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Questo articolo descrive una procedura per l'induzione della retina danno da ischemia-riperfusione da elevata pressione intraoculare nei topi. Retina danno da ischemia-riperfusione da elevata pressione intraoculare serve per modellare patologie umane caratterizzate da ossigeno compromessa e consegna dei nutrienti nella retina, consentendo ai ricercatori di esaminare i potenziali meccanismi cellulari e trattamenti per le malattie umane dell'unità neurovascolare della retina.
Retina ischemia-riperfusione (I / R) è un processo fisiopatologico contribuire al danno cellulare in più condizioni oculari, inclusi il glaucoma, retinopatia diabetica, e occlusioni vascolari retiniche. modelli di roditori di danno I / R stanno fornendo spunti significativi in meccanismi e strategie di trattamento per I / R ferita umana, soprattutto per quanto riguarda i danni neurodegenerativo nell'unità neurovascolare della retina. Presentato qui è un protocollo per indurre retina lesioni I / R nei topi attraverso l'elevazione della pressione intraoculare (IOP). In questo protocollo, la camera anteriore oculare è cannulata con un ago, attraverso il quale scorre la goccia di un serbatoio salina elevata. Utilizzando questa goccia per aumentare IOP sopra sistolica pressione arteriosa, un professionista interrompe temporaneamente il flusso di sangue interno della retina (ischemia). Quando la circolazione viene ripristinato (riperfusione) per la rimozione della cannula, gravi danni cellulari ne deriva, in ultima analisi, con conseguente nella neurodegenerazione della retina. Stud recentii dimostrano l'infiammazione, la permeabilità vascolare, e capillare la degenerazione come ulteriori elementi di questo modello. Rispetto alle metodologie di I / R retina alternativi, come la legatura delle arterie della retina, ho retinica / infortunio R da elevata IOP offre vantaggi nella sua specificità anatomica, trattabilità sperimentale, e l'accessibilità tecnica, proponendosi come uno strumento prezioso per l'esame patogenesi neuronale e terapia in l'unità neurovascolare della retina.
Retina ischemia-riperfusione (I / R) caratterizza molte patologie retiniche umane, compreso il glaucoma, retinopatia diabetica, e occlusioni vascolari retiniche 1. In retina I / R, riduzione del flusso sanguigno (ischemia) nei vasi della retina crea uno stato di ipersensibilità della retina di ossigeno e altre sostanze nutritive, precipitando gravi ossidativo e danno infiammatorio quando la circolazione viene successivamente ripristinato (riperfusione) 2. La retina neurale appare particolarmente vulnerabili a questi cambiamenti, con neurodegenerazione retinica è forse la caratteristica più saliente del danno I / R-indotta. Qui presentata è un protocollo per modellare retinica lesioni I / R nel topo. Questa tecnica consente ai ricercatori di esaminare i potenziali meccanismi e strategie di trattamento per le malattie umane dell'unità neurovascolare della retina.
Lanciato nel 1952 da chirurghi cercano di capire le conseguenze neurodegenerative di anemia chirurgica 3, rodent della retina I / R da elevata pressione intraoculare (IOP) è stata ristabilita nel 1991 con lo scopo di uniformare gli endpoint neurodegenerative dopo insulto ischemico 4. Utilizzando la goccia di un serbatoio di soluzione salina per aumentare IOP sopra la pressione sanguigna sistolica, questi studi hanno dimostrato che sotto pressione incannulamento oculare è stato sufficiente a sospendere la circolazione retinica e quindi avviare la degenerazione neuronale. Più recenti sforzi utilizzando retina I / R da elevata IOP hanno iniziato ad elaborare i meccanismi alla base di I / R-indotta neurodegenerazione retinica 5-12. Diversi gruppi hanno riportato alterazioni patologiche aggiuntive, tra cui l'infiammazione 13,14, la permeabilità vascolare 15,16, e capillare degenerazione 14,17. Presi insieme, questi studi hanno stabilito retina lesione di I / R da elevata IOP come modello di malattia neurovascolare della retina, più in generale.
Caratterizzazione dei meccanismi di danno I / R è essenziale per lo studio di vamalattia scular. Retinica lesioni I / R da elevata IOP è uno dei tanti modelli di lesioni indotta da ipossia, tra cui le lesioni di I / R in polmone 18, il cuore, il cervello 19 20, fegato, reni 21 22, e intestino 23. Questi modelli sono stati di primaria importanza nel promuovere la nostra comprensione della malattia vascolare e dei suoi rimedi clinici. Estendendo lo studio dei processi di I / R per tessuti oculari, ho retina / lesioni R da elevata IOP aiuta a dipingere un quadro più completo di queste condizioni correlate.
