נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

אנו מציגים פרוטוקול בשיטת מכתים גולגי-קוקס בסעיפי מוח עבים, כדי להמחיש נוירונים עם עצי דנדריטים ארוכים בתוך דגימות רקמה אחת. שתי גרסאות של פרוטוקול זה גם מוצגים שכוללות counterstaining סגול cresyl, והקפאת המוח מעובד עבור אחסון לטווח ארוך.

שיטת גולגי-קוקס של מכתים נוירון הועסקה במשך יותר ממאתיים שנים כדי לקדם את ההבנה שלנו של מורפולוגיה הנוירון בתוך דגימות מוח היסטולוגית. אמנם עדיף מנקודת מבט מעשי להכין חלקים במוח על העובי הרב ככל האפשר, על מנת להגדיל את ההסתברות לזיהוי נוירונים צבעונית כלולות מלאות בקטעים בודדים, גישה זו היא מוגבלת מבחינה טכנית על ידי מרחק העבודה של גבוה -magnification מטרות מיקרוסקופ. אנו מדווחים כאן פרוטוקול להכתים נוירונים בשיטת גולגי-קוקס בסעיפים המוח העכבר כי נחתכות על עובי 500 מיקרומטר, וכדי להמחיש נוירונים ברחבי עומק סעיפים אלה באמצעות מיקרוסקופ זקוף מצויד סיליקון 30X ברזולוציה גבוהה 1.05 NA מטרת נפט טבילה כי יש מרחק עבודת 800 מיקרומטר. בנוסף, אנו מדווחים שתי הגירסות שימושיות של פרוטוקול זה שעשוי להיות מועסק על מנת counterstain פני השטח שלרכוב חלקים במוח עם כתם Nissl סגול cresyl, או להקפיא את המוח כולו עבור אחסון לטווח ארוך לפני חתך ועיבוד סופי. הפרוטוקול העיקרי ושתי גרסותיה לייצר חלקים במוח עבים צבעוניים, ברחבי אשר עצי דנדריטים נוירון מלאים קוצי דנדריט ניתן דמיינו בצורה מהימנה לכמת.

הדמיה של נוירונים בודדים בתוך דגימות רקמה מאפשר לניתוח באתרו של מאפיינים מורפולוגיים נוירון, אשר באופן משמעותי קידם את ההבנה שלנו של המוח ואיך זה עלול להיות מושפע המחלה אנדוגניים או גורמים סביבתיים חיצוניים. השיטה המכתימה גולגי-קוקס היא אמצעי פשוט יחסית, חסכוני של מכתים מדגם אקראי של תאי עצב במוח. ראשון שפותח על ידי גולגי ¹ ו שונה על ידי קוקס ² בשנת 1800, חוקר מעודן יותר טכניקה זו לאורך השנים לייצר ברור, נוירונים גם בכתמי רטיבות, יכול לשמש כדי לחזות ולכמת הוא מורפולוגיה עץ הדנדריטים וצפיפות עמוד שדרת ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

שיקול טכני עיקרי עבור להדמיה של נוירונים מוכתמים בתוך חלקים במוח הוא עובי הפרוסה המרבי, אשר מוגבל על ידי מרחק העבודה של מטרות מיקרוסקופ גבוהה הגדלה זמינות / ברזולוציה גבוהה. מטרות נפט טבילה נפוצות 60 - 100X טווחים מהוות ברזולוציה מעולה, אבל הם מוגבלות על ידי מרחקי העבודה שלהם, כי הם בדרך כלל לא יותר מ 200 מיקרומטר. חלקים במוח לחתוך בטווח 200 מיקרומטר יכול להיות מספיק כדי להמחיש סוגי נוירונים מסוימים שיכולים להיות בתוך עובי פרוסה זה, עבור עצב פירמידליים למשל בשכבות רדודות של קליפת המוח ^{10, 11, 12,} עצב פירמידליים באזור CA1 של ^{13, 14} בהיפוקמפוס, וכן תאי גרגיר של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס ^15. נוירונים עם יחסית יותרהעצים הדנדריטים, כגון עצב פירמידליים בתוך רבדים עמוקים של קליפת המוח כי לעכבר יכול להאריך יותר מ 800 מיקרומטר מגוף התא ^16, מספקים אתגר גדול כי המוח היה צריך להיות מחולק בזווית מושלמת להכיל את העץ דנדריט כולו בתוך 200 מיקרומטר פרוסות. זה לא יכול אפילו להיות ריאלי אם דנדריט או כל ענפיו להאריך בכיוון המקורי או זנב. למרות זאת, ניתן להתייחס מגבלה זו על ידי התחקות נוירון בקטעים שונים במוח מרובים הסמוכים, גישה זו מציבה אתגר טכני משמעותי יישור הסעיפים במדויק עבור התחקות ^17. גישה מעשית יותר תהיה לדמיין נוירונים כולו בתוך חלקים במוח כי נחתכים על עובי גדול יותר.

