Un modello murino di retina ischemia-riperfusione lesioni a causa di aumento della pressione intraoculare

Questo articolo descrive una procedura per l'induzione della retina danno da ischemia-riperfusione da elevata pressione intraoculare nei topi. Retina danno da ischemia-riperfusione da elevata pressione intraoculare serve per modellare patologie umane caratterizzate da ossigeno compromessa e consegna dei nutrienti nella retina, consentendo ai ricercatori di esaminare i potenziali meccanismi cellulari e trattamenti per le malattie umane dell'unità neurovascolare della retina.

Retina ischemia-riperfusione (I / R) è un processo fisiopatologico contribuire al danno cellulare in più condizioni oculari, inclusi il glaucoma, retinopatia diabetica, e occlusioni vascolari retiniche. modelli di roditori di danno I / R stanno fornendo spunti significativi in ​​meccanismi e strategie di trattamento per I / R ferita umana, soprattutto per quanto riguarda i danni neurodegenerativo nell'unità neurovascolare della retina. Presentato qui è un protocollo per indurre retina lesioni I / R nei topi attraverso l'elevazione della pressione intraoculare (IOP). In questo protocollo, la camera anteriore oculare è cannulata con un ago, attraverso il quale scorre la goccia di un serbatoio salina elevata. Utilizzando questa goccia per aumentare IOP sopra sistolica pressione arteriosa, un professionista interrompe temporaneamente il flusso di sangue interno della retina (ischemia). Quando la circolazione viene ripristinato (riperfusione) per la rimozione della cannula, gravi danni cellulari ne deriva, in ultima analisi, con conseguente nella neurodegenerazione della retina. Stud recentii dimostrano l'infiammazione, la permeabilità vascolare, e capillare la degenerazione come ulteriori elementi di questo modello. Rispetto alle metodologie di I / R retina alternativi, come la legatura delle arterie della retina, ho retinica / infortunio R da elevata IOP offre vantaggi nella sua specificità anatomica, trattabilità sperimentale, e l'accessibilità tecnica, proponendosi come uno strumento prezioso per l'esame patogenesi neuronale e terapia in l'unità neurovascolare della retina.

Retina ischemia-riperfusione (I / R) caratterizza molte patologie retiniche umane, compreso il glaucoma, retinopatia diabetica, e occlusioni vascolari retiniche ^1. In retina I / R, riduzione del flusso sanguigno (ischemia) nei vasi della retina crea uno stato di ipersensibilità della retina di ossigeno e altre sostanze nutritive, precipitando gravi ossidativo e danno infiammatorio quando la circolazione viene successivamente ripristinato (riperfusione) ^2. La retina neurale appare particolarmente vulnerabili a questi cambiamenti, con neurodegenerazione retinica è forse la caratteristica più saliente del danno I / R-indotta. Qui presentata è un protocollo per modellare retinica lesioni I / R nel topo. Questa tecnica consente ai ricercatori di esaminare i potenziali meccanismi e strategie di trattamento per le malattie umane dell'unità neurovascolare della retina.

Lanciato nel 1952 da chirurghi cercano di capire le conseguenze neurodegenerative di anemia chirurgica ^3, rodent della retina I / R da elevata pressione intraoculare (IOP) è stata ristabilita nel 1991 con lo scopo di uniformare gli endpoint neurodegenerative dopo insulto ischemico ^4. Utilizzando la goccia di un serbatoio di soluzione salina per aumentare IOP sopra la pressione sanguigna sistolica, questi studi hanno dimostrato che sotto pressione incannulamento oculare è stato sufficiente a sospendere la circolazione retinica e quindi avviare la degenerazione neuronale. Più recenti sforzi utilizzando retina I / R da elevata IOP hanno iniziato ad elaborare i meccanismi alla base di I / R-indotta neurodegenerazione retinica ^5-12. Diversi gruppi hanno riportato alterazioni patologiche aggiuntive, tra cui l'infiammazione ^13,14, la permeabilità vascolare ^15,16, e capillare degenerazione ^14,17. Presi insieme, questi studi hanno stabilito retina lesione di I / R da elevata IOP come modello di malattia neurovascolare della retina, più in generale.