Corrispondente a stretto contatto con le condizioni cliniche neurodegenerative in retina, ho retina / lesioni R da elevata IOP presenta uno strumento prezioso per i ricercatori interessati ad esplorare patogenesi ischemica. Il protocollo qui descritto è mirato, trattabili, e accessibile. Si è completato bene da endpoint in degenerazione neuronale, come la quantificazione dei neuroni della retina, la misurazione dello spessore della retina, e R elettrofisiologicoecording della funzione dei neuroni della retina. Questo modello ha dimostrato la sua utilità nel portare avanti un'indagine neurovascolare, e si vede promessa a guadagnare status di un protocollo fondamentale nella ricerca della medicina visiva.
Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Johns Hopkins University.
Nota: I topi utilizzati durante le riprese sono C57BL / 6 topi da Jackson, anche se altri ceppi di roditori o specie possono anche essere usati. Quando si utilizzano altri ceppi o specie, essere consapevoli del fatto che i dosaggi di anestesia e sequenza temporale lesioni possono variare. È importante adattare condizioni I / R per ospitare ceppo, specie e variazioni sperimentali.
1. Preparare il cocktail di anestesia
2. Preparare l'anestesia Booster
3. Preparare la sala operatoria
4. Preparare la soluzione salina bilanciata con eparina di sodio
5. Impostare la IV Polo
6. Impostare l'eparina sodica Drip
7. Preparare i topi per Chirurgia
8. cannulate camera anteriore
9. Monitor anestesia
10. Rimuovere la cannula dalla camera anteriore
11. Pulire l'EqAZIONE DEI DISPOSITIVI
12. Ritorno Tutti i topi nelle loro gabbie per la casa
13. Effettuare la valutazione della retina
Gli effetti neurodegenerativi di I / R retina di elevata pressione intraoculare sono comunemente valutata utilizzando due approcci standard. NeuN immunomarcatura dei nuclei neuronali ha rivelato una significativa perdita di cellule neuronali seguenti I / R insulto (Figura 1). In breve, gli occhi enucleati 7 giorni dopo I / R sono state fissate in paraformaldeide, etichettato con il marcatore delle cellule neuronali NeuN, e tutto montato. Le immagini sono state catturate utilizzando la microscopia confocale, e cellule marcate con NeuN sono stati quantificati contando 11. Le diminuzioni della gangliari conta strato di cellule neuronali indicano che la morte delle cellule / R-indotta.
Le svalutazioni in funzione dei neuroni della retina sono stati documentati con elettroretinografia (Figura 2). In breve, sette giorni dopo I / R, electroretinograms scotopica sono stati registrati in più intensità flash. Ampiezze delle A e B le onde sono stati quantificati utilizzando il software di analisi delle immagini 12. Qui, inferiori A e B onda ampiezze significano I / R menomazioni indotte in funzione neuronale della retina. In questi ed altri parametri I / R, l'/ R occhio non mi serve come un robusto controllo negativo per I / danni R-indotta.
Figura 1. retina I / R Induce neuronale morte cellulare nel livello Ganglion cellulare (GCL). Immagini retiniche rappresentativi di controllo e di I / R occhi sono mostrati con barre di scala che denota 100 micron. (A) Il numero di cellule NeuN-positive nel GCL è significativamente ridotta in I / R occhi rispetto ai controlli (B). n = 9, barra di errore: errore standard, *** p <0.0001 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. retina I / R Compromissione della retina Neuron funzione. Diminuzione a- e ampiezze b-onda indicano compromessa la fisiologia della membrana delle cellule neuronali seguenti I / R. n = 6, barra di errore: errore standard, * p <0.05 Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
I retina / infortunio R da elevata IOP ha dimostrato la sua utilità nella modellazione danni cellulari e disfunzioni, soprattutto neurodegenerazione, nel roditore unità retina neurovascolare. Questa procedura fornisce un tessuto controllo robusto ed è facilmente raggiungibile in termini di sofisticazione tecnica. È stato notato in questo e altri modelli di pregiudizio I / R che aumentando la pressione e la durata di ischemia può aumentare la gravità delle lesioni 24. Per questo motivo, alcuni praticanti hanno scelto di utilizzare pressioni ischemici e durate differenti da quelli presentati qui 4,6-10,12. Pertanto retinica I / lesioni R da elevata IOP offre una vantaggio rispetto alternativi retiniche tecniche I / R in che permette di regolare i parametri chirurgici per accogliere i propri obiettivi particolari sperimentali.
Ciò nonostante, le tecniche alternative sono stati impiegati per l'induzione della retina lesioni I / R nei roditori. Legatura del fascio nervo ottico 25,26 o l'arteria centrale retinica soli 27 è stato usato per arrestare temporaneamente il flusso sanguigno retinico. Strategie simili a condizioni sistemiche hanno richiesto legatura dell'arteria cerebrale 28 o l'arteria cefalica 29 per ridurre il flusso sanguigno senza ostruire pienamente. Una metodologia più raro comporta circonferenziale comprimendo il mondo della retina con un filo che viene pesato su entrambe le estremità 30. Mentre tali strategie hanno contribuito con successo alla comprensione dei cambiamenti neurovascolari ipossia indotta nella retina, la tecnica qui descritta offre diversi vantaggi rispetto queste alternative. Che richiede il minimo danno non solo della retina alla cornea, I / R da elevata IOP riporta un infortunio retina più specificamente mirati che viene offerta con tecniche di legatura e così può essere più utile per i ricercatori interessati a malattie specifiche retina. Inoltre, metodi IOP elevata sono più trattabili rispetto ai modelli legatura o di compressione, in modo che la IMetodo OP consente un rapido raggiungimento di ischemia retinica, così come la successiva riperfusione. Infine, i protocolli IOP elevati richiedono minima sofisticazione chirurgica e tecnologico, e così possono essere più ampiamente accessibile rispetto alle loro alternative.
