I neuroni di imaging all'interno di sezioni di cervello spesse Uso del metodo di Golgi-Cox

Presentiamo un protocollo secondo il metodo di colorazione Golgi-Cox in sezioni di cervello spesse, per visualizzare neuroni con lunghi alberi dendritiche contenuti in campioni di tessuto singoli. Due varianti di questo protocollo sono anche presentati che coinvolgono di contrasto viola cresile, e il congelamento dei cervelli non trasformati per la conservazione a lungo termine.

Il metodo di Golgi-Cox di neurone colorazione è stato impiegato per più di duecento anni per far progredire la nostra comprensione del neurone morfologia all'interno di campioni di cervello istologici. Mentre è preferibile dal punto di vista pratico per preparare sezioni di cervello del spessore maggiore possibile, al fine di aumentare la probabilità di identificare neuroni colorati che sono completamente contenuti all'interno delle singole sezioni, questo approccio è limitato dal punto di vista tecnico dalla distanza di lavoro di alta Ingrandimento obiettivi del microscopio. Riportiamo qui un protocollo per macchiare neuroni utilizzando il metodo Golgi-Cox in sezioni di cervello di topo che vengono tagliati a 500 spessore um, e visualizzare neuroni tutta la profondità di queste sezioni utilizzando un microscopio verticale dotato di alta risoluzione 30X 1,05 NA silicone obiettivo ad immersione in olio, che ha una distanza di lavoro di 800 micron. Si segnala inoltre due varianti utili di questo protocollo che può essere impiegato per colorazione di contrasto alla superficie dimontato sezioni di cervello con il violetto cresolo Nissl macchia, o di congelare cervelli interi per la conservazione a lungo termine prima di sezionamento e lavorazione finale. Il protocollo principale e le sue due varianti producono sezioni di cervello spesse colorate, durante il quale gli alberi pieni neurone e spine dendritiche dendritiche possono essere visualizzati in modo affidabile e quantificate.

La visualizzazione dei singoli neuroni all'interno di campioni di tessuto consente l'analisi in situ di Neuron caratteristiche morfologiche, che ha notevolmente avanzato la nostra comprensione del cervello e come può essere influenzata dalla malattia endogena o fattori ambientali esogeni. Il metodo di colorazione Golgi-Cox è una soluzione economica, mezzi relativamente semplici di colorando un campione casuale di neuroni nel cervello. Primo sviluppato da Golgi ¹ e modificato da Cox ² nel 1800, i ricercatori hanno ulteriormente perfezionato questa tecnica nel corso degli anni per produrre chiare neuroni, ben colorate, che possono essere utilizzati per visualizzare e quantificare sia albero dendritico morfologia e densità delle spine ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

Una considerazione importante tecnica per la visualizzazione dei neuroni colorati all'interno delle sezioni cerebrali è lo spessore massimo fetta, che è limitata dalla distanza di lavoro di alto ingrandimento / obiettivi del microscopio ad alta risoluzione disponibili. Obiettivi ad immersione in olio comuni nel 60 - 100X raggio forniscono un'eccellente risoluzione, ma sono limitati dalla loro distanze di lavoro che sono in genere non superiore a 200 micron. Sezioni di cervello tagliato al micron tra 200 possono essere sufficienti per visualizzare alcuni tipi di neuroni che possono essere contenuti all'interno di questo spessore di strato, ad esempio neuroni piramidali negli strati superficiali della corteccia cerebrale ^{10, 11, 12,} neuroni piramidali della regione CA1 della ippocampo ^{13, 14,} e cellule granulari del giro dentato dell'ippocampo ^15. I neuroni con relativamente più lungoalberi dendritiche, come i neuroni piramidali raggio strati profondi della corteccia cerebrale che per il mouse può estendersi oltre 800 um dal corpo cellulare ^16, forniscono una sfida maggiore perché dovrebbero essere sezionati a un angolo perfetto cervello per contenere l'intero albero dendrite entro 200 micron fette. Questo può anche non essere fattibile se un dendrite o uno dei suoi rami si estendono in direzione rostrale o caudale. Mentre è possibile affrontare questa limitazione tracciando un neurone in più sezioni di cervello adiacenti, questo approccio introduce una sfida tecnica significativa allineamento delle sezioni accuratamente per tracciare ^17. Un approccio più pratico sarebbe visualizzare intere neuroni contenuti in sezioni di cervello che vengono tagliati a spessore maggiore.

