^{1, 2.} Per sopravvivere a questi ambienti ostili, batteri patogeni distribuire fattori di virulenza. Alcuni di questi fattori permettono ai batteri di eludere la risposta immunitaria; Altri fattori includono secreti enzimi digestivi, come ialuronidasi, termonucleasi, e lipasi, che possono permettere ai batteri di riempire le sostanze nutrienti mancanti consumando costituenti derivate dal tessuto ^{3, 4, 5.} Infatti, i batteri hanno sviluppato sistemi regolatori che legano lo stato fisiologico della cella per la produzione di fattori di virulenza ^{6, 7,} up class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

Un crescente corpo di evidenze indica Cody come un regolatore fondamentale che collega il metabolismo e virulenza. Sebbene scoperto nel Bacillus subtilis come repressore del gene ¹¹ dipeptide permease (DPP), Cody è ormai noto per essere prodotto da quasi tutti i bassi batteri G + C Gram-positivi ^{12, 13} e regola decine di geni coinvolti in carbonio e azoto metabolismo ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} In specie patogene, Cody controlla anche l'espressione di alcuni tra i più importanti geni di virulenza ^{20, 21,}. ef "> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} Cody è attivata come una proteina legante il DNA da due classi di ligandi: amminoacidi ramificati (BCAA, isoleucina, leucina e valina [ILV]) e GTP . Quando questi nutrienti sono abbondanti, Cody reprime (o in alcuni casi, stimola) trascrizione. Poiché questi nutrienti diventano limitato, attività Cody è progressivamente ridotto, con conseguente risposta trascrizionale graduata che ri-rotte precursori attraverso varie vie metaboliche legate al metabolismo centrale ^{28, 29, 30.}
Tandem cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) è una tecnica potente che può identificare accuratamente e quantificare piccole molecole metaboliti intracellulari ^31. Quando è accoppiato con transcAnalisi riptome (ad esempio, RNA-Seq), questo flusso di lavoro di analisi in grado di fornire una conoscenza delle cambiamenti fisiologici che si verificano in risposta a stress ambientale o nutrizionale. Qui, presentiamo un metodo per l'estrazione metabolita da cellule di Staphylococcus aureus e successiva analisi mediante LC-MS. Questo approccio è stato utilizzato per dimostrare gli effetti pleiotropici di Cody su S. aureus fisiologia.

1. Preparazione del Buffer Solutions

1. Preparare salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) diluendo una soluzione stock di 10x PBS ad una concentrazione finale di 1x con ultrapura (distillata e deionizzata) acqua.
2. Preparare la soluzione quenching combinando 2 mL di acetonitrile, 2 mL di metanolo, 1 mL di H ₂ O ultrapura, e 19 microlitri (0,1 mM di concentrazione finale) di acido formico.
3. Preparare LC-MS solvente A per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale) per acqua ultrapura.
4. Preparare LC-MS solvente B per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale) per acetonitrile.
   NOTA: Tutte le soluzioni dovrebbero essere preparate utilizzando i reagenti più alto grado di purezza disponibile (in genere ad alte prestazioni di prima scelta cromatografia liquida). Le soluzioni devono essere preparate fresco prima di ogni esperimento e conservati in ghiaccio prima dell'uso.

