Isolamento e Asportazione di Murine Aorta; Una tecnica versatile nello studio delle malattie cardiovascolari

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

L'aorta gioca un ruolo centrale in funzione cardiovascolare fornendo il corpo con sangue ossigenato e simili ad altri parti del corpo, è suscettibile di malattia. Malattie dell'aorta comuni includono l'aterosclerosi e aneurisma, che sono il risultato di fattori genetici e ambientali, tra cui la dieta, il fumo e la sedentarietà ^1. L'aterosclerosi è la deposizione di un calcio- e la placca base lipidica alla parete aortica tipicamente riscontrati in pazienti con iperlipidemia cronica ^2. Gli aneurismi sono caratterizzati dalla degradazione dei componenti strutturali della aorta e assottigliamento della parete del vaso, seguite da un maggiore diametro che potrebbe infine portare alla rottura ^3.

Modelli animali sono strumenti importanti utilizzati per studiare il meccanismo della malattia e l'efficacia di potenziali trattamenti. Modelli animali comuni utilizzati nella ricerca cardiovascolare, in particolare di ricerca sui disturbi vascolari e metabolicheincludere i topi geneticamente modificati per alterare i livelli di lipidi, come knockout gene apolipoproteina E e lipoproteine ​​a bassa densità gene del recettore knockout mice ^4. La maggior parte dei metodi per valutare meccanismi della malattia e l'efficacia della terapia includerebbe l'isolamento e l'escissione dell'aorta.

Una volta che l'aorta è localizzata e isolata, analisi morfometrica può essere determinata, come la presenza di un aneurisma, tipicamente definita come un aumento superiore al 50% del diametro ^5. Dopo necessarie analisi in situ è completa, l'aorta può essere asportato per ulteriori analisi. Un aorta asportato può essere congelato lampeggerà condurre studi molecolari come proteine ​​e / o saggi di espressione genica o fisso utilizzando 4% paraformaldeide e successivamente incorporato, sezionati e colorati per l'analisi istologica. L'analisi istologica dell'aorta può dimostrare le caratteristiche comuni della malattia aortica come il degrado strutturale, la formazione di placca, e l'infiltrazione dei leucociti ^{6,7. Inoltre, l'aorta asportato può essere utilizzata per isolare linee cellulari primarie comprese cellule muscolari lisce endoteliali e che possono successivamente essere utilizzati per una varietà di studi in vitro 7.}

Attualmente, non ci sono altri metodi per fornire questa caratterizzazione approfondita della patologia aortica nonché fornire ricercatori con strumenti che studiare ulteriormente malattie cardiovascolari. Modalità di imaging come la risonanza magnetica, tomografia computerizzata e l'ecografia sono i metodi più vicini per valutare morfologicamente l'aorta, ma questo è difficile nei piccoli animali e ottenere un dispositivo con tecnologia adeguata è costosa ^8. Linee cellulari immortali possono essere acquistati per studiare potenziali meccanismi della malattia e dell'efficacia delle terapie, ma la natura artificiale di queste cellule limitano a studiare gli effetti sul ciclo di vita delle cellule e l'apoptosi ^9.

L'obiettivo generale diquesto manoscritto è quello di dimostrare l'isolamento sterile e escissione dell'aorta murine nella ricerca delle malattie cardiovascolari.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione della Cura e uso Comitato Animal Istituzionale dell'Università di Cincinnati e in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dal National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, Revised 1996).

1. Preparare il mouse

1. Euthanize esponendo l'animale ad una dose di anestetico sovraterapeutiche, isoflurano inalato a effetto. Verificare l'eutanasia primaria via pizzico punta come uno stimolo nocivo. Metodo secondario di eutanasia, il taglio del diaframma, si verificherà in un passaggio imminente. I metodi alternativi possono essere usati eutanasia concesso si ottiene.
2. Sanitizie la superficie esterna del mouse spruzzando il pelo lungo la regione addominale, dove verranno effettuati i tagli iniziali, con il 70% di etanolo al punto di umidità in modo che il pelo è bagnato con etanolo ed eventuali peli residui / secco non immettere la regione.
3. Disporre il mouse su una surbordo chirurgico in posizione supina, con appendici superiori e inferiori esteso verso l'esterno.
4. Appendici sicuro alla scheda con nastro chirurgico.

2. Isolamento del Cuore e Aorta

1. Dopo un adeguato posizionamento del mouse, utilizzare pinze per localizzare e isolare pelle addominale appena inferiore al processo xifoideo dello sterno.
2. Creare tensione sollevando la pelle verso l'alto e usare le forbici per rimuovere la pelle superficiale, esponendo la parte superiore del peritoneo e porzione inferiore della cavità toracica.
3. Inserire la cavità peritoneale sollevando il processo xifoideo e facendo incisioni laterali appena inferiori al processo lungo i margini sottocostali.
4. Sezionare up nella cavità toracica, passando attraverso il diaframma, assicurandosi di non lacerare il cuore o qualsiasi vasi sanguigni principali.
5. Estendere le incisioni laterali in passo 2.3 cranialmente per rimuovere la porzione anteriore della gabbia toracica. Senecessario, liberare il cuore dalla parete toracica anteriore utilizzando smussa.
6. Pulire la cavità toracica di sangue estraneo e fluido, utilizzando garza sterile per assorbire il materiale. Una volta che la zona è più visibile, rimuovere i polmoni per esporre meglio cuore e dell'aorta.

3. perfusione di Cuore e Aorta

NOTA: Per ottenere il sangue tramite puntura cardiaca, farlo appena prima di questo passaggio.

1. Riempire una siringa da 10 cc con 10 ml di ghiaccio sterile 1x freddo tampone fosfato (PBS), e inserire un ago calibro 25 alla siringa.
2. Inserire delicatamente l'ago nel ventricolo sinistro del cuore.
3. Tagliare l'atrio destro per alleviare l'accumulo di pressione da perfusione. Profumato il contenuto della siringa nel mouse sopra 2 - 3 min.
4. Utilizzare garza sterile all'apertura nell'atrio destro di assorbire liquido di perfusione.

4. L'isolamento e l'escissione del Aorta

1. Al termine del perfusion, utilizzare garza sterile per assorbire eventuali residui di liquido opacità il campo di vista nella cavità toracica.
2. Esporre contenuto gastrointestinale tagliando caudalmente attraverso la parete addominale, estendendo l'incisione alla zona sovrapubica. Estendere l'incisione più verso gli arti inferiori bilateralmente per creare lembi di pelle che possono essere risolti o escisse.
3. Rimuovere i lobi del fegato, pancreas, stomaco, milza e intestino per visualizzare meglio l'aorta. Fare attenzione quando sezionare vicino alla regione perirenale, l'aorta è superficiale ai rami delle arterie renali.
   NOTA: Eseguire questo passaggio in una precisa e immatricolarsi modo il tratto gastrointestinale è ricco di batteri che aumenta la propensione per la contaminazione.
4. Risciacquare la zona con PBS 1x e rimuovere tutto il fluido per assorbimento con una garza sterile.
5. Utilizzando microscissors sterili e microforceps, separare l'aorta dalla dorsale spina dorsale e l'esofago ventrale.E 'meglio usare scollamento e utilizzando un microscopio dissezione per questo.
   NOTA: In isolare l'aorta, avviare caudalmente alla biforcazione iliaca e spostare cranialmente pulizia e separazione l'aorta dalla superficie dorsale della cavità o iniziare craniale le carotidi e le arterie brachiocefalici dissezione caudale. Entrambi i metodi è appropriato ed è fino al comfort ricercatori.
6. Rimuovere il tessuto adiposo perivascolare utilizzando sottili microscissors assicurandosi di non rimuovere una porzione della parete aortica. Questo è essenziale per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione dei fibroblasti quando la coltura di cellule muscolari lisce aortiche.

Al termine della procedura, ci sarà un aorta intatta proveniente dal cuore, scendendo nella cavità toracica e addominale, con le arterie renali ancora attaccate (Figura 1A). Da qui, l'aorta può essere ripreso in situ di quantificare cambiamenti morfometrici che sono diagnostica nello studio degli aneurismi dell'aorta addominale (Figura 1B e 1C). Successivamente, l'aorta può essere rimosso, fisso e tinto a guardare i cambiamenti istologici. Una macchia generale e comune dei aorta è il ematossilina ed eosina (Figura 2A e 2B). Inoltre, l'integrità strutturale della aorta può essere qualitativamente quantificabile secondo Verhoff van Geison colorazione a guardare le bande di elastina (Figura 2C e 2D). Invece di ottenere una analisi istologica, l'investigatore può lampeggiare congelare l'aorta per la successiva proteine ​​e espres acido ribonucleicofissione. L'opzione finale per il ricercatore è quello di utilizzare l'aorta per ottenere l'isolamento cellulare primaria. Queste cellule possono essere coltivate in coltura (Figura 3A) e utilizzati per una varietà di studi in vitro compresi studi di fattibilità (Figura 3B) e la localizzazione della proteina (Figura 3C).

Figura 1. In immagini rappresentative situ di aorta murino. (A) Rappresentazione della normale anatomia del mouse dopo l'isolamento dell'aorta compreso il cuore ed i reni. (B) ingrandita immagine di un normale dell'aorta addominale murino intatta. (C) immagine di un aortico addominale malata ingrandita con un aneurisma nel soprarenale regione. Clicca qui per vedere una versione più grande di thè figura.

Figura 2. L'analisi istologica dell'aorta murino. (A) immagine Rappresentante di un ematossilina eosina normale macchia di una aorta surrenale sano a 20X di ingrandimento. (B) immagine Rappresentante di una aorta surrenale aneurismatica con trombo intramurale dopo ematossilina e eosina a 20X di ingrandimento. (C) immagine Rappresentante di un macchia Verhoff van Geison, mettendo in evidenza le bande di elastina di un normale dell'aorta surrenale a 10X di ingrandimento. (D) immagine Rappresentante di una macchia Verhoff furgone Geison evidenziando le bande di elastina di una aorta sviluppare malattie surrenale rilevata dal diradamento e striare di bande di elastina e ispessimento dello strato avventiziale. Si prega di click qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. miociti aortiche primarie in coltura da aorta. (A) immagine rappresentativa dei miociti aortici primari in coltura a 20 ingrandimenti ottenuti dall'aorta addominale. (B) immagine rappresentativa di miociti primari aortica durante un Trypan blu esclusione dosaggio dopo un trattamento 500 mM di H ₂ O ₂ al 20 ingrandimenti ottenuti da l'aorta addominale. (C) immagine Rappresentante di una macchia immunoistochimica per alfa actina in cellule muscolari primarie aortica isolare liscio dalla aorta addominale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Aortic disease can lead to significant systemic pathology and possibly death in severe cases. Treatment options are currently limited therefore continued research in the field is necessary¹⁰. Murine models are ideal to further study disease progression and potentially therapeutic options⁴. Therefore, the successful completion of the method described in this manuscript will provide investigators with the tools to measure disease progression and drug efficacy.

This technique can be modified in several ways in order to optimize the results. The use of surgical loupes or a dissecting microscope can aid in the visualization of the murine anatomy and vasculature details and when removing surrounding adipose tissue from the aorta. Additionally, the use of dedicated surgical utensils for specific tasks can increase the longevity of tools; for example, the use of scissors for cutting skin and separate scissors to cut through the ribs would be ideal. The use of a small gauged needle when perfusing the heart is preferred as this will allow the tissue to close around the puncture as opposed to a larger gauge needle where a hole will remain.

After the aorta is successfully removed, it can be utilized for a variety of assays. The aorta can be used for molecular studies such as enzyme activity, protein expression and gene expression profiles. Additionally, the aorta can be fixed for histologic analysis where in situ assays can be utilized as well as characterization of the aortic morphology. Finally, one can isolate smooth muscle and/or endothelial cells from a freshly harvest aorta for in vitro studies with these primary isolated cells.

The major limitation to isolation and excision of the aorta is that the animal must be sacrificed, especially in the cases of longitudinal studies. Currently, there is no single technique comparable to isolation and excision of the murine aorta. Small animal imaging technologies is becoming more advanced and approaching characterization capabilities of direct observation however it continues to have limitations including cost⁸. Immortalized cells lines can be used for in vitro studies however immortal cells are not as useful as primary isolated cells for in vitro assays especially for viability studies⁹. Isolation and excision of the murine aorta is currently the most versatile technique that can be used in the study of aortic disease.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori non hanno riconoscimenti.