Method Article
מאמר זה מתאר הליך גרימת פציעה איסכמיה-רה-פרפוזיה הרשתית על ידי לחץ תוך עיני מוגבר בעכברים. פציעת איסכמיה-רה-פרפוזיה רשתית על ידי לחץ תוך עיני מוגבר משמשת מודל פתולוגיות אנושי מתאפיין חמצן שנפרץ משלוח מזין ברשתית, המאפשר לחוקרים לבחון מנגנונים הסלולר פוטנציאל וטיפולים למחל אדם של היחידה העצבה וכלי דם ברשתית.
איסכמיה-רה-פרפוזיה רשתית (I / R) הוא תהליך pathophysiological תורם ניזק לתאים בתנאים עיניים מרובים, כוללים גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, ו חסימות כלי דם ברשתית. במודלים של מכרסמים של פציעה I / R מספקים תובנות משמעותיות לתוך מנגנוני ואסטרטגיות טיפול אנושי I / פציעה R, במיוחד בכל הנוגע לנזק ניווניות ביחידה העצבים וכלי הדם של הרשתית. אנו מציגים כאן פרוטוקול גרימת פציעה I / R רשתית בעכברים באמצעות העלאת רמת הלחץ התוך עיני (IOP). בפרוטוקול זה, החדר הקדמי של העין הוא cannulated עם מחט, שדרכו זורם הטפטוף של מאגר מלוח גבוה. באמצעות טפטוף זה להעלות IOP מעל לחץ דם סיסטולי עורק, מתרגל זמני עוצר את זרימת דם ברשתית פנימית (איסכמיה). כאשר זרימת ימשיך כרגיל (רה-פרפוזיה) על ידי הסרה של צינורית, נזק לתאים חמור מתפתח, וכתוצאה מכך בסופו של דבר בתהליכי ניוון מוחיים רשתית. ההרבעה אחרונהies להדגים דלקת, חדירות כלי דם, וניוון נימים כמו אלמנטים נוספים של דגם זה. לעומת מתודולוגיות I / R רשתית חלופיות, כגון קשירת עורקי רשתית, אני רשתית / פציעת R ידי גבוה IOP מציע יתרונות במוגדרותו אנטומיים, עקיבות ניסיון, ונגישות טכנית, להציג את עצמו ככלי בעל ערך לבחינת בפתוגנזה וטיפול עצביים יחידת העצבים וכלי הדם של הרשתית.
איסכמיה-רה-פרפוזיה רשתית (I / R) מאפיינת פתולוגיות רשתית אדם רבים, כולל גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, ו חסימות כלי דם ברשתית 1. ב- I / R רשתית, זרימת דם מופחתת (איסכמיה) בכלי הדם ברשתית יוצרת מצב של רגישות יתר רשתית חמצן וחומרים מזינים אחרים, מזרז חמצונים חמורים וניזק דלקתי כאשר הזרימה תמשיך כרגיל לאחר מכן (רה-פרפוזיה) 2. הרשתית העצבית מופיע פגיעים במיוחד לשינויים אלה, עם ניוון מוחיים רשתית להיות אולי התכונה הבולטת ביותר של I / R-induced נזק. אנו מציגים כאן פרוטוקול למידול פציעת I / R רשתית בתוך העכבר. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון מנגנונים פוטנציאל ואסטרטגיות טיפול למחלות בבני אדם של היחידה העצבה וכלי דם של הרשתית.
חלוץ ב -1952 על ידי מנתחים המבקשים להבין את ההשלכות ניווניות של אנמיה כירורגית 3, רודןt רשתית I / R על ידי לחץ תוך עיני מוגבר (IOP) הוקמה מחדש בשנת 1991 לצורך סטנדרטיזציה נקודות קצה ניווניות אחרי העלבון איסכמי 4. באמצעות הטפטוף של מאגר מלוח להעלות IOP מעל לחץ דם סיסטולי, מחקרים אלה הראו כי cannulation עיני בלחץ הייתה מספיק כדי להשעות את זרימת רשתית ובכך ליזום ניוון עצבי. מאמצים נוספים האחרונים באמצעות רשתית I / R ידי גבוהה IOP החלו לפרט את מנגנוני I / R-induced ניוון מוחיי רשתית 5-12. קבוצות מרובות דיווחו שינויים פתולוגיים נוספים, כולל דלקת 13,14, חדירות כלי הדם 15,16, ו נימי ניוון 14,17. יחדיו, מחקרים אלה הקימו פציעת I / R ברשתית ידי IOP הגבוהה כמודל למחלת עצבים וכלי דם של רשתית באופן כללי יותר.