2. Istituzione di steady-state S. aureus Crescita

1. Streak S. aureuceppi s di interesse per l'isolamento sul Tryptic Soy Agar (TSA) da uno stock di glicerolo congelato. Incubare a 37 ° C per 16-24 h.
2. Seminare 4 mL di brodo Tryptic Soy (TSB) o altro mezzo idoneo in provette di incubazione vetro sterili con singole colonie di ciascun ceppo. Incubare inclinata (~ 70 ° angolo) con rotazione a 60 giri al minuto (rpm) a 37 ° C per 16-20 ore.
   NOTA: culture di notte sono inclini a gradienti di ossigeno utilizzando metodi standard, comprese quelle descritte nella fase 2.2, che influenzano fisiologia cellulare. Così, ci avvaliamo di una strategia multipla back-diluizione al fine di garantire a regime biologico (vedere i passi 2.4-3.2, di seguito).
3. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica delle colture dal punto 2.2 a 600 nm (OD _600). Utilizzare mezzo sterile come riferimento ottico (vuoto). Diluire le cellule ad una OD ₆₀₀ di 0,05 a 50 ml di terreno TSB sterile (preriscaldata a 37 ° C) in separato, 250 mL DeLong fiaschi.
4. incubate le colture a 37 ° C in un bagno d'acqua con agitazione a 280 rpm.
5. Ogni 30 minuti, prendere OD ₆₀₀ misurazioni; all'aumentare delle densità ottiche, può essere necessario diluire le culture con TSB modo che rimangano nell'intervallo assorbanza lineare dello spettrofotometro.
6. Quando le culture dal punto 2.5 raggiungono un OD ₆₀₀ di ~ 0.8-1.0, li subcoltura in 50 ml di 37 ° C TSB ad un OD ₆₀₀ di 0,01-0,05 e ripetere i punti 2.4 e 2.5.

Setup Collection 3. Il campione

1. Preparare un letto di ghiaccio secco tritato in un recipiente appropriato (ad esempio, vetro piatto, ghiaccio, o raffreddamento).
2. Poiché le densità ottiche delle culture avvicinano al punto di raccolta desiderata, aggiungere 1 ml di soluzione di tempra 35 mm greggia Petri e pre-raffreddamento in ghiaccio secco per ≥5 min.
   NOTA: Il "punto di raccolta desiderato" varierà a seconda degli obiettivi sperimentali. Ad esempio, se si dovesse verificare metabolites durante la crescita aerobica, indicatori chiave di questo stato includono escrezione acetato e ri-assimilazione del acetato durante la fase di crescita post-esponenziale ^{32, 33.} Generalmente, questo punto dovrebbe essere all'interno di una fase di crescita specifico (ad esempio, fase esponenziale). Le specifiche OD ₆₀₀ valori associati a questo stadio può variare tra i diversi ceppi batterici e mezzi di crescita.
3. Posizionare una fritta filtro in acciaio inox (pre-raffreddata a -20 ° C) in un tappo di gomma e posizionarlo in cima una beuta da vuoto collegata ad un vuoto casa o pompa a vuoto.
4. Applicare il vuoto e posizionare un misto estere di cellulosa membrana (0,22 um dimensione dei pori) sulla parte superiore.
   NOTA: È fondamentale utilizzare un filtro con un diametro uguale a quello della fritta e per centrare correttamente questo filtro per garantire che il campione viene fatto passare attraverso il filtro, piuttosto che sul bordo. Bagnare la membrana con ghiacciata, H ₂ O sterile può aiutarecon il posizionamento della membrana.

4. Esempio Harvest

1. A un OD ₆₀₀ di ~ 0,4-0,5, utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere 13 ml di coltura dal pallone e di applicare il campione al filtro.
2. Dopo che l'intero campione è stato filtrato, immediatamente lavare il filtro con ≥5 mL di PBS ghiacciato per lavare via metaboliti medie associata.
3. Scollegare il vuoto e usare un paio di pinzette sterili per rimuovere il filtro dal fritta. Invertire il filtro (cella rivolto verso il basso) nella soluzione di raffreddamento pre-raffreddata.
   NOTA: È importante eseguire i passaggi sopra rapidamente (cioè entro secondi) e appena il liquido è stato rimosso per assicurare il raffreddamento rapido delle cellule, arrestando l'attività metabolica.
4. Incubare il filtro in soluzione di raffreddamento in ghiaccio secco per ≥20 min.
5. Con una pinzetta sterili, invertire il filtro (cella rivolta verso l'alto) nella capsula di Petri e utilizzare una micropipetta per sciacquare le cellule fuori di tegli membrana nella soluzione di tempra.
6. Risospeso le cellule in soluzione di raffreddamento e poi trasferire la sospensione cellulare in una provetta 2 mL antiurto sterile contenente ~ 100 ml di perline di silice 0,1 mm. Conservare questo in ghiaccio secco o a -80 ° C.