Caratterizzazione dei meccanismi di danno I / R è essenziale per lo studio di vamalattia scular. Retinica lesioni I / R da elevata IOP è uno dei tanti modelli di lesioni indotta da ipossia, tra cui le lesioni di I / R in polmone ^18, il cuore, il cervello ^{19 20,} fegato, reni ^{21 22,} e intestino ^23. Questi modelli sono stati di primaria importanza nel promuovere la nostra comprensione della malattia vascolare e dei suoi rimedi clinici. Estendendo lo studio dei processi di I / R per tessuti oculari, ho retina / lesioni R da elevata IOP aiuta a dipingere un quadro più completo di queste condizioni correlate.

Corrispondente a stretto contatto con le condizioni cliniche neurodegenerative in retina, ho retina / lesioni R da elevata IOP presenta uno strumento prezioso per i ricercatori interessati ad esplorare patogenesi ischemica. Il protocollo qui descritto è mirato, trattabili, e accessibile. Si è completato bene da endpoint in degenerazione neuronale, come la quantificazione dei neuroni della retina, la misurazione dello spessore della retina, e R elettrofisiologicoecording della funzione dei neuroni della retina. Questo modello ha dimostrato la sua utilità nel portare avanti un'indagine neurovascolare, e si vede promessa a guadagnare status di un protocollo fondamentale nella ricerca della medicina visiva.

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Johns Hopkins University.

Nota: I topi utilizzati durante le riprese sono C57BL / 6 topi da Jackson, anche se altri ceppi di roditori o specie possono anche essere usati. Quando si utilizzano altri ceppi o specie, essere consapevoli del fatto che i dosaggi di anestesia e sequenza temporale lesioni possono variare. È importante adattare condizioni I / R per ospitare ceppo, specie e variazioni sperimentali.

1. Preparare il cocktail di anestesia

1. Combinare 1,25 ml ketamina, 0,625 ml Xilazina, 0.375 ml Acepromazine, e 22,75 ml di tampone fosfato salino in una provetta da centrifuga da 50 ml.
   NOTA: Per il resto del manoscritto, questa soluzione sarà indicato come il cocktail.
2. Filtrare il cocktail in una nuova sterili 50 ml provetta utilizzando una siringa da 60 ml ed un filtro 0.20 micron. Etichetta e data di questo nuovo tuessere.
3. Completamente avvolgere il tubo di cocktail in un foglio di alluminio per evitare la degradazione indotta dalla luce dell'anestetico.
   NOTA: Il cocktail può essere conservato a temperatura ambiente e riutilizzato fino alla data di scadenza del suo ingrediente primo-in scadenza.

2. Preparare l'anestesia Booster

1. In una provetta da centrifuga da 50 ml, 4 ml combinare ketamina e 16 ml tampone fosfato salino.
   NOTA: Questa soluzione sarà d'ora in poi indicato come ripetitore.
2. Filtrare il ripetitore in una nuova sterili 50 ml provetta utilizzando una siringa da 60 ml ed un filtro 0.20 micron. Etichetta e data di questo nuovo tubo.
   NOTA: Il booster può essere conservato a temperatura ambiente e riutilizzato fino alla data di scadenza del suo ingrediente primo-in scadenza.

3. Preparare la sala operatoria

1. Impostare la temperatura ambiente tra 18 ° C e 21 ° C.
2. Accendere il tavolo operatorio, e regolare il suo calore superficie al highetemperatura st.
3. Coprire tutte le superfici di lavoro con traverse chirurgiche.
4. Disporre una gabbia vuota o un altro contenitore sul tavolo operatorio per riscaldarsi.
5. Disporre una scala e un tagger orecchio sul piano di lavoro.