אפיון מנגנוני פציעה I / R הוא חיוני לחקר vaהמחלה scular. פציעת I / R רשתית ידי IOP הגבוהה היא אחד דגמי פציעה רבים הנגרמת היפוקסיה, כוללים פציעות I / R ב ריאות 18, לב 19, מוח 20, כבד 21, כליות 22 ומעי 23. מודלים אלה היו עליונים בקידום הבנתנו של מחל וסקולרית והסעדים הקליניים שלה. על ידי הרחבת החקירה של תהליכים I / R לרקמות העין, אני רשתית / פציעה R לפי גבוהות IOP עוזר לצייר תמונה מקיפה יותר של תנאים אלה קשורים.
מקביל בשיתוף פעולה הדוק עם תנאים ניווניות קליניים רשתית, אני רשתית / R פציעה ידי IOP הגבוהה מציג כלי רב ערך עבור חוקרים המעוניינים לחקור בפתוגנזה איסכמי. הפרוטוקול המתואר לעיל הינו ממוקד, ממושמע, ונגיש. היא מושלמת גם על ידי נקודות קצה ב ניוון עצבי, כגון כימות של נוירונים ברשתית, מדידת עובי הרשתית, ו r אלקטרוecording של פונקצית נוירון רשתית. מודל זה הוכיח השירות שלה בקידום חקירה עצבה וכלי דם, וזה נראה מבטיח סטטוס כפרוטוקול יסוד במחקר רפואה חזותי.
משפט ואתיקה: כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס ועדת שימוש.
הערה: עכברים בשימוש בזמן צילומים הם עכברי C57BL / 6 מג'קסון, למרות זני מכרסמים אחרים או מינים עשויים לשמש גם. בעת שימוש זנים או מינים אחרים, להיות מודע לכך במינוני הרדמה וציר זמן פציעה עשויים להשתנות. חשוב להתאים תנאי I / R כדי להתאים זן, מין, וריאציות ניסיון.
1. מכינים את הקוקטייל הרדמה
2. מכינים את Booster הרדמה
3. מכינים את Suite כירורגי
4. מכינים את תמיסת מלח מאוזן עם הפרין סודיום
5. הגדרת הקוטב IV
6. מגדירים את טיפות הפרין סודיום
7. מכינים את העכברים לכירורגיה
8. cannulate לשכת Anterior
9. הרדמה צג
10. להסיר את הצינורית מן הלשכה הקדמית
11. נקה את המשוואהuipment
12. להחזיר את כל העכברים בכלובים בביתם
13. בצע הערכת רשתית
התופעות ניווניות של רשתית לי / R ידי גבוה IOP הן בדרך כלל נבחנו ע"י שתי גישות סטנדרטיות. NeuN immunolabeling של גרעינים עצביים חשף הפסד תאים עצביים משמעותי הבא I / R עלבון (איור 1). בקצרה, עיני enucleated 7 ימים לאחר I / R היה קבועים paraformaldehyde, שכותרתו עם סמן התאים העצבי NeuN, ושלמים רכובים. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ confocal, ותאי שכותרתו עם NeuN כומתו על ידי ספירת 11. מפחית בספירת נוירון שכבת תא גנגליון מצביעים I / מוות תאי המושרה R.
ליקויים בתפקוד נוירון רשתית תועדו באמצעות electroretinography (איור 2). בקצרה, שבעה ימים לאחר I / R, electroretinograms scotopic נרשמו בעוצמות פלאש מרובות. אמפליטודות של a- ו- B-הגלים היו לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 12. הנה, אמפליטודות ב-הגל a- והתחתון לסמן I / ליקויים-induced R בתפקוד עצב רשתית. בשינה האלה ונקודות קצה I / R אחר, העין הלא-I / R משמשת כביקורת שלילית חזקה I / ניזק נגרם R.