אנו מדווחים כאן טכניקה להכתים נוירונים בתוך 400 - 500 מיקרומטר חלקים במוח עבה של עכברים באמצעות שיטת גולגי-קוקס, וכדי להמחיש mo שלהםrphology באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן סיליקון ברזולוציה גבוהה כי יש מרחק עבודה 800 מיקרומטר. פרוטוקול גולגי-קוקס ההספגה ועיבוד שאנחנו מתארים משתנה מאחד הפרוטוקולים המודרניים ביותר המצוטטים בספרות ^6. הגישה שלנו עם חלקים במוח עבים מספקת את היתרון של הגדלת ההסתברות של זיהוי נוירונים מכל סוג כלול במלואה בתוך הקטע. בנוסף הפרוטוקול העיקרי, אנו נוכחים גם שתי וריאציות המספקות יתרונות ייחודיים: (1) מכתים גולגי-קוקס עם counterstain הסגול cresyl על פני השטח של חלקים רכובים, על מנת להגדיר גבולות אזורים במוח כדי לזהות שכבות של קליפת המוח, ו (2) מכתים גולגי-קוקס עם צעד הקפאה ביניים עבור אחסון לטווח ארוך של המוח כולו ספוג לפני חתך ועיבוד סופי.

עכברות CD1-זן למבוגרים שימשו במחקר זה. מכתים דומה ניתן להשיג באמצעות שני המינים בגילאים שונים. חיות ניסוי טופלו על פי העקרונות והקווים המנחים של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי החיים, וכן את פרוטוקול הניסוי אושר על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת Care Guelph Animal.