Riportiamo qui una tecnica per colorare i neuroni all'interno di 400-500 micron di spessore sezioni del cervello di topi con il metodo di Golgi-Cox, e visualizzare il loro morphology utilizzando un obiettivo ad immersione in olio di silicone ad alta risoluzione che ha una distanza di lavoro di 800 um. L'impregnazione e l'elaborazione del protocollo Golgi-Cox che descriviamo viene modificato da uno dei protocolli moderni più citati nella letteratura ^6. Il nostro approccio con sezioni di cervello spesse offre il vantaggio di aumentare la probabilità di identificare neuroni di qualsiasi tipo che sono completamente contenuto all'interno della sezione. Oltre al protocollo principale, abbiamo anche presentare due varianti che forniscono vantaggi unici: (1) colorazione Golgi-Cox con la controcolorante violetto cresolo sulla superficie delle sezioni montate, al fine di definire i confini di regioni cerebrali e identificare strati della corteccia cerebrale, e (2) Golgi-Cox colorazione con una fase di congelamento intermedio per la conservazione a lungo termine di cervelli interi impregnate prima del sezionamento e lavorazione finale.

topi CD1-deformazione adulte di sesso femminile sono stati utilizzati in questo studio. colorazione simile può essere realizzato utilizzando entrambi i sessi alle varie età. Animali da esperimento sono stati curati secondo i principi e le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali, e il protocollo sperimentale è stato approvato dalla University of Animal Care Comitato Guelph.