איור 1. רשתית I / R גורם למות תאים עצבי בשכבת תא גנגליון (GCL). תמונות רשתית נציגה מלאה I / עיני R מוצגות עם ברים בקנה מידה המציין 100 מיקרומטר. (א) מספר תאים NeuN-חיובי GCL מצטמצם משמעותית בעיניים I / R בהשוואה לקבוצת הביקורת (B). n = 9, בר שגיאה: שגיאת התקן, *** p <0.0001 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. רשתית I / R פוגע פונקצית Neuron הרשתית. מתחלש a- ואמפליטודות ב-הגל מצביעה פיזיולוגית קרום לקויה בתאים עצביים הבאים I / R. n = 6, בר שגיאה: שגיאת התקן, * p <0.05 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אני רשתית / R פציעה ידי גבוהות IOP הוכיחה השירות שלה בדוגמנות נזק וחוסר תפקוד הסלולר, במיוחד ניווניות של מערכת העצבים, ביחידה העצבים וכלי הדם מכרסם הרשתית. הליך זה מספק רקמות מלאות חזקות והוא נגיש בקלות במונחים של תחכום טכנולוגי. זה כבר ציין זה ומודלים פציעה I / R אחרים שהגדלת לחץ ומשך איסכמיה עלול להגביר חומרת הפציעה 24. מסיבה זו, כמה מתרגלים בחרו להשתמש לחצים איסכמית משכים שונים מאלו שהוצגו כאן 4,6-10,12. לכן רשתית I / פציעה R ידי IOP גבוהות מציעה יתרון על פני שיטות I / R רשתית אלטרנטיבה בכך שהיא מאפשרת אחד כדי להתאים את הפרמטרים כירורגית כדי להתאים מטרות הניסוי בפרט של אחד.
עם זאת, טכניקות חלופיות הועסקו גרימה לי ברשתית / פציעת R במכרסמים. קשירה של צרור עצב הראייה 25,26 או עורק הרשתית המרכזי לבדו 27 נעשה שימוש כדי לעצור את זרימת הדם ברשתית זמנית. אסטרטגיות דומות תנאים מערכתיים מחייבות קשירת עורק מוח 28 או עורק כאפאליך 29 כדי להפחית את זרימת דם ללא הפרעה אותה במלואה. המתודולוגיה נדירה אחת כרוכה circumferentially דחיסת גלובוס הרשתית באמצעות חוט כי משוקלל בשני קצות 30. בעוד אסטרטגיות כאלה תרמו בהצלחה להבנת שינויים עצבים וכלי דם נגרם היפוקסיה ברשתית, הטכניקה המתוארת במסמך זה מציעה מספר יתרונות על פני חלופות אלה. דבר המחייב הלא רשתית ניזק מינימאלי על הקרנית, I / R ידי IOP הגבוהה מספק פגיעה ברשתית ממוקדת יותר מאשר הוא שספק טכניקות קשירה ולכן עשוי להיות שימושי יותר עבור חוקרים המעוניינים במחלת רשתית ספציפית. כמו כן, שיטות IOP גבוהות יותר ממושמע מאשר דגמי קשירה או דחיסה, כך שאנישיטת OP מאפשרת השגה מהירה של איסכמיה ברשתית כמו גם רה-פרפוזיה שלאחר מכן. לבסוף, פרוטוקולי IOP גבוהים דורשים תחכום כירורגית וטכנולוגי מינימאלי ולכן עשוי להיות נרחב יותר נגיש מאשר החלופות שלהם.
פציעת I / R רשתית ידי IOP הגבוהה היא לא בלי האתגרים שלה. Cannulation של הלשכה הקדמית דורש מיומנות ידנית, וטיפול יש לנקוט כדי לשמור על שלמות הקשתית, העדשה, הקרנית. זהירות היא גם יעצה לאחר החדרת הצינורית, כמו הצינורית עשויה להיות משך מן החדר הקדמי בעוד צינורות 30-המד מאובטח באמצעות קלטת.