4. Preparare la soluzione salina bilanciata con eparina di sodio

1. Aggiungere 0,5 ml di eparina sodica per un IV bottiglia da 500 ml di soluzione salina bilanciata (HBSS).
2. Inserire la punta del set primario prepierced tubi Y-site nella bottiglia dello 0,1% eparina sodica.

5. Impostare la IV Polo

1. Appendere la bottiglia dello 0,1% eparina sodica dall'estensione pole IV, e far scattare aprire il tappo del filtro dell'aria sul set primario prepierced tubi Y-site.
2. Elevate bottiglia eparina sodica 0,1% a 163 cm (120 mmHg). Misurare l'altezza dal piano del tavolo al picco del gocciolatoio eparina sodica.
3. Rimuovere eventuali bolle d'aria nel tubo IV muovendo manualmente il set di primaria prepierced tubi Y-site.

6. Impostare l'eparina sodica Drip

1. Collegare il set di primaria prepierced tubi Y-site al collettore cinque valvole.
2. Collegare 30-gauge ½ aghi pollici per il collettore di cinque-porta con Luer maschio Luer raccordi per tubi di sesso maschile.
3. Inserire ciascuno dei aghi da 30 gauge ½ pollice nel proprio segmento 10 pollici di tubo da 30 gauge.
4. Utilizzando hemostats, rompere le punte degli aghi dei nuovi 30 gauge ½ pollici aghi e inserire le loro estremità smussata nel tubo da 30 gauge. Sterilità o la disinfezione delle punte degli aghi saranno necessari per Step 8.3.
5. Con del nastro, disporre i tubi 30-gauge con aghi tale che i tubi collegati alle porte interne sono posizionati sulla parte superiore dei tubi collegati alle porte esterne. Questo accordo consentirà di evitare grovigli di tubi durante l'incannulamento della camera anteriore.
6. Accendere il flusso eparina 0,1% di sodio al collettore cinque valvole e per ogni singolo porto.
   1. Assicurarsi che il 0,1%eparina sodica scorre fortemente per ciascuna porta. Se una porta scorre debolmente, sostituire il porto o cancellarlo con aria da una siringa sterile.
   2. Lasciare che il eparina 0,1% di sodio di fluire per 2 - 3 minuti per eliminare le bolle d'aria dai tubi da 30 gauge e collettore a 5 valvole.
7. Spegnere tutte le porte sul collettore a 5 valvole.

7. Preparare i topi per Chirurgia

1. Portare i topi per la sala operatoria. Fornire bottiglie di acqua per ogni gabbia al fine di prevenire la disidratazione animale durante l'intervento chirurgico.
2. Registrare il peso di ciascun topo.
3. Iniettare ogni mouse per via intraperitoneale con 0,02 ml di cocktail per grammo di peso corporeo.
4. TAG e registrare il numero di ogni mouse.
5. Posizionare tutti i topi nel contenitore vuoto sul tavolo operatorio. Consentire 5-10 min per tutti i topi per ottenere profondità anesthetization come confermato dall'assenza di risposta del pedale recesso a pinch punta.
6. Per ogni mouse, somministrare una goccia diTropicamide in ciascun occhio per la dilatazione della pupilla e la lubrificazione a breve termine.
7. Per ogni mouse, somministrare una goccia di proparacaina in ciascun occhio per anestesia locale e la lubrificazione a breve termine.
8. Disporre i topi nell'ordine di anestesia in modo che il primo mouse da anestetizzato sarà il primo mouse da incannulato.
9. Lasciare circa 2 min per il collirio per avere effetto.
10. Preparare diritte pezzi 4 pollici di nastro tirando saldamente sul nastro. Mettere da parte un pezzo di nastro per ogni mouse.
    NOTA: Non riuscendo a tirare saldamente sul nastro comporterà arricciatura del nastro.

8. cannulate camera anteriore

1. Disporre il primo mouse sotto il microscopio operatorio, e mettere a fuoco il microscopio sulla cornea preferito.
   NOTA: Cannulazione può essere eseguita su entrambi gli occhi. A destra chirurghi dominanti possono trovare it più semplice per cannulare l'occhio sinistro, mentre a sinistra chirurghi dominanti possono preferire il diritto.
2. Accendere prima porta eparina sodica 0,1% sul collettore cinque valvole.
3. Sotto il microscopio operatorio, utilizzare un paio di pinze per proptose delicatamente l'occhio. Inserire il 30-gauge cannula nella camera anteriore approssimativamente a metà strada tra le fibre zonule e l'apice della cornea.
   1. Fare attenzione a non graffiare o pungere l'iride, lente, o superficie corneale interna.
   2. Evitare di penetrare la cornea una seconda volta.
   3. Utilizzando un movimento rotatorio delicato per superare l'attrito tra la cannula e la cornea, inserire la cannula profondamente nella camera anteriore.
4. Utilizzare una striscia di nastro adesivo per fissare il tubo 30-gauge al tavolo. Per ridurre al minimo il movimento della cannula inserita, premere il tubo da 30 gauge contro il piano del tavolo, mentre per raggiungere il nastro.
5. Registrare l'ora di inizio della chirurgia.
6. Utilizzando il microscopio, verify che nessuna perdita è evidente. Se la perdita è presente, il movimento di fluido sarà visibile vicino all'occhio.
7. Visivamente confermare distensione oculare osservando che l'occhio I / R è maggiore l'occhio controlaterale. Insieme, l'assenza di perdite e la presenza di distensione oculare dimostrano una elevazione successo della pressione intraoculare.
8. Applicare ipromellosa in entrambi gli occhi. Ipromellosa serve a lubrificare le microperdite cornea e di tenuta. Riapplicare ipromellosa, se necessario (circa ogni 30 minuti) per la lubrificazione sostenuta.
9. Ripetere il punto 8 fino a quando tutti gli animali sono stati cannulata.

9. Monitor anestesia

1. Utilizzare il pizzico punta, l'osservazione visiva dei baffi, o l'osservazione visiva della coda per verificare che ogni mouse rimane anestetizzato. Nel caso di un mouse dare prova di una risposta del pedale di ritiro, spasmi baffo, o il movimento della coda, procedere immediatamente al punto 9.2.
2. Se un mouse comincia a risvegliare durante l'intervento chirurgico, ascensorela coda di iniettare 0,05 ml di richiamo per via intraperitoneale nel basso addome da dietro il mouse. Lasciare 1 - 2 min per il richiamo abbia effetto.
3. Nel caso di un mouse richiede sedazione supplementari, ripetere il passo 9, se necessario.

10. Rimuovere la cannula dalla camera anteriore

1. Per ciascun animale, dopo 90 minuti sono trascorsi, tirare delicatamente la cannula dalla camera anteriore.
2. Untape il mouse dal tavolo operatorio, facendo attenzione a non disturbare il tubo della cannula di animali adiacenti.
3. Lubrificare entrambi gli occhi con gel lubrificante.
4. Come cannule successive vengono rimossi, organizzare i topi nel contenitore vuoto sul tavolo operatorio per recuperare da un intervento chirurgico. Non spegnere il calore del tavolo operatorio.
5. Consentire, come minimo, 2 - 3 ore per il recupero sul tavolo operatorio riscaldato. Osservare i topi spesso fino a quando non hanno pienamente recuperato dal anestesia.