5. Estrazione Metabolite

1. campioni scongelamento in ghiaccio e distruggere le cellule in un omogeneizzatore con quattro 30 s raffica a 6.000 rpm, con periodi di raffreddamento 2 min in ghiaccio secco tra cicli.
2. Chiarire i lisati per 15 min in un pre-raffreddata, microcentrifuga refrigerata alla massima velocità (cioè, 18.213 xga ≤4 ° C).
3. Trasferire il surnatante in una provetta pulita.
4. Usando una micropipetta, trasferire una piccola porzione del campione in una provetta per la quantificazione del contenuto peptide residuo nel passaggio 6; memorizzare il residuo a -80 ° C.
   NOTA: Il volume del campione riservato varia, a seconda del dosaggio BCA utilizzato nel passaggio 6.1. Questocampione deve essere conservato in ghiaccio per l'analisi immediata o congelato a -80 ° C.

6. Acido bicinconinico (BCA) Assay

1. Eseguire un saggio BCA come raccomandato dal produttore del kit, utilizzando campioni dal punto 5.4 per determinare la concentrazione del peptide residuo per ogni campione.

7. LC-MS

1. Mescolare 75 ml di S. aureus estratto con 75 ml di LC-MS solvente B, preparato al punto 1.4.
2. Vortex per miscelare e far girare a 13.000 xg per 5 min.
3. Posizionare 100 ml di surnatante in una cromatografia liquida (LC) fiala e tappare esso. Assicurarsi che non bolle d'aria intrappolate nel campione.
4. Caricare le fiale LC sul campionatore automatico LC-MS e modificare l'elenco in esecuzione nel software "Offline Worklist Editor".
   1. Compila il "Nome del campione" (ad esempio, wild-type-1), "Sample Position" (ad esempio, P1-A1), "Metodo" (ad esempio, formico Acid-negativi Method), e (per esempio, wild-type-1) colonne di "File di dati". Fare clic sul pulsante sul pulsante "Salva lista di lavoro". Aprire il software "Spettrometria di Massa Data Acquisition Workstation" e inserire la lista di lavoro salvato in precedenza. Fare clic sul pulsante "Start lista di lavoro Run" per avviare la misurazione continua LC-MS.
5. Separare i campioni su una colonna, collegare la colonna a un tempo di spettrometro di volo (TOF), e coppia lo spettrometro TOF con il sistema LC. Utilizzare un gradiente di fase mobile come segue: 0-2 min, 85% di solvente B; 3-5 min, 80% di solvente B; 6-7 min, 75% di solvente B; 8-9 min, 70% di solvente B; 10-11,1 min, 50% di solvente B; 11,1-14 min, 20% di solvente B; e 14,1-24 min, 5% di solvente B; terminare con un punto riequilibrio 10 min a 85% di solvente B e una velocità di flusso di 0,4 mL min ^-1.
6. Utilizzando una pompa isocratica, infondere una soluzione massa di riferimento con la corsa per consentire la calibrazione simultanea asse massa.
   NOTA: questo passaggiosi basa sul manuale spettrometro TOF standard.
   1. Utilizzare la miscela di acido acetico e D4 esakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine come soluzione massa di riferimento per eseguire la calibrazione in tempo reale. Usare la pompa isocratica con velocità di flusso di 2.5 mL min ^-1 per l'infusione.

8. Batch Correzione di Conti Ion

1. Designare qualsiasi campione per servire come campione di riferimento per la correzione batch (ad esempio, di tipo selvaggio, replicare 1).
2. Calcolare la somma dei conteggi di ioni per tutti i metaboliti all'interno del campione di riferimento. Ripetere questo calcolo per tutti i campioni.
3. Dividere il numero totale di ioni di ciascun campione dal conteggio ionica totale del campione di riferimento per generare un rapporto.
4. Dividere il numero di ioni per ogni metabolita all'interno di un campione dal rapporto campione / riferimento per ottenere un numero di ioni lotti corretta per ciascun metabolita.