תהליכים קריטיים נוספים בפרוטוקול זה בין השאר, שמירה על טמפרטורת גוף חם לבעלי חיים הרדים, בהרדמה המאיץ מבעוד מועד, ולשמר שימון של הקרנית באמצעות hypromellose. כמו כן, חשוב לציין התנהגויות מתח או מחלה העכבר (למשל, חוסר הטיפוח, hunching, וכו ') לפני הניתוח, כמשתנים חוץ כירורגית אלה עלולים להשפיע עצמה ותמותת תרופה. על ידי השתתפות לנושאים אלה, ניתן להשיג מודל מוסדר מאוד לשחזור בגין נזקי I / R רשתית.
זה צריך להיות גם הודה כי רשתית I / R פציעה ידי גבוה IOP היא רק דוגמנית, מומלץ להיזהר כאשר אקסטרפולציה ממצאים למחלות ספציפיות, במיוחד מחלות כרוניות. בעוד שונה ממחלות אלה במסגרת זמן ומוצא אטיולוגי, עם זאת, אני רשתית / פציעת R ידי גבוה IOP עלולה בכל זאת לספק פלטפורמת קול להערכת מנגנוני ניוון רשתית והתאוששות.
הרשתית מורכבת תאים רבים צורות ותהליכי איתות, וסיפור מקיף של חוסר ויסות רשתית נותר הובהר. הספרות הנוכחית מדגימה את השירות של פציעת I / R ברשתית ידי IOP הגבוהה לא רק בחינת תהליכים ניווניים ברשתית 6-8,10,12,אלא גם בזיהוי מטרות למניעה טיפולית והתערבות 7,9,11,12,14. בנוסף, יש ראיות הולכות ומצטברות לתמוך השירות של פגיעה ברשתית I / R ידי IOP הגבוהה נקודות קצה שאינו עצביים כגון דלקת רשתית, ניוון כלי דם, ודליפת 14,15,17. בהתחשב ספציפי האנטומי שלו, עקיבות ניסיון, ונגישות טכנית, אני רשתית / פציעת R ידי IOP הגבוהה מבטיח לשמור על תפקיד מוביל רודף פניות אלה.
The authors have no disclosures.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מן המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (EY022383 ו EY022683; EJD) ומענק Core (P30EY001765), הדמיה מודול Core מיקרוסקופית.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Heparin Sodium Injection, USP | Abraxis Pharmaceutical Products | 1,000 USP/ml | |
BSS Sterile Irrigating Solution | Alcon Laboratories, Inc. | 9007754-0212 | 500 ml |
SC-2 kg Digital Pocket Scale | American Weigh Scales, Inc. | SC-2 kg | |
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1% | Bausch + Lomb | 1% (10 mg/ml) | |
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% | Bausch + Lomb | 0.5% (5 mg/ml) | |
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing | Becton Dickinson and Company | 427400 | Inner diameter: 427400 |
30 G 1/2 PrecisionGlide Needles | Benton Dickinson and Company | 305106 | |
BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8 | Benton Dickinson and Company | 309625 | |
BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip | Benton Dickinson and Company | 309653 | |
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope | Carl Zeiss AG | 000000-1179-101 | |
Sterile Syringe Filter | Corning Inc. | CLS431224 | 0.20 µm |
Durasorb Underpads | Covidien | 1038 | 23 x 24 inches |
Alcohol Prep | Covidien | 6818 | 2 Ply, Medium |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13002-10 | |
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch | Hospira | 12672-28 | |
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x) | Invitrogen | 10010-049 | 500 ml |
Distilled water | Invitrogen | 15230-204 | 500 ml |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | |
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution | LLOYD, Inc. | 20 mg/ml | |
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic | MediChoice | 3-Gram Packet | |
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold | Navilyst Medical, Inc. | 70039355 | 5-Valve Manifold with Seven Female Ports |
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose | OCuSOFT, Inc. | 2.5% (25 mg/ml) | |
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride | Pfizer, Inc. | 100 mg/ml | |
Trans-Pal I.V. Stand | Pryor Products | 372 | Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension |
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP | Vet One | 10 mg/ml | |
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic | VSSI | 100-4041-21 | |
Tube Fitting Luer Male to Luer Male | Warner Instruments | 64-1579 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved