La manipolazione genetica in

Qui riportiamo un metodo per l'utilizzo di tipo I e tipo II Δku80 Ceppi di Toxoplasma gondii Per generare in modo efficiente delezioni geniche mirate e sostituzioni del gene per l'analisi genomica funzionale.

Manipolazione genetica mirata mediante ricombinazione omologa è il metodo di scelta per analisi genomica funzionale per ottenere una vista dettagliata della funzione del gene e fenotipo (s). Lo sviluppo di ceppi mutanti con delezioni, mutazioni geniche mirate mirati, funzione genica completata, e / o geni targhetta fornisce potenti strategie per colmare funzione genica, in particolare se queste manipolazioni genetiche possono essere efficacemente mirati al locus del gene di interesse utilizzando mediata dalla doppia integrazione attraversare ricombinazione omologa.

A causa di tassi molto elevati di ricombinazione non omologa, analisi genomica funzionale di Toxoplasma gondii è stata precedentemente limitata dalla mancanza di metodi efficienti per il targeting gene delezioni e sostituzioni di geni per specifici loci genetici. Recentemente, abbiamo abolito la principale via di ricombinazione non omologa nel tipo I e tipo II ceppi di T. gondii eliminando il gene encoding proteine ^​​1,2 KU80. I ceppi Δku80 comportano normalmente durante tachizoite (acuta) e bradyzoite (cronici) Ciclo in vitro e in vivo e mostrano essenzialmente una frequenza di 100% di ricombinazione omologa. Le ku80 ceppi Δ rendono studi di genomica funzionale realizzabile sul singolo gene nonché sulla scala genoma ^1-4.

Qui riportiamo i metodi per l'utilizzo di tipo I e di tipo II Δku80Δhxgprt ceppi per avanzare gene strategie selettive a T. gondii. Delineiamo metodi efficienti per la generazione di delezioni geniche, sostituzioni di geni, ei geni taggati con inserimento mirato o la cancellazione del fosforibosiltransferasi (HXGPRT) marcatore ipoxantina-xantina-guanina. Il gene descritto rivolti protocollo può essere utilizzato in una varietà di modi in Δku80 ceppi per avanzare analisi funzionale del genoma parassita e per sviluppare ceppi singoli che portanomultipla mirato manipolazioni genetiche. L'applicazione di questo metodo genetico e successivi test fenotipici rivelerà aspetti fondamentali e unici della biologia di T. gondii e relativi agenti patogeni umani significativi che provocano la malaria (Plasmodium sp.) e cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Toxoplasma gondii è un comune protozoo parassita intracellulare obbligato che spesso e cronicamente infetta una vasta gamma di animali e gli esseri umani ^5. Si stima che oltre 1 miliardo di esseri umani sono attualmente e cronicamente infettati da questo agente patogeno. Oltre all'importanza di malattia causata da T. gondii infezione, la crescente disponibilità di strumenti sperimentali, potenti risorse genomica ^6, la facilità di crescita in vitro e di eccellenti modelli murini hanno reso T. gondii un sistema modello di punta per il più ampio studio di patogeni intracellulari eucariotiche e altri parassiti Apicomplexa significative che causano malattie devastanti come la malaria (Plasmodium sp.) e Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) ^5,7. Una limitazione significativa di Toxoplasma gondii come organismo modello è stato il recupero inefficiente di progenie che trasportano mirato manipolazioni genetiche. Questo problem Il targeting gene è causa di una bassa frequenza di ricombinazione omologa rispetto alla molto alta frequenza di ricombinazione non omologa in ceppi di T. wild-type gondii anche quando ampia omologia DNA è fornita in DNA molecole bersaglio utilizzati negli studi genetici ^2.

Abbiamo recentemente geneticamente bloccato la principale via di ricombinazione non omologa nel tipo I e tipo II ceppi di Toxoplasma gondii eliminando il gene che codifica la proteina ^1,2 KU80. Il tipo risultante I e tipo II ku80 ceppi Δ tassi di sviluppo normale, dimensione e comportamenti sia in vitro che in vivo durante tachizoite e fasi bradyzoite in vitro e in vivo, tuttavia, questi ceppi presentano essenzialmente una frequenza di 100% di ricombinazione omologa e questo fenotipo aumenta la probabilità di isolare rapidamente progenie desiderato di manipolazioni genetiche mirate da alcune centinaia ad alcune thoUSand volte ^1,2,4. Recenti comunità a livello di impiego di tipo I e di tipo II Δ ku80 ceppi ha notevolmente intensificato il ritmo, la varietà, così come il tasso di successo di approcci genetici mirati a T. gondii ^1-4,8-13. Qui si descrive un protocollo completo per l'eliminazione mirata del gene, la sostituzione del gene, e tagging gene in Δ ku80 ceppi di T. gondii. Dimostriamo come progettare e affidabile indirizzare manipolazioni genetiche a specifici geni o loci genetici nel Δ ku80 ceppi di Toxoplasma gondii.

1. Gene Targeting per eliminare un gene di interesse

Questo protocollo è progettato per la generazione efficiente di un ceppo mutante che ha una delezione mirata gene ad un locus genetico definito. Il T. precedentemente descritta gondii ipoxantina-xantina-guanina fosforibosiltransferasi (HXGPRT) marcatore di selezione viene utilizzata in questo protocollo per la sicurezza e affidabilità inserimento marcatore dopo acido micofenolico e xantina (MPA + X) selezione ^14-16. Questo protocollo utilizza un metodo convalidato e conveniente per la costruzione di molecole di DNA di targeting basate su lievito clonazione recombinational ^17,18. Diversi protocolli alternativi sono disponibili in commercio per la costruzione di molecole ricombinanti di targeting utilizzando metodi di clonazione ricombinazione batterica, in vitro metodi di clonazione ricombinazione o fusione PCR. Il protocollo descritto di seguito fornisce la massima efficienza e l'affidabilità di recuperare clonato parasITES in possesso di una delezione genica mirata a Δ ku80 ceppi di T. gondii.