1. גולגי-קוקס מכתים

1. גולגי-קוקס הספגה של מוח
   1. הפוך הפתרון גולגי-קוקס של 1% (w / v) dichromate אשלגן, 0.8% (w / v) כרומטי אשלגן 1% (w / v) כלוריד כספיתי ידי המסת dichromate אשלגן כרומטי אשלגן לתוך מים באיכות גבוהה בנפרד . מערבבים הפתרונות, להוסיף את כלוריד כספיתי ולסנן את הפתרון הסופי באמצעות נייר פילטר כיתה 1. אחסן את הפתרון בחושך עד חודש אחד.
   2. להרדים את העכבר באמצעות isoflurane 5%.
   3. להרדים את העכבר על ידי עריפת ראש ובמהירות להסיר את המוח.
   4. מניחים את המוח לתוך בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ"ל המכיל 17 מ"ל של תמיסת גולגי-קוקס דגירה בחושך ב RT עבור 25 ד.
   5. Cryoprotect המוח על ידי הצבת אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של cryoprotectant סוכרוז (30% (w / v) סוכרוז במאגר פוספט 0.1 M, pH 7.4) בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
      הערה: שלושת הצעדים האופציונליים הבאים עשוי להיות מועסק כאלטרנטיבה הפרוטוקול העיקרי, על מנת להקפיא את המוח בשלב זה עבור אחסון לטווח ארוך.
   6. להקפיא את המוח כולו על ידי טבילה אותו לתוך 200 מ"ל איזופנטאן כי כבר precooled על קרח יבש.
   7. מניחים את המוח הקפוא לתוך צינור וחנות חרוטי 50 מ"ל בחושך ב -80 מעלות צלזיוס.
   8. כאשר מוכן להמשיך, להפשיר את המוח על ידי הצבת אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של cryoprotectant סוכרוז בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
2. מוח חתך
   1. הסר את המוח מן סוכרוז גושk זה עבור חתך ידי ניתוק המוחון באמצעות סכין גילוח ולהשאיר יתרון שטוח בסוף הזנב הנותר של המוח.
   2. אגר חום (3% (w / v) במים) עד שהוא נמס ומצננים עד שהוא מעט מעל נקודת ההיתוך שלה.
   3. מניח את המוח בצלחת לשקול הפנויה קטנה עם מטה פנים סוף הזנב שלה ולהוסיף כמות מספקת של אגר המומס כדי לכסות את המוח.
   4. לאחר אגר יש הקרושה, לקצץ אגר עודף עוזב כ 2 - 4 מ"מ המקיפים את המוח ואת הדבק המוח לשלב של vibratome עם הפנים כלפי מטה סוף הזנב שלה באמצעות כמות קטנה של דבק cyanoacrylate אתיל.
   5. מלא את אזור הבמה של vibratome עם כמות מספקת של cryoprotectant סוכרוז כדי לכסות את המוח, וסעיף המוח בכל עובי פרוס 400 - 500 מיקרומטר (תלויים באזור במוח להיבחן) באמצעות תדר רטט של 86 רץ מהיר התקדמות להב של 0.125 מ"מ / s.
   6. בעזרת מברשת צבע קטנההמוח במקום, סעיפים לתוך באר של צלחת בתרבית רקמה 6-היטב המכיל מוסיף רשת-bottom-זמינים מסחרית מראש מלא 10 מ"ל של 6% (w / v) סוכרוז במאגר 0.1 M פוספט, pH 7.4.
   7. סעיפי דגירה בחושך ב 4 ° CO / N.
3. פיתוח חלק במוח
   1. שימוש מוסיף התחתונה רשת, להעביר חלקים במוח לתוך באר חדשה המכילה 5 מ"ל של 2% (w / v) paraformaldehyde (ה.ה.ר.) במאגר 0.1 M פוספט, pH 7.4. דגירה על כיסא נדנדה נעה במהירות איטית בחושך ב RT עבור 15 דקות.
   2. לשטוף חלקים פעמים באמצעות העביר בארות חדשות המכילות 5 מיליליטר מים. לשטוף על כיסא נדנדה נעה במהירות בינונית בחושך ב RT עבור 5 דקות.
   3. העברת חלקים לתוך באר חדשה המכילה 5 מ"ל של 2.7% (v / v) אמוניום הידרוקסיד. דגירה על כיסא נדנדה נעה במהירות איטית בחושך ב RT עבור 15 דקות.
   4. לשטוף חלקים פעמים באמצעות העביר בארות חדשות המכילות 5 מיליליטר מים. לשטוף oנה רוקר נע במהירות בינונית בחושך ב RT עבור 5 דקות.
   5. חלקים העבירו לתוך באר חדשה המכיל 5 מיליליטר של המקבע A (ראו טבלת חומרים) כי כבר מדוללים 10x מים מן הריכוז שנרכש מקורי. דגירה על כיסא נדנדה נעה במהירות איטית בחושך ב RT עבור 25 דקות.
   6. לשטוף חלקים פעמים באמצעות העביר בארות חדשות המכילות 5 מיליליטר מים. לשטוף על כיסא נדנדה נעה במהירות בינונית בחושך ב RT עבור 5 דקות.
4. הרכבה חלקה במוח
   1. בעזרת מברשת צבע קטנה, הר חלק על גבי שקופיות מיקרוסקופ. הסרת עודפי מים אגרו באמצעות פינצטה רקמה קטנה. ודא כי כל אגר יוסר לפני שתמשיך עם התייבשות.
   2. אפשר סעיפים לאוויר יבש ב RT במשך כ 45 דקות (400 מיקרומטר חלקים) או 90 דקות (500 מיקרומטר חלקים).
      הערה: התזמון נכון רמת היובש היא קריטית, ואולי צריכה להיקבע בכלמעבדה תלוי בטמפרטורת הסביבה ורמת הלחות. זמן קצר מדי ייבוש מוביל סעיפי נפילה של שקופיות במהלך שלבי התייבשות עקב, וארוך מדי זמן ייבוש מוביל סעיפי פיצוח. סעיפים ימשיכו להיראות מבריק ברמה של יובש המתאימה.
   3. חלקים כתמים סגול cresyl ידי צבת שקופיות לצנצנות מכתימות Coplin כמצוין.
      הערה: צעד אופציונאלי זה עשוי להיות מועסק על סעיפים שמעולם לא קפוא, כדי להכתים גרעינים עצביים עם סגול cresyl. מצאנו כי סליקת rehydrating סעיפים לפני הדגירה ב סגול cresyl מובילה גם מכתימה ורקע נמוך בקטעים שונים.
      1. מניחים בקרחת סוכן עבור 5 דקות. חזור פעם אחת.
      2. מניחים באתנול 100% עבור 5 דקות. חזור פעם אחת.
      3. מניחים באתנול 95% במים, אז 75% אתנול במים, ולאחר מכן אתנול 50% במים במשך 2 דקות כל אחד.
      4. מניחים במים למשך 5 דקות.
      5. מניחים ב 0.5% (w / v) creסגול סיל במים למשך 7 דקות.
      6. מניחים במים במשך 2 דקות. חזור פעם אחת.
   4. מייבשי סעיפים ידי צבת שקופיות לצנצנות מכתימות Coplin כמצוין.
      1. מניחים באתנול 50% במים, אז 75% אתנול במים, ולאחר מכן אתנול 95% במים במשך 2 דקות כל אחד.
      2. מניחים באתנול 100% עבור 5 דקות. חזור פעם אחת.
      3. מניחים בקרחת סוכן עבור 5 דקות. חזור פעם אחת.
         הערה: פעמים התייבשות וסליקה אלה מספיקים כדי לעבד מוח עכבר כמתואר בכתב היד הזה. עם זאת, ראינו עבור מינים אחרים כוללים חולדה cowbird, כי צעד הסליקה הסופי ייתכן שיהיה הצורך להאריך עד 15 דק 'בסה"כ.
   5. חלקי coverslip באמצעות מדיום הרכבה נטול מים.
   6. אפשר שקופיות לייבוש במאוזן בחושך ב RT לפחות ד 5.