1. Golgi-Cox colorazione

1. Golgi-Cox impregnazione di Brains
   1. Rendere la soluzione Golgi-Cox di 1% (w / v) dicromato di potassio, 0,8% (w / v) cromato di potassio e 1% (w / v) di cloruro mercurico sciogliendo il bicromato di potassio e potassio cromato nell'acqua alta qualità separatamente . Mescolare le soluzioni, aggiungere il cloruro mercurico e filtrare la soluzione finale con grado 1 carta filtro. Conservare la soluzione al buio per un massimo di un mese.
   2. Anestetizzare il mouse utilizzando 5% isoflurano.
   3. Eutanasia il mouse per decapitazione e rimuovere rapidamente il cervello.
   4. Posizionare il cervello in una fiala di scintillazione 20 vetro mL contenente 17 mL di soluzione di Golgi-Cox e incubare al buio a temperatura ambiente per 25 d.
   5. Cryoprotect cervello ponendolo in una provetta conica da 50 ml contenente 40 ml di saccarosio crioprotettore (30% (w / v) di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4) al buio a 4 ° C per 24 h.
      NOTA: Le seguenti tre passaggi facoltativi possono essere impiegati come alternativa al protocollo principale, al fine di congelare il cervello, in questa fase per la conservazione a lungo termine.
   6. Congelare l'intero cervello immergendolo in 200 mL isopentano che è stato pre-raffreddata in ghiaccio secco.
   7. Posizionare il cervello congelato in una provetta e conservare 50 conica al buio a -80 ° C.
   8. Quando pronto a procedere, scongelare il cervello ponendolo in una provetta conica da 50 ml contenente 40 ml di crioprotettore saccarosio al buio a 4 ° C per 24 h.
2. cervello sezionamento
   1. Rimuovere il cervello dal saccarosio e block per sezionamento tagliando il cervelletto con una lama di rasoio e lasciando un bordo piatto alla restante estremità caudale del cervello.
   2. agar calore (3% (w / v) in acqua) fino a fusione e lasciata raffreddare fino a quando è lievemente superiore al suo punto di fusione.
   3. Collocare il cervello in un piccolo piatto pesare monouso con la sua estremità caudale faccia in giù e aggiungere una quantità sufficiente di agar fuso per coprire il cervello.
   4. Una volta che l'agar è solidificato, rifilare eccesso agar lasciando circa di 2 - 4 mm circonda il cervello e incollare il cervello alla fase di un vibratome con la sua estremità caudale faccia in giù utilizzando una piccola quantità di colla etile cianoacrilato.
   5. Riempire l'area fase vibratome con una quantità sufficiente di crioprotettore saccarosio per coprire il cervello, e la sezione del cervello ad uno spessore fetta 400 - 500 um (a seconda della regione del cervello da esaminare) utilizzando una frequenza di vibrazione di 86 Hz e una velocità di avanzamento della lama 0,125 mm / s.
   6. Usando un piccolo pennello, Sezioni posto cervello in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti contenenti inserti in mesh-bottom disponibili in commercio e preriempita con 10 ml di 6% (w / v) di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4.
   7. Incubare sezioni al buio a 4 ° CO / N.
3. Sviluppo del cervello Sezioni
   1. Usando gli inserti in mesh-bottom, trasferire sezioni di cervello in un nuovo pozzetto contenente 5 ml di 2% (w / v) paraformaldeide (PBD) in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4. Incubare su un agitatore meccanico in movimento a velocità ridotta al buio a temperatura ambiente per 15 min.
   2. Lavare sezioni due volte trasferendoli nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. Lavare su un bilanciere muove ad una velocità moderata al buio a temperatura ambiente per 5 min.
   3. sezioni di trasferimento in un nuovo pozzetto contenente 5 mL di 2,7% (v / v) di idrossido di ammonio. Incubare su un agitatore meccanico muove ad una velocità lenta al buio a temperatura ambiente per 15 min.
   4. Lavare sezioni due volte trasferendoli nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. lavare ona rocker muove ad una velocità moderata al buio a temperatura ambiente per 5 min.
   5. Sezioni di trasferimento in un nuovo pozzetto contenente 5 ml di fissativo A (vedi Materiali Tavolo) che è stato diluito in acqua 10 volte dalla sua concentrazione originale acquistato. Incubare su un agitatore meccanico muove ad una velocità lenta al buio a temperatura ambiente per 25 min.
   6. Lavare sezioni due volte trasferendoli nuovi pozzetti contenenti 5 ml di acqua. Lavare su un bilanciere muove ad una velocità moderata al buio a temperatura ambiente per 5 min.
4. Montaggio cervello Sezioni
   1. Con un piccolo pennello, montare sezioni su vetrini da microscopio. Rimuovere l'acqua in eccesso e agar usando pinzette e un piccolo tessuto. Assicurarsi che tutta l'agar viene rimosso prima di procedere con la disidratazione.
   2. Consentire sezioni di aria secca a temperatura ambiente per circa 45 min (400 sezioni micron) o 90 min (500 sezioni micron).
      NOTA: Il livello tempi e propria di secchezza è critica, e può essere necessario determinare per ciascunlaboratorio seconda della temperatura ambiente e umidità. Troppo breve tempo di asciugatura porta a sezioni caduta di diapositive durante successive fasi di disidratazione, e troppo tempo di asciugatura porta a sezioni di cracking. Le sezioni saranno ancora sembrano essere lucido al livello appropriato di secchezza.
   3. sezioni macchia con violetto cresolo ponendo i vetrini in Coplin vaschette di colorazione come indicato.
      NOTA: Questa opzione potrebbe essere impiegato per le sezioni che non erano mai stati congelati, al fine di macchiare nuclei neuronali con violetto cresolo. Abbiamo scoperto che la compensazione e reidratante sezioni prima di incubazione in violetto cresolo porta anche alle macchie e bassa sfondo attraverso le sezioni.
      1. Mettere in stanza di compensazione per 5 min. Ripetere una volta.
      2. Mettere in 100% di etanolo per 5 min. Ripetere una volta.
      3. Mettere in etanolo al 95% in acqua, quindi il 75% di etanolo in acqua, e poi il 50% di etanolo in acqua per 2 minuti ciascuna.
      4. Mettere in acqua per 5 minuti.
      5. Mettere in 0,5% (w / v) creSyl violetto in acqua per 7 min.
      6. Mettere in acqua per 2 minuti. Ripetere una volta.
   4. Disidratare sezioni ponendo i vetrini in Coplin vaschette di colorazione come indicato.
      1. Mettere in etanolo al 50% in acqua, quindi il 75% di etanolo in acqua, e poi il 95% di etanolo in acqua per 2 minuti ciascuna.
      2. Mettere in 100% di etanolo per 5 min. Ripetere una volta.
      3. Mettere in stanza di compensazione per 5 min. Ripetere una volta.
         NOTA: Queste disidratazione e che eliminano i periodi sono sufficienti per elaborare il cervello di topo, come descritto in questo manoscritto. Tuttavia, abbiamo osservato per altre specie tra ratto e cowbird, che la fase di compensazione finale può dover essere estesa fino a 15 min totale.
   5. sezioni coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio anidro.
   6. I vetrini asciugare orizzontalmente al buio a temperatura ambiente per almeno 5 d.