9. Peptide Normalizzazione

1. Divide i valori di conteggio ionico lotti corretta per ciascun campione ottenuto nel passaggio 8 per la concentrazione del peptide determinata con il saggio BCA nel passaggio 6 per ottenere un valore normalizzato per ciascun metabolita.
   NOTA: I normalizzati, batch lotto corretto conteggio ionico per ciascun metabolita ottenuto nello stadio 9.1 può essere direttamente confrontata tra ceppi e sottoposto ad analisi statistica (ad esempio, una U di Mann-Whitney -test). In alternativa, un metabolita caratterizza per essere invariato sia attraverso un trattamento o background genetico può essere utilizzato come un normalizzatore per rilevare le variazioni dovute al metabolita decomposizione. L'inclusione di una quantità nota di L-norvalina o acido gluraric nel tampone di estrazione può essere utilizzato per correggere la perdita durante l'elaborazione del campione ^34.

Abbiamo analizzato piscine metaboliti intracellulari di S. aureus durante la crescita in vitro in una ricca, mezzo complesso. Come prova di principio, abbiamo confrontato i profili dei metaboliti tra il sensibile alla meticillina di S. aureus osteomielite isolare UAMS-1 (wild-type [WT]) e un ceppo isogenico manca il regolatore trascrizionale globale Cody (Δ Cody) ^26. Stato stazionario, culture esponenziali dei ceppi WT e Cody sono stati stabiliti in terreno TSB, come descritto nel passaggio 2 del protocollo. Il comportamento di crescita del wild-type e mutanti culture Cody -null erano simili, con differenze solo lievi resa crescita e la velocità (Figura 1). Utilizzando RNA-Seq e tecnologia microarray, noi e altri rivelato che più geni che codificano per enzimi coinvolti nella biosintesi degli amminoacidi derivati da aspartato sono stati de-repressi nel Cody -null mutante compared alle cellule WT durante la crescita in vitro in TSB (figura 2) ^{25, 27, 30.} Inoltre, brnQ1 e brnQ2, che codificano catena ramificata permeasi amminoacidi, vengono sovraespressi nel mutante nullo codY- ^{30, 35.}

Per determinare la misura in cui allo stato stazionario abbondanza intracellulare di metaboliti associati a questo percorso sono alterati nel mutante nullo, abbiamo eseguito profiling metabolita LC-MS-based. WT e codY- nulli cellule mutanti sono state coltivate a stato stazionario biologica e sono stati campionati, come descritto nel passaggio 4 del protocollo. Abbiamo determinato abbondanze di metaboliti integrando l'area del picco dello ione intensità per ciascun metabolita cromatograficamente risolto utilizzando un pacchetto software di analisi (vedi Lista dei materiali). Abbiamo corretto per differenze nella biomassa normalizzando abbondanze metaboliti alla concentrazione peptide residua di ciascun campione. Abbiamo ulteriormente corretto questi valori per i potenziali effetti raggruppati tra campioni calcolando il conteggio medio ione per tutti i metaboliti all'interno di ogni campione e utilizzando l'esempio di tipo selvaggio come valore di riferimento. Questo approccio ha permesso il confronto tra campioni di abbondanze metaboliti le varie patologie. confronto tra metaboliti all'interno di un dato campione possono similmente essere ottenuti convertendo prima abbondanza metaboliti normalizzati dal conteggio di ioni molari quantitativi utilizzando il metodo dell'aggiunta standard.

Abbiamo confrontato i livelli di intermedi chiave nella via di aspartato in UAMS-1 e il suo mutante nullo codY-. Come si vede nella figura 3, i prodotti finali di questo percorso (per esempio, treonina e (iso) -leucina) sono più abbondanti nelle cellule mutanti Cody -null, mentre precursori (ad esempio,aspartato e o acetil omoserina) sono più abbondanti nelle cellule WT. La up-regolazione combinata di BrnQ permeasi ³⁶ e la via biosintetica ILV probabile porta ad aumenti di isoleucina e leucina ^30. Anche se le differenze sono relativamente piccole (<4 volte), LC-MS basata quantificazione e correzione lotto rivelano cambiamenti robuste e statisticamente significativi che sono coerenti con le alterazioni trascrizionali mediate da Cody.