2. הדמיה ויטראז נוירונים בתוך חלקים במוח עבים

1. לכידת תמונה סטאקס
   1. הפעל את נורת מיקרוסקופ, מצלמה, ואת הבקר הבמה.
   2. פתח את תוכנת מיקרוסקופ (למשל, Neurolucida).
   3. מקום שקופית על במת מיקרוסקופ.
   4. צלם תמונת 2D בתצוגה רחבה של סעיף המוח באמצעות מטרה בהגדלה נמוכה כגון 0.4 1.25x NA PlanAPO או 4X 0.16 NA
      1. פוקוס התמונה ולהתאים הגדרות המצלמה כולל זמן חשיפה ואיזון לבן.
      2. צור נקודת התייחסות ידי לחיצה שמאלה בכל מקום על הסעיף
      3. צלם את התמונה על ידי בחירה "לרכוש תמונה אחת" בתוך חלון רכישת תמונה.
   5. לכידת ערימות תמונת האמצע ברזולוציה של האזור המכיל את הנוירונים (ים) של עניין, באמצעות מטרת 10X 0.3 NA UPlan FL N.
      1. מקדו את התמונה ולהתאים הגדרות המצלמה כולל חשיפה ואיזון לבן.
      2. קבע את הגבולות העליונים ותחתונים עבור מחסנית התמונה על ידי התמקדות לחלק העליון של המקטעnd בחירה "להגדיר" ליד "בראש הערימה" בתוך חלון רכישת תמונה, ולאחר מכן התמקדות לתחתית בסעיף ובחירה "להגדיר" שליד "בתחתית הערימה" בתוך חלון רכישת תמונה.
      3. הגדר את מרחק צעד 5 מיקרומטר ידי הזנה "5 מיקרומטר" ליד "מרחק בין תמונות" בתוך חלון רכישת תמונה.
      4. צלם את ערימת תמונה על ידי בחירה "ערימת תמונה לרכוש" בתוך חלון רכישת תמונה.
      5. חזור על השלבים לעיל כדי ללכוד את כל האזור של עניין, מוודא שכל ערימות התמונה חופפים ידי 10% לפחות ציר X לציר Y.
   6. לכידת ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה של האזור המכיל הנוירון של עניין, באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן סיליקון 30X 1.05 NA.
      1. החל 3 - 4 טיפות של שמן טבילת סיליקון לשקופית ולמקם את המטרה על השקופית, הבטיח ליצור קשר בין המטרה לבין אויl.
      2. מקדו את התמונה ולהתאים הגדרות המצלמה כולל חשיפה ואיזון לבן.
      3. קבע את הגבולות העליונים ותחתונים עבור מחסנית התמונה על ידי התמקדות לחלק העליון של הסעיף ובחירה "להגדיר" ליד "בראש הערימה" בתוך חלון רכישת תמונה, ולאחר מכן התמקדות לתחתית בסעיף ובחירה "להגדיר" ליד "בתחתית הערימה" בתוך חלון רכישת תמונה.
      4. הגדר את מרחק צעד 1 מיקרומטר ידי הזנה "1 מיקרומטר" ליד "מרחק בין תמונות" בתוך חלון רכישת תמונה.
      5. צלם את ערימת תמונה על ידי בחירה "ערימת תמונה לרכוש" בתוך חלון רכישת תמונה.
      6. חזור על השלבים לעיל כדי ללכוד את כל האזור של עניין, מוודא שכל ערימות התמונה חופפים ידי 10% לפחות ציר X לציר Y.
   7. שמור את קובץ הנתונים ולשמור את כל קבצי תמונה בפורמט TIFF עבור עיבוד חיצוני.
2. יצירת תמונות הקרנת Z ו- Image מצרפים
   1. צור תמונות הקרנת Z ב ImageJ
      1. תוכנת ImageJ Open כי יש התוסף ביו-הפורמטים מותקנים.
      2. בחר "תוספים" -> "ביו-פורמטים" -> "יבואן ביו-פורמטים".
      3. בחר את קובץ ערימת התמונה להיפתח.
      4. לאחר שהקובץ נפתח, לשנות את הפורמט ל RGB על ידי בחירת "תמונה" -> "סוג" -> "צבע RGB".
      5. צור את הקרנת-Z על ידי בחירת "תמונה" -> "סטאקס" -> "פרויקט Z ...".
      6. שמור תמונה דו-ממדית Z-הקרנה כקובץ TIFF.
   2. צור מונטאז תמונה דו-ממדית של כל האזור של עניין.
      1. פתח את התוכנה (למשל, Adobe Photoshop).
      2. בחר "קובץ" -> "אוטומציה" -> "מיזוג תמונות".
      3. בחר "עיון" ולאחר מכן להוסיף את כל imagקבצי es ימוזגו.
      4. ודא כי "למזג את התמונות יחד" נבחרה ולאחר מכן בחר "אישור".
      5. שמור את תמונת מונטאז וכתוצאה של האזור כולו עניין כקובץ TIFF.

פרוטוקול מכתים גולגי-קוקס זה והגירסות האופציונליות שניית תיאר שלה עשויים להיות מועסקים על מנת להמחיש נוירונים בודדים בתוך 400 - 500 מיקרומטר חלקים במוח עבה. מצרפי תמונה נציג תחזיות-Z דו ממדים שנתפסו באמצעות מטרת 10X ו 5 מיקרומטר שלבי ציר Z מוצגים באיור 1: A1 - C1 עבור שטח גדול של חלקים במוח עטרה הכולל באזור קליפת המוח הקדמי cingulate 1 ואת הקורטקס המוטורי משנית ^18. סעיפים נחתכו ב 500 מיקרומטר. שים לב וריאנט פרוטוקול הכולל מכתים סגול cresyl מאפשרת זיהוי של שכבות תאים בקליפת המוח, למשל, כפי שניתן לראות על שכבת קליפת המוח 1 לאורך משטח pial הסעיפים באיור 1B1. הערה גם את המראה הדומה של חלקים צבעוניים בעת שימוש בפרוטוקול הראשי באמצעות כל-הטרי הרקמה (האיור 1A1) ואת וריאנט הפרוטוקול שבוהמוח הוקפאו חלק דרך עבור אחסון לטווח ארוך (איור 1C1).