2. Imaging macchiato neuroni all'interno del cervello spesse Sezioni

1. Catturare Serie di immagini
   1. Accendere la lampadina microscopio, telecamera, e il controller fase.
   2. Aprire il software microscopio (ad esempio, Neurolucida).
   3. Posizionare un vetrino sul palco microscopio.
   4. Ritrarre una vista immagine 2D della sezione cervello utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento come 1,25X 0,4 NA Planapo o 4X 0,16 NA
      1. Mettere a fuoco l'immagine e regolare le impostazioni della fotocamera, tra cui il tempo di esposizione e bilanciamento del bianco.
      2. Creare un punto di riferimento da sinistra-clic su un punto qualsiasi della sezione
      3. Acquisire l'immagine selezionando "acquisire una sola immagine" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
   5. Catturare metà risoluzione pile di immagini della zona contenente i neuroni (i) di interesse, utilizzando un obiettivo 10X 0,3 NA uPlan FL N.
      1. Mettere a fuoco l'immagine e regolare le impostazioni della fotocamera, tra cui l'esposizione e il bilanciamento del bianco.
      2. Impostare i limiti superiori e inferiori per la serie di immagini puntando alla parte superiore della sezione di unnd selezionando "set" accanto a "cima alla pila" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini, e quindi concentrandosi sul fondo della sezione e selezionando "set" accanto a "fondo di stack" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      3. Impostare la distanza di incremento di 5 um inserendo "5 um" accanto a "distanza tra le immagini" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      4. Catturare la serie di immagini selezionando "immagine acquisiscono stack" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      5. Ripetere i passaggi precedenti per catturare tutta l'area di interesse, facendo in modo che tutte le pile di immagini si sovrappongono di almeno il 10% nella assi X e Y.
   6. Cattura alta risoluzione pile di immagini della zona contenente il neurone di interesse, utilizzando un 30X 1,05 NA silicone obiettivo ad immersione in olio.
      1. Applicare 3 - 4 gocce di olio di silicone immersione alla slitta e posizionare l'obiettivo sul vetrino, assicurando di entrare in contatto tra l'obiettivo e il oil.
      2. Mettere a fuoco l'immagine e regolare le impostazioni della fotocamera, tra cui l'esposizione e il bilanciamento del bianco.
      3. Impostare i limiti superiore e inferiore per la pila, concentrandosi all'inizio della sezione e selezionando "set" accanto a "cima alla pila" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini, e quindi concentrandosi sul fondo della sezione e selezionando "set" accanto a "fondo di stack" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      4. Impostare la distanza di passo 1 um immettendo "1 um" accanto a "distanza tra le immagini" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      5. Catturare la serie di immagini selezionando "immagine acquisiscono stack" all'interno della finestra di acquisizione delle immagini.
      6. Ripetere i passaggi precedenti per catturare tutta l'area di interesse, facendo in modo che tutte le pile di immagini si sovrappongono di almeno il 10% nella assi X e Y.
   7. Salvare il file di dati e salvare tutti i file di immagine in formato TIFF per l'elaborazione esterna.
2. Creazione di immagini Z-proiezione e immagine montaggi
   1. Creare immagini Z-proiezione in ImageJ
      1. il software ImageJ aperto che ha installato il plugin Bio-formati.
      2. Selezionare "Plugins" -> "Bio-formati" -> "Bio-Formati Importatore".
      3. Selezionare il file serie di immagini da aprire.
      4. Una volta che il file viene aperto, modificare il formato RGB selezionando "Immagine" -> "Tipo" -> "colore RGB".
      5. Creare la Z-proiezione selezionando "Immagine" -> "Stack" -> "Z Progetto ...".
      6. Salva Immagine con Z-proiezione bidimensionale come file TIFF.
   2. Creare un'immagine montaggio bidimensionale di tutta l'area di interesse.
      1. Aprire il software (ad esempio, Adobe Photoshop).
      2. Selezionare "File" -> "Automatizzare" -> "Photomerge".
      3. Selezionare "Sfoglia" e quindi aggiungere tutti imagfile ES da unire.
      4. Assicurarsi che "Blend Images Insieme" è selezionato e quindi selezionare "OK".
      5. Salvare l'immagine risultante montaggio di tutta l'area di interesse come file TIFF.

Questo protocollo di colorazione Golgi-Cox e le sue due varianti descritte opzionali possono essere impiegati per visualizzare i singoli neuroni a 400 - 500 um di spessore sezioni del cervello. Rappresentativi montaggi di immagini bidimensionali Z-proiezioni catturate con un obiettivo 10X e 5 micron passi nell'asse Z sono mostrati in Figura 1: A1 - C1 per una grande area di sezioni di cervello coronali che include l'area corteccia anteriore cingolata 1 e la corteccia motore secondario ^18. Le sezioni sono state tagliate a 500 micron. Si noti che la variante protocollo che comprende colorazione violetto cresolo consente l'identificazione di strati di cellule corticali, ad esempio come si è visto per lo strato corticale 1 lungo la superficie piale delle sezioni in Figura 1B1. Si noti anche l'aspetto simile di sezioni colorate utilizzando il protocollo principale utilizzando tutto fresco tessuto (Figura 1A1) e la variante protocollo in cuicervelli sono congelati in un punto intermedio per la conservazione a lungo termine (Figura 1C1).