Figura 1: comportamento di crescita di S. aureus UAMS-1 e un isogenico Cody mutante -null in TSB. Per estendere il tempo trascorso cellule in stato stazionario crescita esponenziale, le colture sono state back-diluiti ad una densità ottica di 0,05 in un mezzo fresco dopo il pre-culture raggiunto un OD ₆₀₀ di ~ 1. I campioni per la LC-MS analisi dei metaboliti sono stati raccoltida colture sperimentali ad una densità ottica di 0,5 ~ (frecce). I dati mostrati sono rappresentativi di tre repliche biologiche.

Figura 2: Schema di metaboliti selezionati derivanti da aspartato. Geni e operoni i cui prodotti catalizzare la sintesi di amminoacidi aspartato-familiari sono indicate in corsivo; l'aumento della trascrizione abbondanza in un mutante -null Cody rispetto al tipo selvatico, come determinato mediante l'analisi di RNA-Seq ^29, è anche osservato. DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelato).

Figura 3: Abbondanze di metaboliti della famiglia aspartato sono alterati in un mutante Cody. Il registro ₂ cambi fold di metaboliti selezionati nelcodY- mutante nullo rispetto al UAMS-1 (WT) sono mostrate. La variazione è determinato dividendo l'abbondanza media di tre repliche biologiche del ceppo nullo codY- dall'abbondanza media di tre repliche biologiche del ceppo WT. L'errore standard tra repliche biologiche per ogni metabolita era <35%. Le linee tratteggiate indicano un registro modifiche ₂ 1.5-fold, cutoff utilizzato in questo esperimento.

Tutti i metaboliti piccole molecole sono collegate tra di loro attraverso le loro origini comuni in vie metaboliche centrali. Durante la crescita esponenziale, le cellule batteriche sono a regime biologico e metabolico, fornendo una fotografia dello stato fisiologico in condizioni specifiche. Cody monitora sufficienza nutrienti rispondendo a IBT e GTP. Come ILV e GTP piscine goccia, attività Cody è probabile progressivamente ridotto, regolando l'espressione dei suoi geni bersaglio per adattarsi alla crescente esaurimento degli elementi nutritivi ^30. Un ceppo Cody carenti si comporta come se IBT e GTP sono esaurite dall'ambiente ma presenta solo una differenza molto lieve comportamento di crescita rispetto al ceppo Cody-abile (Figura 1). Così, il confronto delle piscine steady-state dei metaboliti in questi ceppi ci fornisce un'opportunità unica per rivelare la misura in cui il metabolismo viene riconfigurato quando i nutrienti sono scarsi. Va notato che our esperimenti indagare abbondanza metaboliti quando l'attività Cody è massimizzata (IBT e GTP sono più abbondanti in fase esponenziale). Tuttavia, altre domande possono essere indirizzate in altre fasi di crescita. Ad esempio, in fase esponenziale, acido tricarbossilico (TCA) L'attività ciclo è molto basso; in fase di post-esponenziale, il ciclo TCA viene attivato ^36. Un certo numero di fenotipi, compreso abbondanza metaboliti, dipendono da questa attivazione. Inoltre, il sistema di rilevamento quorum agr diventa attivo durante la transizione dalla crescita esponenziale di fase stazionaria ^37. Raccolta di campioni in fase di post-esponenziale o stazionaria può essere più rilevante per gli studi relativi questi argomenti. Indipendentemente da quando i campioni vengono raccolti, è importante raccogliere, lavare, e trasferire i campioni di tampone di estrazione più rapidamente possibile (cioè entro s) per minimizzare il turnover metabolita che si verifica quando lo stato stazionario è perturbato.

Il metodo cromatografico qui descritto è particolarmente adatto per analizzare amminoacidi polari e non polari e composti centrali metabolismo carbonio. Tuttavia, i metodi specifici della classe addizionali possono essere utilizzati per quantificare i composti specifici di interesse non cromatograficamente risolto con questo metodo. Ad esempio, alterando il pH della fase mobile cromatografica sostituendo acido formico con acido acetico e 'stato segnalato un additivo per consentire la risoluzione di isoleucina e leucina ^38. Modificare la procedura di estrazione possono analogamente consentire il recupero e la quantificazione dei metaboliti labili che sono sensibili al metodo di estrazione usato qui. Ad esempio, composti come cisteina che sono inclini a formazione di legami disolfuro possono potenzialmente essere recuperati dopo derivatizzazione con il reagente di Ellman ^39. Tamponi estrazione spruzzando azoto possono conservare NAD ⁺ e NADHrapporti, consentendo una valutazione dello stato redox cellulare ^40. trifosfati nucleosidici possono decomporsi in soluzione basica o senza buffer; acidificazione della soluzione di estrazione può migliorare il recupero di queste molecole ^41.