11. Pulire l'EqAZIONE DEI DISPOSITIVI

1. Disinfettare le cannule utilizzando cotone imbevuto di alcol.
   NOTA: Altri metodi per la disinfezione o sterilizzazione, come autoclave, può essere sostituito.
2. Espellere 0,1% di sodio eparina dal collettore 5 valvole, aghi 30 gauge, tubazione 30 gauge e cannule utilizzando una siringa da 60 ml riempita con aria.
3. Lavare il collettore a 5 valvole, aghi da 30 gauge, tubi 30-gauge, e cannule utilizzando una siringa da 60 ml riempita con acqua distillata.
4. Espellere l'acqua distillata dal collettore a 5 porte, aghi da 30 gauge, tubi 30-gauge, e cannule utilizzando una siringa da 60 ml riempito di aria.
5. Dopo la disinfezione cannule e il risciacquo l'apparato tubi, conservare questa apparecchiatura per il riutilizzo.
6. Negozio, scartare, o spegnere tutte le altre apparecchiature. Lasciare il calore del tavolo chirurgico su.

12. Ritorno Tutti i topi nelle loro gabbie per la casa

1. Dopo che i topi si svegliano da un intervento chirurgico (dopo 2 - 3 ore), tornare ogni animale alla sua gabbia casa. Fornire cibo gel per ogni gabbia. Rientro tutte le gabbie nelle loro stanze designate.
2. Spegnere il fuoco del tavolo operatorio. Eliminare tutti i rifiuti, e pulire la suite chirurgica.

13. Effettuare la valutazione della retina

1. Se del caso, raccogliere retine per l'analisi istologica o scuro adattarsi topi per la registrazione elettroretinogramma.

Gli effetti neurodegenerativi di I / R retina di elevata pressione intraoculare sono comunemente valutata utilizzando due approcci standard. NeuN immunomarcatura dei nuclei neuronali ha rivelato una significativa perdita di cellule neuronali seguenti I / R insulto (Figura 1). In breve, gli occhi enucleati 7 giorni dopo I / R sono state fissate in paraformaldeide, etichettato con il marcatore delle cellule neuronali NeuN, e tutto montato. Le immagini sono state catturate utilizzando la microscopia confocale, e cellule marcate con NeuN sono stati quantificati contando ^11. Le diminuzioni della gangliari conta strato di cellule neuronali indicano che la morte delle cellule / R-indotta.

Le svalutazioni in funzione dei neuroni della retina sono stati documentati con elettroretinografia (Figura 2). In breve, sette giorni dopo I / R, electroretinograms scotopica sono stati registrati in più intensità flash. Ampiezze delle A e B le onde sono stati quantificati utilizzando il software di analisi delle immagini ^{12. Qui, inferiori A e B onda ampiezze significano I / R menomazioni indotte in funzione neuronale della retina. In questi ed altri parametri I / R, l'/ R occhio non mi serve come un robusto controllo negativo per I / danni R-indotta.}

Figura 1. retina I / R Induce neuronale morte cellulare nel livello Ganglion cellulare (GCL). Immagini retiniche rappresentativi di controllo e di I / R occhi sono mostrati con barre di scala che denota 100 micron. (A) Il numero di cellule NeuN-positive nel GCL è significativamente ridotta in I / R occhi rispetto ai controlli (B). n = 9, barra di errore: errore standard, *** p <0.0001 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. retina I / R Compromissione della retina Neuron funzione. Diminuzione a- e ampiezze b-onda indicano compromessa la fisiologia della membrana delle cellule neuronali seguenti I / R. n = 6, barra di errore: errore standard, * p <0.05 Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I retina / infortunio R da elevata IOP ha dimostrato la sua utilità nella modellazione danni cellulari e disfunzioni, soprattutto neurodegenerazione, nel roditore unità retina neurovascolare. Questa procedura fornisce un tessuto controllo robusto ed è facilmente raggiungibile in termini di sofisticazione tecnica. È stato notato in questo e altri modelli di pregiudizio I / R che aumentando la pressione e la durata di ischemia può aumentare la gravità delle lesioni ^24. Per questo motivo, alcuni praticanti hanno scelto di utilizzare pressioni ischemici e durate differenti da quelli presentati qui ^4,6-10,12. Pertanto retinica I / lesioni R da elevata IOP offre una vantaggio rispetto alternativi retiniche tecniche I / R in che permette di regolare i parametri chirurgici per accogliere i propri obiettivi particolari sperimentali.