Retinica lesioni I / R da elevata IOP non è privo di sfide. Incannulazione della camera anteriore richiede manualità e cura deve essere presa per preservare l'integrità del diaframma, lente, e della cornea. Cautela anche consigliato dopo l'inserimento della cannula, come la cannula può essere rimossa dalla camera anteriore, mentre il tubo 30 gauge è fissato con nastro adesivo.
Altri processi critici in questo protocollo sono il mantenimento di una temperatura corpo caldo per gli animali anestetizzati, la somministrazione di richiamo di anestesia in modo tempestivo, e sostenere la lubrificazione della cornea utilizzando ipromellosa. E 'anche importante notare comportamenti di stress mouse o malattia (per esempio, la mancanza di governare, incurvando, Ecc) prima dell'intervento, poiché queste variabili extra-chirurgiche possono influenzare la potenza e la mortalità droga. Frequentando a questi problemi, si può ottenere un modello altamente regolamentato e riproducibile per retina lesioni I / R.
Va inoltre riconosciuto che il pregiudizio della retina I / R da elevata IOP è solo un modello, e si consiglia cautela quando estrapolando i risultati a malattie specifiche, in particolare le condizioni croniche. Mentre diverse da queste malattie nel periodo di tempo e l'origine eziologica, però, ho retina / R lesioni da elevata pressione intraoculare possono comunque fornire una solida piattaforma per la valutazione dei meccanismi di degenerazione e di recupero della retina.
La retina è composta da cellule multiformi e dei processi di segnalazione, e una storia completa di disregolazione della retina rimane da chiarire. La letteratura dimostra l'utilità della retina lesioni I / R da elevata IOP non solo in sede di esame dei processi degenerativi della retina 6-8,10,12,ma anche a individuare gli obiettivi di prevenzione e di intervento terapeutico 7,9,11,12,14. Inoltre, vi è una crescente evidenza per sostenere l'utilità di lesioni della retina I / R da elevata IOP in endpoint non neuronali come l'infiammazione della retina, la degenerazione vascolare, e perdite 14,15,17. Data la sua specificità anatomica, trattabilità sperimentale, e l'accessibilità tecnica, ho retina / infortunio R da elevata IOP promette di mantenere un ruolo di primo piano nel perseguire queste indagini.
The authors have no disclosures.
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca dal National Institutes of Health (EY022383 e EY022683; EJD) e Core concessione (P30EY001765), imaging e Microscopia Core Module.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Heparin Sodium Injection, USP | Abraxis Pharmaceutical Products | 1,000 USP/ml | |
BSS Sterile Irrigating Solution | Alcon Laboratories, Inc. | 9007754-0212 | 500 ml |
SC-2 kg Digital Pocket Scale | American Weigh Scales, Inc. | SC-2 kg | |
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1% | Bausch + Lomb | 1% (10 mg/ml) | |
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% | Bausch + Lomb | 0.5% (5 mg/ml) | |
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing | Becton Dickinson and Company | 427400 | Inner diameter: 427400 |
30 G 1/2 PrecisionGlide Needles | Benton Dickinson and Company | 305106 | |
BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8 | Benton Dickinson and Company | 309625 | |
BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip | Benton Dickinson and Company | 309653 | |
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope | Carl Zeiss AG | 000000-1179-101 | |
Sterile Syringe Filter | Corning Inc. | CLS431224 | 0.20 µm |
Durasorb Underpads | Covidien | 1038 | 23 x 24 inches |
Alcohol Prep | Covidien | 6818 | 2 Ply, Medium |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13002-10 | |
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch | Hospira | 12672-28 | |
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x) | Invitrogen | 10010-049 | 500 ml |
Distilled water | Invitrogen | 15230-204 | 500 ml |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | |
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution | LLOYD, Inc. | 20 mg/ml | |
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic | MediChoice | 3-Gram Packet | |
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold | Navilyst Medical, Inc. | 70039355 | 5-Valve Manifold with Seven Female Ports |
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose | OCuSOFT, Inc. | 2.5% (25 mg/ml) | |
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride | Pfizer, Inc. | 100 mg/ml | |
Trans-Pal I.V. Stand | Pryor Products | 372 | Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension |
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP | Vet One | 10 mg/ml | |
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic | VSSI | 100-4041-21 | |
Tube Fitting Luer Male to Luer Male | Warner Instruments | 64-1579 |
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