L'uso di un-alta risoluzione 30X 1,05 NA silicone obiettivo ad immersione in olio permette la cattura di pile di immagini che sono più grandi in X e Y di quelli acquisiti utilizzando un obiettivo più alto ingrandimento, richiedendo così meno pile totale di immagine un determinato area d'interesse. L'obiettivo particolare impiegata ha una distanza di lavoro di 800 micron, che è più che sufficiente per immagine sezioni di cervello spesse. Immagine montaggi di bidimensionali Z-proiezioni acquisite utilizzando questo obiettivo e 1 micron passi nell'asse Z sono mostrate nella Figura 1 (A2-C2) all'interno cingolata anteriore zona corticale 1 e bidimensionali Z-proiezioni di tracciati per il neuroni indicate sono mostrati in Figura 1: A3 - C3. Nota le immagini ad alta risoluzione che consentono la visualizzazione dei neuroni e loro dendriti attraverso laprofondità di ciascuna pila. La variante protocollo utilizzando violetto cresolo aggiunge viola Nissl tutta la fetta, ma con i parametri utilizzati questa colorazione cellulare è stata osservata solo nella parte superiore della fetta. La variante protocollo che comprende la fase di congelamento opzionale produce colorazione neurone che è simile al protocollo principale, tuttavia introduce anche uno sfondo colorazione diffusa che crea l'aspetto di foschia da diffrazione della luce sotto la superficie della fetta. Questo haze è più evidente quando l'imaging approfondire la fetta ed è evidente nell'immagine Z-proiezione nella Figura 1C2. Immagini acquisite tramite l'obiettivo 30X possono anche essere utilizzati per visualizzare e quantificare strutture neuronali pregiati come spine dendritiche. Immagini di un solo piano sono mostrati in Figura 2 per dendriti colorati utilizzando il protocollo principale e le sue due varianti, con un'immagine presa nella parte superiore della sezione e un'immagine presa nella parte inferiore della sezione. Si noti la Purple violetto cresolo colorazione di Nissl sostanza all'interno dei singoli nuclei neuronali nella parte superiore della sezione di figura 2B1, che è visto come diffusa sfondo viola chiaro / dispersa nella parte inferiore della sezione di Figura 2B2. Si noti inoltre che, sebbene dendriti e loro spine sono ben colorate utilizzando il protocollo con la fase di congelamento, lo sfondo foschia precedentemente menzionato che risulta vicino al fondo della fetta di figura 2C2 rende più difficile visualizzare spine limitando il contrasto tra li e lo sfondo adiacente. Obiettivi alto ingrandimento possono anche essere utilizzati per caratterizzare dendritiche morfologia delle spine, come mostrato nella Figura 2: A3 - C3 dove spine di tipi diversi sono chiaramente visibili nelle sezioni colorate utilizzando ciascuno dei tre protocolli. Qui, è stato utilizzato un NA obiettivo 60X 1.42 ad immersione in olio. Abbiamo impiegato anche questo protocollo di colorazione e le sue varianti di macchiare i neuroni all'interno del hippocampus di sezioni tagliate a 400 um. Come mostrato in figura 3, dendriti dei neuroni e spine possono essere visualizzati sia verso le zone più-mediale della sezione (ad esempio, il dentato regione circonvoluzione dell'ippocampo in figura 3: A2 - C2) e le zone più-laterali del profilato (ad esempio , la regione CA3 dell'ippocampo in figura 3: A3 - C3). Va inoltre notato che ogni condizione colorazione prodotto risultati simili, vantaggi e svantaggi di quelli mostrati nelle figure 1 e 2 per la corteccia cerebrale.

Lo spessore finale di sezioni di cervello trasformati variare a seconda della specifica variante protocollo utilizzato. Come mostrato nella Figura 4A per le sezioni contenenti corteccia cerebrale e tagliato a 500 um, c'è stato un significativo effetto di variante protocollo dello spessore misurato di lavorati e montati / sezioni coprioggetto (ANOVA, p <0.0001). Qui, lo spessore delle sezioni effettuata utilizzando il protocollo principale (251,0 ± 12,5 (SEM) um (n = 6)) e la variante protocollo coinvolge violetto cresolo (219,3 ± 8,5 micron (n = 6)) sia inferiore allo spessore delle sezioni effettuata utilizzando il protocollo variante coinvolge la fase di congelamento (340,6 ± 17,1 um (n = 6)) (test di Bonferroni post-hoc, ogni confronto p ≤ 0,0006). Sono stati osservati effetti molto simili di variante protocollo per le sezioni contenenti l'ippocampo e tagliati a 400 um (Figura 4B, ANOVA, p <0,0001). Qui, lo spessore delle sezioni effettuata utilizzando il protocollo principale (217,6 ± 19,2 um (n = 6)) e la variante protocollo coinvolge violetto cresolo (198,0 ± 14,8 um (n = 6)) è inferiore allo spessore delle sezioni eseguite utilizzando la variante protocollo coinvolge la fase di congelamento (313,5 ± 8,4 micron (n = 6)) (test di Bonferroni post-hoc, ogni confronto p ≤ 0,001).