השימוש ברזולוציה גבוהה 30X 1.05 אובייקטיבי NA סיליקון נפט טבילה מאפשר הלכידה של ערימות תמונה שגודלם של צירה X ו- Y. מאלה שנתפסו באמצעות מטרה גדלה גבוהות יותר, וכן הוא מחייב ערימות הכוללות פחות לתמונה נתונה תחום עניין. המטרה המסוימת המועסקת יש מרחק עבודת 800 מיקרומטר, אשר הוא יותר מדרוש כדי חלקים במוח עבים תמונה. מצרפי תמונה של תחזיות-Z דו ממדים שנתפסו באמצעות המטרה הזו 1 מיקרומטר שלבי ציר Z מוצגים באיור 1 (A2-C2) בתוך שטח פיתול חגורה הקדמית 1, ושני ממדים Z-תחזיות של העתקים עבור נוירונים הצביעו מוצגים איור 1: A3 - C3. שימו לב תמונות ברזולוציה גבוהה המאפשרים הדמיה של נוירונים דנדריטים שלהם דרךעומק של כל ערימת תמונה. גרסת הפרוטוקול באמצעות סגול cresyl מוסיפה מכתים Nissl סגול ברחבי הפרוסה, אולם עם הפרמטרים מועסקים מכתים הסלולר זה הוא ציין רק ליד החלק העליון של הפרוסה. גרסת הפרוטוקול הכוללת את צעד ההקפאה האופציונלי מייצרת מכתים נוירון דומת הפרוטוקול העיקרי, אולם זה גם מציג מכתים רקע מפוזר שיוצר את המראה של אובך ידי diffracting אור מתחת לפני השטח של הפרוסה. האובך הזה בולט במיוחד כאשר הדמיה עמוק לתוך הפרוסה, ניכר בתמונה-הקרנת Z באיור 1C2. תמונות שנתפסו באמצעות מטרת 30X עשויים לשמש גם כדי לחזות ולכמת מבנים בסדר עצביים כגון קוצים הדנדריטים. תמונות Single-המטוס מוצגות באיור 2 עבור דנדריטים מוכתמים באמצעות פרוטוקול הראשי ושני גירסאותיה, עם תמונה אחת נלקחה סמוך לראש הסעיף ותמונה אחת נלקחה סמוך לתחתית הקטע. שימו לב purplמכתים סגול דואר cresyl של חומר Nissl בתוך גרעינים עצביים בודדים סמוך לראש הסעיף באיור 2B1, אשר נתפס רקע סגול דיפוזי / אור פזור בחלקו התחתון של החלק באיור 2B2. שים לב גם כי למרות דנדריטים הקוצים שלהם הם גם מוכתמים באמצעות הפרוטוקול עם הצעד המקפיא, האובך ברקע בעבר הזכיר כי הוא לכאורה קרוב לתחתית של הפרוסה באיור 2C2 מקשה לדמיין קוצים על ידי הגבלת הניגוד בין אותם ואת הרקע הסמוך. מטרות-גדלה גבוהה יכולות לשמש גם כדי לאפיין מורפולוגיה שדרה דנדריטים, כמו להראות באיור 2: A3 - C3 איפה קוצים של סוגים שונים גלויים לעין בסעיפים מוכתמים באמצעות אחת משלושת הפרוטוקולים. הנה, טבילה אובייקטיבית שמן 60X 1.42 NA שמש. אנחנו גם עובדים פרוטוקול מכתים זו גירסאותיה להכתים נוירונים בתוך hippocampus סעיפים לקצץ ב 400 מיקרומטר. כפי שניתן לראות בתרשים 3, דנדריטים הקוצים נוירון ניתן דמיינו הן כלפי אזורים יותר-מדיאלי של הסעיף (למשל, באזור gyrus משוננת בהיפוקמפוס באיור 3: A2 - C2) והאזורים-צדדיים יותר של הסעיף (למשל , באזור CA3 בהיפוקמפוס באיור 3: A3 - C3). כמו כן יש לציין כי בכל מצב מכתים הניבו תוצאות דומות, יתרונות וחסרונות אלו מוצגים איורים 1 & 2 עבור קליפת המוח.

העובי הסופי של חלקים במוח מעובד תלוי גרסת הפרוטוקול הספציפית המועסקת. כפי שניתן לראות בתרשים 4A עבור מקטעים המכילים קליפת המוח וגוזר 500 מיקרומטר, הייתה השפעה משמעותית של גרסת פרוטוקול על העובי המדוד של מעובד רכוב / חלקי coverslipped (חד סטרי ANOVA, p <0.000 1). הנה, העובי של חלקים שנעשה באמצעות הפרוטוקול הראשי (251.0 ± 12.5 (SEM) מיקרומטר (n = 6)) לבין גרסת הפרוטוקול המעורבת סגול cresyl (219.3 ± 8.5 מיקרומטר (n = 6)) היה קטן יותר בעובי של סעיפים עשה באמצעות גרסת הפרוטוקול מעורב הצעד המקפיא (340.6 ± 17.1 מיקרומטר (n = 6)) (מבחן בונפרוני פוסט-הוק, כל p השוואת ≤ 0.0006). מאוד תופעות דומות של וריאנט פרוטוקול נצפו עבור מקטעים המכילים בהיפוקמפוס וגוזרים 400 מיקרומטר (איור 4 ב, חד סטרי ANOVA, p <0.0001). הנה, העובי של חלקים שנעשה באמצעות הפרוטוקול הראשי (217.6 ± 19.2 מיקרומטר (n = 6)) לבין גרסת פרוטוקול מעורב סגול cresyl (198.0 ± 14.8 מיקרומטר (n = 6)) היה קטן יותר בעובי של חלקים העשויים ממרכיבים גרסת פרוטוקול מעורבת הצעד המקפיא (313.5 ± 8.4 מיקרומטר (n = 6)) (Bonferroni פוסט-הוק מבחן, כל השוואה p ≤ .001).

r.within-page = "1">
איור 1. למופת Photomicrographs של ויטראז נוירונים באזור Anterior cingulate 1. A1 - C1, תחזיות-Z הממוזגות של ערימות תמונה נרכשו באמצעות מטרת 10X מוצגות עבור חץ כדור אחד של קליפת המוח שכוללת את האזור בקליפת המוח הקדמי cingulate 1 ומשני הקורטקס המוטורי בכ גבחת 1.18 מ"מ ^18. סעיפים אלה נחתכו ב 500 מיקרומטר. Photomicrographs מוצג באמצעות הפרוטוקול כל-הטרי הראשי (A1), עבור גרסת הפרוטוקול הטריה עם המכתים הסגול cresyl (B1) ועבור גרסת הפרוטוקול שבו המוח הוקפא בעקבות הספגה גולגי-קוקס (C1). ברי סולם הם 500 מיקרומטר. ברזולוציה גבוהה יותר התמזגה ערימות תמונת Z-הקרנת רכש באמצעות מטרת טבילת שמן סיליקון 30X מוצגים A2 - C2 עבור כל אזור שצוין על ידי ר האדוםuare ב photomicrographs ב A1 - C1. ברי סולם הם 100 מיקרומטר. 2D Z-תחזיות של העתקי נוירון מוצגות A3 - C3 עבור נוירונים המסומנים בחץ האדום photomicrographs של A2 - C2. קוטר כל דנדריטים נקבעו ל 2 מיקרומטר על מנת להקל על האיור. ברי סולם הם 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. למופת Photomicrographs של הקוצים הדנדריטים עבור ויטראז נוירונים. Photomicrographs שנתפס באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן 30X סיליקון מוצג מטוס אחד מוקד דנדריטים נוירון הממוקמים בתוך השכבה 1 של אזור פיתול החגורה הקדמית 1. מקטעים אלו נחתכו ב 500 מיקרומטר. נוירונים היו מוכתמים באמצעות f פרוטוקול ריש (A1, A2), גרסת הפרוטוקול עם מכתים סגול cresyl (B1, B2) ועבור גרסת הפרוטוקול שבו המוח הוקפא בעקבות ההספגה גולגי-קוקס (C1, C2). Photomicrographs נלקחו בסמוך לחלקו העליון של הפרוסה (A1 - C1) וליד התחתון של פרוסה ליד המגלשה מיקרוסקופ (A2 - C2). ברי סולם עבור A1-2, B1-2 ו C1-2 הם 50 מיקרומטר. Photomicrographs מוצגים A3, B3 ו- C3 עבור מטוס אחד המוקד באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן 60X-הגדלה גבוהה, על מנת לזהות סוגים שונים בעמוד השדרה. ברי סולם עבור A3, B3 ו- C3 הם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

55,358 / 55358fig3.jpg"/>
איור 3. למופת Photomicrographs של ויטראז נוירונים בהיפוקמפוס. Photomicrographs שנתפס באמצעות מטרת 4X מוצג מטוס אחד מוקד נוירונים מוכתמים באמצעות הפרוטוקול הטרי (A1), גרסת הפרוטוקול עם מכתים הסגול cresyl (B1) ועבור גרסת הפרוטוקול שבו המוח הוקפא בעקבות הספגה גולגי-קוקס (C1 ). סעיפים נחתכו ב 400 מיקרומטר מוצגים כ -2.18 גבחת מ"מ ^18. ברי סולם הם 500 מיקרומטר עבור A1 - C1. Photomicrographs גדלה הגבוהה נתפסה באמצעות מטרת נפט טבילת סיליקון 30X ומוצגת במישור אחד מוקד נוירון דנדריטים ממוקמת בתוך אזור gyrus המשונן של ההיפוקמפוס (A2 - C2) ובאזור CA3 של ההיפוקמפוס (A3 - C3). ברי סולם הם 50 מיקרומטר עבור A2 - C2ו- A3 - C3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. עובי סעיפי Mounted. העובי נמדד סעיפים רכוב מוצג עבור מקטעים המכילים קליפת המוח על כ גבחת 1.18 מ"מ ¹⁸ וגוזרים 500 מיקרומטר עובי, וב B עבור מקטעים המכילים בהיפוקמפוס על כ -2.18 גבחת מ"מ ¹⁸ וגוזרים 400 מיקרומטר עוֹבִי. חלקים שנמדדו היו מוכתמים באמצעות בפרוטוקול הטרי, גרסת הפרוטוקול עם מכתים סגול cresyl, או גרסת הפרוטוקול שבו המוח הוקפא בעקבות הספגה גולגי-קוקס. בשני אזורים במוח, יש אפקט משמעותי של פרוטוקול עיבוד(חד כיווני ANOVA, p <0.0001), שבו חלקים מן המוח שהייתה בדרך חלק קפוא באמצעות הפרוטוקול היו עבים יותר באופן משמעותי מאשר אלו שלא הוקפאו (Bonferroni פוסט-הוק מבחן, כל p <0.001). נתונים מוצגים כממוצע ± SEM לשישה חלקים בכל קבוצה, וכן ערכות נתונים עם אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנו מתארים כאן פרוטוקול מכתים גולגי-קוקס יחד עם שתי הגירסות שימושיות המאפשרים הדמיה נוירונים בתוך חלקים במוח עבים. כפי שניתן לראות תוצאות הנציג, השימוש מטרה ברזולוציה גבוהה כי יש מרחק 800 מיקרומטר עבודה ארוך מאפשר הדמיה של נוירונים אמינות כולו ברחבי העומק חלק במוח לחתוך ב 500 מיקרומטר. מחקר זה של חלקים במוח עבים יחסית מגדיל את ההסתברות כי נוירונים מוכתמים מכל סוג מוכלים במלואם בתוך הפרוסה, אשר חשובה במיוחד עבור עצב פירמידליים עם עצי דנדריט פסגה ארוכים ומסובכים. לדוגמא, בסעיפי עטרה של מוח מכרסם, זה מאפשר הכללת נוירונים שמרחיבים הלאה בכיוון המקורי או זנב, וגם מגדיל את המקום לטעויות כאשר חוסם את המוח היישר אל שלב החתך. למרות שאנו מתארים המוח חתך במישור העטרה בלבד, פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם עבור חתך ב pl אחריםAnes כנדרש כדי להכיל שכותרתו נוירונים מלא בקטעים בודדים. המטוס של חתך מועסק יהיה תלוי המאפיינים המורפולוגיים של אוכלוסיית נוירון תחת חקירה. הקוצים הדנדריטים ניתן דמיינו לכמת באמצעות פרוטוקול זה, אם כי מטרות בהגדלה גבוהה יותר נדרשים להעריך סוג השדרה / מורפולוגיה כגון אובייקטיבי הנפט טבילה 60X המשמש לייצור photomicrographs באיור 2: A3 - C3. זה יכול להיות מועסק בסעיפים עבים אך היא מוגבלת לחלק העליון של הפרוסה בתוך מרחק העבודה של האובייקטיביות. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לשימוש מינים שונים של גודל המוח דומה, שכן מצאנו כי תקופה הספגה 25-יום רגיל יהיה כתם נוירונים באופן מלא לאורך כל עכבר, חולדה המוח cowbird ללא שמוביל מכתים הלא ספציפית עודף או רקע שעלול להתרחש עם תקופות הספגה מעבר לחודש אחד. תקופות הספגה שורטר עשויות להספיק מינים עם היםמוח Maller או גזורות דגימות של מוחות מן המינים הנ"ל, אשר יכול להיות מותאם על ידי חוקר הפרט.

מבינים שלוש הגירסות הציגו עבור פרוטוקול מכתים זו, הפרוטוקול העיקרי באמצעות דגימות מוח טריות שאינם counterstained מניב את התוצאות הטובות ביותר. Photomicrographs באיור 2 להוכיח כי פרוטוקול עיקרי זה מייצר דנדריטים היטב שכותרתו קוצים הנראים בקלות ליד החלק העליון והתחתון של חלקים עבים רכובים. הוספת counterstain סגול cresyl יש את היתרון של הקלת הגדרה של אזורים במוח שכבות קליפת המוח, אלא גם הוסיף רקע סגול דיפוזי כאשר לדמיין עמוק לתוך חלקים עבים. עם זאת, מאז גרסת פרוטוקול זה רק מכתימה את פני השטח של חלקים עבים רכובים עם סגול cresyl, דנדריטים הקוצים שלהם נראו בבירור קרוב לתחתית של חלקים (איור 2 B). זה גם נראה produCE דפוס ברור של מכתים Nissl סמוך לפני השטח של חלקים עבים מזה המוצג בדוחות בעבר, אפילו בעת שימוש בסעיפים רזים הרבה ^{19, 20, 21.} גרסת הפרוטוקול הכוללת את הצעד המקפיא מניב תוצאות מקובלות לניתוח מורפולוגיה עץ הדנדריטים. עם זאת, מכתים הרקע הוא הרבה יותר כהה כי ברקמה טריה, וזה הכי בולט כאשר הדמיה עמוקה לתוך הפרוסה ובכך מקשה לחזות ולכמת קוצי דנדריט (איור 2 ג). אנחנו ניסינו את כוחו counterstain הסגול cresyl בסעיפים מן המוח כי שהוקפאו, וזה הפיק אובך רקע סגול אפילו-כהה כי הקשה מאוד לחזות ולכמת קוצים קרובים לתחתית של הסעיף (מידע לא מוצג). עוד גרסה פרוטוקול מוצלח כי החוקרים בדקו את הקפאת מוח עכבר לפני impregn גולגי-קוקסation. זה הביא מכתים של חפצים הסלולר כי ייתכן שיהיה גליה כבר, אבל לא להכתים כל סוג של נוירון (מידע לא מוצג).

ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה שיש אחריו כדי להשיג תוצאות מוצלחות. (1) חשוב מאוד לוודא את זמן הייבוש של חלקים בתוך כל מעבדה, כי זה תלוי מאוד בטמפרטורה ובלחות. אם זמן הייבוש קצר מדי, חלקים ייפלו השקופיות במהלך תהליך ההתייבשות; אם זמן הייבוש ארוך מדי, חלקים ייסדק. זה יהיה יתרון לאמת זמן ייבוש ב סט של מוחות "מבחן" רק לפני מבצעת מחקר, כמו זה יכול להשתנות לפי עונה אפילו עם אותה המעבדה. (2) כל אגרו העודף יש להסיר מן שקופית הסעיף ו מיקרוסקופ לפני צעדי ההתייבשות. אם זה לא נעשה, אגר יעוות ועלול למשוך את החלק off של השקופית.

גורם חשוב נוסף עבור היסטולוגיתניתוח al של דגימות ביולוגיות הוא הצטמקות רקמות. מצאנו כי לאחר עיבוד, הרכבה, להתייבשות ו coverslipping חלק במוח באמצעות פרוטוקול גולגי-קוקס הראשי כי עובי החלק האחרון הופחת על ידי כמחצית משווי לחתוך המקורי (איור 4). כמו כן שימו לב כי החלקים מעובדים באמצעות גרסת הפרוטוקול שכלל את צעד ההקפאה היו עבים יותר באופן משמעותי מאשר החלקים הטריים שעובדו באמצעות הפרוטוקול הראשי (איור 4). זה היה גם מעניין ולא צפוי כי הפרוטוקולים הם מעורבים באותו צעדי cryoprotection ועיבוד, ונבדלו רק בקפיאתה בפועל של מוח. לכן הוא קריטי כדי להסביר הבדלים אפשריים בין פרוטוקולים כאשר משווים נתוני מורפולוגיה הנוירון שנוצרו באמצעות מכתים גולגי-קוקס ממחקרים שונים או ממעבדות שונות. למרות שלא הצלחנו למצוא נתונים לגבי עובי החלק האחרון בספרות, זה יהיה מועילעבור חוקרים לדווח נתונים אלה ו / או נכונים עבור הצטמקות רקמות כאשר דיווח מדדים של מורפולוגיה הנוירון. ראוי גם לציין כי למרות העובי הסופי של> 200 מיקרומטר עבור חלקים לחתוך ב 500 מיקרומטר עולה מרחק העבודה של רוב מטרות בעלות גדלה, זה עדיין טוב בתוך מרחק העבודה של אובייקטיבי 30X בשימוש במעבדה שלנו. מאז דנדריטים הקוצים נראים בבירור קרוב לתחתית של פרוסות אלה באמצעות פרוטוקול גולגי-קוקס העיקרי, ייתכן שניתן לדמיין נוירונים בתוך הסעיפים לחתוך בעובי גדול בהרבה עד וכולל טווח 1 מ"מ.

למרות בפרוטוקול זה מציע מספר היתרונות כולל היכולת להתחקות סוכות דנדריטים ארוכות במדורים יחידים, האפשרות לדחות חיתוך ועיבוד של מוח הספוג, ואת האפשרות של counterstaining סגול cresyl לזהות טובה יותר מבנים במוח, יש כמה חסרונות כי צריךתתחשב. תקופת הדגירה 25 היום ניתן נחשב ארוך מדי עבור חוקרים מסוימים. יכולת תמונה עמוקה למקטעים רכובים תלוי גישה אובייקטיבית טבילה ברזולוציה גבוהה עם מרחק עבודה ארוך, שהוא יחסית יקר. בנוסף, היכולת לדמיין מבנים בסדר עם רזולוציה גבוהה פוחתת כאחת תמונות בחלקו התחתון של הפרוסה הרכובה. יישום פרוטוקול זה תלוי לפיכך המאפיינים המורפולוגיים של נוירונים באזור המוח כדי להיחקר, ואת הציוד העומד לרשות החוקרת. אנו ממליצים על שימוש בדגימות "מבחן" כדי לייעל משתנים פרוטוקול לפני ניהול מחקר, כגון זמן הספגה גולגי-קוקס לגודל של המוח באזור של עניין, ואת המטוס ועובי חתך את סוכת הדנדריטים דמיין.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

עבודה זו נתמכה על ידי דיסקברי גרנט כדי CDCB מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC), מענק התשתית המחקרית קרן מנהיגים ג'ון ר אוונס כדי CDCB מקנדה קרן חדשנות (מספר הפרוייקט CFI 30,381), ועל ידי דיסקברי גרנט כדי NJM מן NSERC. ELL נתמכה על ידי מלגת בוגר אונטריו ידי מלגות OVC מהמכללה וטרינרית אונטריו באוניברסיטת Guelph. CDS נתמכה על ידי משרת אסיסטנט מחקר סטודנט לתואר ראשון מ NSERC. ALM נתמכה על ידי מלגת אלכסנדר גרהם בל מ NSERC ועל ידי מלגות OVC מהמכללה וטרינרית אונטריו באוניברסיטת Guelph.