Ciò nonostante, le tecniche alternative sono stati impiegati per l'induzione della retina lesioni I / R nei roditori. Legatura del fascio nervo ottico ^25,26 o l'arteria centrale retinica soli ²⁷ è stato usato per arrestare temporaneamente il flusso sanguigno retinico. Strategie simili a condizioni sistemiche hanno richiesto legatura dell'arteria cerebrale ²⁸ o l'arteria cefalica ²⁹ per ridurre il flusso sanguigno senza ostruire pienamente. Una metodologia più raro comporta circonferenziale comprimendo il mondo della retina con un filo che viene pesato su entrambe le estremità ^30. Mentre tali strategie hanno contribuito con successo alla comprensione dei cambiamenti neurovascolari ipossia indotta nella retina, la tecnica qui descritta offre diversi vantaggi rispetto queste alternative. Che richiede il minimo danno non solo della retina alla cornea, I / R da elevata IOP riporta un infortunio retina più specificamente mirati che viene offerta con tecniche di legatura e così può essere più utile per i ricercatori interessati a malattie specifiche retina. Inoltre, metodi IOP elevata sono più trattabili rispetto ai modelli legatura o di compressione, in modo che la IMetodo OP consente un rapido raggiungimento di ischemia retinica, così come la successiva riperfusione. Infine, i protocolli IOP elevati richiedono minima sofisticazione chirurgica e tecnologico, e così possono essere più ampiamente accessibile rispetto alle loro alternative.

Retinica lesioni I / R da elevata IOP non è privo di sfide. Incannulazione della camera anteriore richiede manualità e cura deve essere presa per preservare l'integrità del diaframma, lente, e della cornea. Cautela anche consigliato dopo l'inserimento della cannula, come la cannula può essere rimossa dalla camera anteriore, mentre il tubo 30 gauge è fissato con nastro adesivo.

Altri processi critici in questo protocollo sono il mantenimento di una temperatura corpo caldo per gli animali anestetizzati, la somministrazione di richiamo di anestesia in modo tempestivo, e sostenere la lubrificazione della cornea utilizzando ipromellosa. E 'anche importante notare comportamenti di stress mouse o malattia (per esempio, la mancanza di governare, incurvando, Ecc) prima dell'intervento, poiché queste variabili extra-chirurgiche possono influenzare la potenza e la mortalità droga. Frequentando a questi problemi, si può ottenere un modello altamente regolamentato e riproducibile per retina lesioni I / R.

Va inoltre riconosciuto che il pregiudizio della retina I / R da elevata IOP è solo un modello, e si consiglia cautela quando estrapolando i risultati a malattie specifiche, in particolare le condizioni croniche. Mentre diverse da queste malattie nel periodo di tempo e l'origine eziologica, però, ho retina / R lesioni da elevata pressione intraoculare possono comunque fornire una solida piattaforma per la valutazione dei meccanismi di degenerazione e di recupero della retina.

La retina è composta da cellule multiformi e dei processi di segnalazione, e una storia completa di disregolazione della retina rimane da chiarire. La letteratura dimostra l'utilità della retina lesioni I / R da elevata IOP non solo in sede di esame dei processi degenerativi della retina ^6-8,10,12,ma anche a individuare gli obiettivi di prevenzione e di intervento terapeutico ^{7,9,11,12,14.} Inoltre, vi è una crescente evidenza per sostenere l'utilità di lesioni della retina I / R da elevata IOP in endpoint non neuronali come l'infiammazione della retina, la degenerazione vascolare, e perdite ^14,15,17. Data la sua specificità anatomica, trattabilità sperimentale, e l'accessibilità tecnica, ho retina / infortunio R da elevata IOP promette di mantenere un ruolo di primo piano nel perseguire queste indagini.

The authors have no disclosures.

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca dal National Institutes of Health (EY022383 e EY022683; EJD) e Core concessione (P30EY001765), imaging e Microscopia Core Module.