Figura 1. Esempi di microfotografie macchiato neuroni nella zona cingolo anteriore 1. A1 - C1, unite Z-proiezioni di pile di immagini acquisite utilizzando un obiettivo 10X sono mostrati per un emisfero della corteccia cerebrale che comprende la zona corteccia anteriore cingolata 1 e secondaria corteccia motoria a circa 1,18 millimetri Bregma ^18. Queste sezioni sono state tagliate a 500 um. Microfotografie sono mostrati usando il principale tutto fresco protocollo (A1), per la variante protocollo fresca con violetto cresolo colorazione (B1) e per la variante protocollo in cui cervelli sono congelati seguente Golgi-Cox impregnazione (C1). Barre di scala sono 500 micron. Risoluzione superiore fusa Z-proiezione pile di immagini acquisite utilizzando un obiettivo di silicio ad immersione in olio 30X sono mostrate in A2 - C2 per ogni area indicata dal sq rossouare nelle microfotografie in A1 - C1. Barre di scala sono 100 um. 2D Z-proiezioni di tracciati neuroni sono riportati nella A3 - C3 per i neuroni indicati dalla freccia rossa nelle microfotografie nel A2 - C2. Il diametro di tutti i dendriti sono stati fissati a 2 um per facilità di illustrazione. Barre di scala sono 100 um. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Esempi microfotografie di spine dendritiche per macchiate neuroni. Microfotografie catturate con un obiettivo ad immersione in olio 30X silicio sono presenti in un piano focale per dendriti neuronali situati entro strato 1 dell'area corticale anteriore cingolata 1. Queste sezioni sono state tagliate a 500 um. I neuroni sono state colorate con il f protocollo Resh (A1, A2), la variante protocollo con colorazione violetto cresolo (B1, B2) e per la variante protocollo in cui cervelli sono congelati seguente Golgi-Cox impregnazione (C1, C2). Microfotografie sono state prese vicino alla parte superiore della fetta (A1 - C1) e vicino al fondo della fetta accanto al vetrino (A2 - C2). Barre scala per A1-2, B1-2 e C1-2 sono 50 um. Microfotografie sono mostrati in A3, B3 e C3 per un piano focale con un più alto ingrandimento dell'obiettivo 60X ad immersione in olio, al fine di individuare i diversi tipi di colonna vertebrale. Barre di scala per A3, B3 e C3 sono 10 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Esempi di microfotografie macchiato neuroni nell'ippocampo. Microfotografie catturate con un obiettivo 4X sono mostrati in un piano focale per i neuroni colorati mediante il protocollo fresca (A1), la variante protocollo con colorazione violetto cresolo (B1) e per la variante protocollo in cui cervelli sono congelati seguente Golgi-Cox impregnazione (C1 ). Le sezioni sono state tagliate a 400 pm e sono mostrati a circa Bregma -2.18 mm ^18. Barre di scala sono 500 micron per A1 - C1. Maggiori microfotografie ingrandimento state acquisite utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 30X silicio e sono presenti in un piano focale per Neuron dendriti si trova all'interno della regione giro dentato dell'ippocampo (A2 - C2) e la regione CA3 dell'ippocampo (A3 - C3). Barre di scala sono 50 pm per A2 - C2e A3 - C3. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Spessore di sezioni montate. Lo spessore misurato di sezioni montate è indicato in A per le sezioni contenenti la corteccia cerebrale di circa 1,18 millimetri Bregma ¹⁸ e tagliato a 500 um di spessore, e B per le sezioni contenenti l'ippocampo a circa Bregma -2.18 mm ¹⁸ e tagliato a 400 um spessore. sezioni misurate sono state colorate utilizzando il protocollo fresca, la variante protocollo con colorazione violetto cresolo, o la variante protocollo in cui cervelli sono congelati a seguito Golgi-Cox impregnazione. Per entrambe le regioni del cervello, ci fu un effetto significativo del protocollo di trattamento(One-way ANOVA, p <0,0001), in cui le sezioni di cervelli che erano parzialmente congelato attraverso il protocollo sono stati significativamente più spesso di quelli che non sono stati congelati (test di Bonferroni post-hoc, tutti p <0,001). I dati sono mostrati come media ± SEM di sei sezioni in ciascun gruppo, e set di dati con lettere diverse indicano differenze significative. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Descriviamo qui un protocollo di colorazione Golgi-Cox insieme a due varianti utili per la visualizzazione neuroni all'interno delle sezioni di cervello spesse. Come mostrato nelle Rappresentante dei risultati, l'uso di un obiettivo ad alta risoluzione che ha una lunga distanza di 800 micron di lavoro permette la visualizzazione affidabile di intere neuroni per tutta la profondità di sezioni di cervello tagliate a 500 micron. Questo studio di sezioni di cervello relativamente spessi aumenta la probabilità che i neuroni macchiati di qualsiasi tipo sono completamente contenuti all'interno della fetta, che è particolarmente importante per i neuroni piramidali con lunghe e complicate alberi dendriti apicali. Ad esempio, in sezioni coronali di cervello roditori, questo permette l'inserimento di neuroni che si estendono più lontano nella direzione rostrale o caudale, e aumenta anche il margine di errore quando bloccare il cervello esattamente al passo sezionamento. Sebbene descriviamo cervello sezionamento nel piano coronale unico, questo protocollo può essere adattato per il sezionamento in altri planes come richiesto pienamente contiene neuroni etichettati all'interno delle singole sezioni. Il piano di sezionamento impiegato dipenderà dalle caratteristiche morfologiche della popolazione neurone in esame. Spine dendritiche possono essere visualizzati e quantificati utilizzando questo protocollo, anche se obiettivi alto ingrandimento sono necessari per valutare spina dorsale tipo / morfologia quali l'obiettivo ad immersione in olio 60X utilizzato per produrre le microfotografie in figura 2: A3 - C3. Questo può essere impiegato in sezioni spesse ma è limitato alla parte superiore della fetta all'interno della distanza di lavoro dell'obiettivo. Questo protocollo può anche essere adattato per l'utilizzo in diverse specie di dimensioni del cervello simili, abbiamo trovato che un periodo di impregnazione standard di 25 giorni sarà pienamente neuroni in tutto il topo, ratto e nel cervello cowbird macchia, senza che porta a macchie o di sfondo in eccesso non specifico che si possono verificare con periodi impregnazione oltre un mese. Periodi più brevi di impregnazione può essere sufficiente per le specie con scervelli Maller o in campioni sezionati di cervelli dalla specie suddette, che potrebbero essere ottimizzate dal singolo ricercatore.

Delle tre varianti presentate per questo protocollo di colorazione, il protocollo principale utilizzando campioni di cervello freschi che non sono controcolorati produce i risultati migliori. Microfotografie in Figura 2 dimostrano che questo protocollo principale produce dendriti ben etichettate e spine che sono facilmente visibili nella parte superiore e inferiore di sezioni spesse montati. Aggiungendo la controcolorazione violetto cresolo ha il vantaggio di facilitare la definizione di regioni cerebrali e strati della corteccia cerebrale, ma anche aggiunto uno sfondo diffusa viola durante la visualizzazione in profondità sezioni spesse. Tuttavia, poiché questa variante protocollo colora solo la superficie di sezioni spesse montati con violetto cresolo, dendriti e loro spine erano chiaramente visibili nella parte inferiore delle sezioni (Figura 2 B). Questo sembra anche produCe un modello più chiara di Nissl in prossimità della superficie di sezioni spesse da quella mostrata in precedenza rapporti, anche quando si utilizza sezioni molto più sottili ^{19, 20, 21.} La variante protocollo che comprende la fase di congelamento produce risultati accettabili per l'analisi della morfologia dendritica albero. Tuttavia, la colorazione di fondo è molto più scuro che nel tessuto fresco, che è più evidente quando l'imaging approfondire la fetta rendendo così più difficile visualizzare e quantificare spine dendritiche (Figura 2 C). Abbiamo tentato la colorazione di contrasto viola cresolo nelle sezioni di cervelli che erano stati congelati, e ciò produsse uno sfondo purple haze anche-scuro che ha reso estremamente difficile da visualizzare e quantificare spine nella parte inferiore della sezione (dati non riportati). Un'altra variante di protocollo senza successo che è stato valutato incluso il congelamento cervello di topo prima di Golgi-Cox impregnzione. Questo ha portato alla colorazione di oggetti cellulari che possono essere stati glia, ma non macchiare qualsiasi tipo di neurone (dati non mostrati).

Ci sono due passaggi critici in questo protocollo che deve essere seguita per ottenere risultati di successo. (1) È fondamentale verificare il tempo di asciugatura sezioni all'interno ogni laboratorio, perché questo è fortemente dipendente dalla temperatura e dall'umidità. Se il tempo di asciugatura è troppo breve, le sezioni saranno cadere le diapositive durante il processo di disidratazione; se il tempo di asciugatura è troppo lungo, le sezioni si crepa. Sarebbe vantaggioso per verificare il tempo di asciugatura in una serie di cervelli "test" appena prima di preformazione uno studio di ricerca, in quanto questo può variare di stagione anche con lo stesso laboratorio. (2) Tutti eccesso agar deve essere rimossa dalla sezione e vetrino prima delle fasi di disidratazione. Se questo non avviene, l'agar si deformerà e può tirare la sezione fuori della slitta.

Un altro fattore importante per l'istologicoanalisi al di campioni biologici è restringimento del tessuto. Abbiamo trovato che dopo la lavorazione, il montaggio, la disidratazione e coprioggetto sezioni di cervello utilizzando il protocollo principale Golgi-Cox che lo spessore della sezione finale è stato ridotto di circa la metà del valore taglio originale (Figura 4). Si noti inoltre che le sezioni trasformati utilizzando il protocollo variante che includeva la fase di congelamento erano significativamente più spessa delle sezioni fresche che sono stati elaborati tramite il protocollo principale (Figura 4). Questo è stato sia interessante e inaspettato, perché entrambi i protocolli coinvolti gli stessi passi crioprotezione e di lavorazione, e solo differivano dal congelamento effettivo del cervello. È quindi fondamentale per tenere conto di eventuali differenze di protocolli quando si confrontano i dati neurone morfologia generati utilizzando Golgi-Cox colorazione da studi diversi o da diversi laboratori. Anche se non siamo stati in grado di trovare i dati per spessore della sezione finale in letteratura, sarebbe utileper gli investigatori di segnalare questi dati e / o correggere il restringimento dei tessuti quando si segnalano misure di neuroni morfologia. Va inoltre osservato che, sebbene lo spessore finale> 200 micron per sezioni tagliate a 500 um è maggiore della distanza di lavoro di maggior parte degli obiettivi ad alto ingrandimento, questo è ancora ben all'interno della distanza di lavoro dell'obiettivo 30X utilizzato nel nostro laboratorio. Poiché dendriti e spine sono chiaramente visibili nella parte inferiore di queste porzioni utilizzando il protocollo principale Golgi-Cox, può essere possibile visualizzare neuroni contenuti in sezioni tagliate ad una maggiore spessore fino al tra 1 mm.

Anche se questo protocollo offre una serie di vantaggi tra cui la possibilità di tracciare lunghi pergolati dendritiche all'interno delle singole sezioni, la possibilità di ritardare affettare e l'elaborazione dei cervelli impregnati, e la possibilità di controcolorazione con violetto cresolo per meglio identificare strutture cerebrali, ci sono alcuni svantaggi che dovrebberoessere considerato. Il periodo di incubazione di 25 giorni può essere considerato troppo lungo per alcuni ricercatori. La capacità di immagine in profondità sezioni montate dipende accesso a un obiettivo ad immersione ad alta risoluzione con una lunga distanza di lavoro, che è relativamente costoso. Inoltre, la capacità di visualizzare strutture fini con alta risoluzione diminuisce come uno immagini vicino al fondo della fetta montato. L'implementazione di questo protocollo dipende quindi le proprietà morfologiche dei neuroni e regione del cervello da studiare, e le attrezzature disponibili al ricercatore. Si consiglia l'uso di campioni di "prova" per ottimizzare le variabili di protocollo prima di eseguire uno studio di ricerca, come ad esempio Golgi-Cox tempo di impregnazione per le dimensioni del cervello e regione di interesse, e il piano e lo spessore di sezionamento per il pergolato dendritiche a essere visualizzato.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo lavoro è stato sostenuto da un Discovery Grant CDCB dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC), un John R. Evans Leaders Fund infrastruttura di ricerca concessione di CDCB dal Canada Fondazione per l'innovazione (CFI numero di progetto 30381), e un Discovery Grant NJM da NSERC. ELL è stato sostenuto da una borsa di studio Ontario Laureato e da una borsa di studio OVC dalla Ontario Veterinary College presso l'Università di Guelph. CDS è stato supportato da una ricerca assistentato Undergraduate Student da NSERC. ALM è stato sostenuto da una borsa di studio Alexander Graham Bell da NSERC e da una borsa di studio OVC dalla Ontario Veterinary College presso l'Università di Guelph.