In una coltura batterica in crescita esponenziale, l'esaurimento di una o più sostanze nutritive porta al passaggio alle fasi di post-esponenziali e fisse di crescita. Queste fasi di crescita sono caratterizzati da stati metabolici distinti ^42. culture chemostat basati generano un praticamente continuo biologico ideale stato stazionario per l'espressione genica e studi fisiologici. Tuttavia, il metodo richiede attrezzature specializzate, è tecnicamente impegnativo, e richiede che una limitazione nutritiva essere imposto per mantenere una popolazione stabile di cellule al flusso. Quest'ultimo requisito provoca perturbazioni trascrizionali e fisiologiche dovute a fattori diversi dalla variabile o rigulator in fase di analisi. Per garantire che i nostri risultati boccetta basati sono rappresentative di cellule in crescita esponenziale allo stato stazionario e non di una transizione tra due fasi, impieghiamo una strategia diluizione doppia indietro con un pallone costante: rapporto volumetrico (lievi cambiamenti nei livelli di ossigeno possono causare alterato metabolismo ^{36, 42).} Dopo una diluizione iniziale di culture durante la notte, queste cellule sono coltivate per un OD ₆₀₀ di ~ 1,0, back-diluito ad un OD ₆₀₀ di ~ 0,05, e raccolte quando raggiungono un OD ₆₀₀ di ~ 0,5. Tale metodo diluisce anche molecole citoplasmatiche che si accumulano durante la crescita durante la notte, compreso RNA stabili. Infatti, RNAIII, l'effettore del sistema quorum sensing agr, è uno di questi RNA e regola l'espressione di alcuni degli stessi geni bersaglio Cody ^{25, 43, 44.} RNAIII accumulato può mascherare Cody-depregolazione Endentski, portando ad una sottostima della forza di repressione o stimolazione Cody (Sharma e Brinsmade, risultati non pubblicati).

Una limitazione di questa analisi è che fornisce uno scorcio istantanea di abbondanze metaboliti all'interno della cellula; non è possibile trarre conclusioni dai risultati riguardanti le variazioni di flusso attraverso un determinato percorso. Ad esempio, l'abbondanza di lisina e metionina tra i due ceppi esaminati non cambia, nonostante de-repressione degli enzimi biosintetici nel ceppo nullo codY- (figure 2 e 3). Il ceppo -null Cody può infatti essere generare più lisina e metionina, ma possono essere rapidamente convertiti in altri composti; in tal modo, queste molecole non si accumulano. Fonti di carbonio o di azoto utilizzando ¹³ C o ¹⁵ N-marcati permetterebbero di seguire carbonio e azoto scheletri attraverso grandi incroci metaboliche ^{45 , 46.}

Abbiamo usato il metodo descritto per chiarire cambiamenti nelle piscine metaboliti in S. aureus, B. subtilis ^29, Mycobacterium tuberculosis ^47, e Enterococcus faecium ^48, ma il metodo può essere applicato ad altri batteri Gram-positivi e Gram-negativi, compresi altri agenti patogeni umani facilmente coltivate in laboratorio. Infatti, integrando le informazioni metabolomica e trascrittomica può rivelare connessioni inaspettate tra il metabolismo e la virulenza, che potrebbe portare a nuove strategie per trattare le infezioni.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo lavoro è stato finanziato in parte da un NIH Pathway to Independence Award (Grant GM 099.893) ei fondi di avvio facoltà di SRB, nonché un progetto di assegno di ricerca (Grant GM 042.219). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l'interpretazione, o la decisione di presentare il lavoro per la pubblicazione.