1.1 Preparazione di mira DNA

1. Accedere ToxoDB ⁶ ( http://www.toxodb.org ) per ottenere sequenze genomiche per il gene di interesse (GOI).

Nota: sequenze genomiche devono essere ottenuti dal tipo I, II o III del genoma sequenza del database ToxoDB che è più vicino al ceppo viene manipolato. Per esempio: GT1 per RH e ME49 per Pru.

2. Progettazione sovrapposizione primer specifici che amplificano il 5 'e 3' genomiche fianchi di targeting del gene di interesse (GOI) che incorpora un 33 bp sovrapposizione con la navetta lievito vettore pRS416 (o in alternativa pRS426) e incorporano un 33 bp sovrapposizione con il marcatore selezionabile ( HXGPRT) (Figure 1A-B). Aggiungere un sito unico di enzima di restrizione in ogni primer ad entrambe le estremità 5 'unfianchi genomiche ° 3 'di targeting, posto tra i 33 bp sovrapposizione e il T. gondii-specifica sequenza di innesco (s) (Figure 1A-B).

Nota: una è richiesto maggiore di 30 bp per sovrapposizione efficiente lievito ricombinazione clonazione. Il 5 'e 3' fianchi rivolte genomici sono progettati per amplificare frammenti di DNA specifici tra 800 e 1400 bp che definiscono una delezione mirata. Essere consapevoli del fatto che i fianchi più brevi riducono significativamente l'efficienza di mira nel Δ Δ ku80 hxgprt sfondo ^2.

3. PCR amplifica il 5 'fianco di destinazione utilizzando primer F1 e R1, e la PCR amplifica il 3' fianco di destinazione utilizzando Primer F2 e R2 (Figure 1A-C) da DNA genomico ^3. Separatamente, PCR amplificare il gene Kbp 2 ~ HXPGRT compresa associati 5 'e 3' DHFR regioni fiancheggianti della cassetta HXGPRT pminiHXGPRT ¹⁴ cDNA utilizzando primer HXF e HXR(Figure 1B-C).

Nota: Amplify fianchi di destinazione utilizzando il DNA genomico dal ceppo parentale per essere transfettate.

Nota: posizionare il marcatore HXGPRT nell'orientamento avanti rispetto al 5 'e 3' del DNA di targeting fianchi per facilitare le successive manipolazioni genetiche efficienti, come la rimozione mirata di HXGPRT dal locus perturbato.

4. Verificare corretti formati del prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e di stimare la concentrazione di frammento di DNA usando standard di gel di agarosio o un altro metodo per determinare la concentrazione di DNA.
5. Generare aliquote lievito competenti, come descritto nella Gietz e Schiestly ^17.
6. Combinare 50 ng di 5 'genomica fianco di targeting, 50 ng di 3' fianco di targeting genomico, 100 ng di HXGPRT marcatore di selezione, e 50 ng di vettore shuttle linearizzato con sterile H ₂ O per ottenere un volume finale di 10 -20 microlitri. Trasforma lievito competente con i tre prodotti di PCR e lievito-E. coli navetta vettore per il clonaggio recombinational utilizzando il protocollo descritto da Gietz e Schiestly ^17. Piastra trasformato lievito su piastre di agar minime medie uracile-minus e incubare a 30 ° C per 2-3 giorni.

Nota: Il montaggio ordinata del plasmide, il 5 'bersaglio fianco, il marcatore HXGPRT, e il 3' fianco bersaglio è facilitata dalle ingegnerizzati 33 bp sovrapposizione tra i frammenti di DNA (Figure 1A-B) ed è mediata da ricombinazione omologa in lievito.

7. Harvest lievito con l'aggiunta di 2 ml di 2x YPAD alle piastre uracile-minus e delicatamente raschiare per sloggiare colonie senza interrompere l'agar. Centrifugare la soluzione di lieviti per 5 min a 5000 xg ed eliminare il surnatante.
8. Risospendere il pellet di lievito in 250 ml di un tampone di risospensione contenente RNaseA e aggiungere 50 - 100 ml di unacid-washed perle di vetro alla soluzione. Vortex per 5 minuti alla massima velocità per distruggere le cellule di lievito.
9. Lasciare le perle di vetro di depositarsi sul fondo della provetta e trasferire il surnatante in una provetta da 2 Eppendorf.
10. Isolare DNA di lievito usando un kit di isolamento di DNA miniprep, risospensione in un volume finale di 100 microlitri ~.
11. Miscelare 2 ml di DNA di lievito (~ 50 ng) con 40 ml di DH10B elettroporazione competente E. coli tenuti in ghiaccio.
12. Trasferire la soluzione in un refrigerata 2 millimetri divario elettroporazione cuvetta ed elettroporazione di cellule batteriche di 2,4 kV e 129 Ω.
13. Cellule di soccorso con l'aggiunta di 0,8 ml di SOC brodo per ogni cuvetta e la soluzione di trasferimento di un 14 ml tappo a scatto tubo Falcon. Incubare le cellule a 37 ° C su un tamburo a rulli per 40 - 60 min.
14. Piastra E. coli su + ampicillina piastre 2xYT (AMP) e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
15. Selezionare ~ 6-8 singole colonie e crescere in 3 ml 2xYT + AMP per ~ 16 ore a 37 ° C.
16. Preparare un 30% di glicerolo congelatore magazzino di ogni E. coli clone.
17. Isolare pΔGOI plasmide di E. cloni coli utilizzando un kit miniprep, risospensione in un volume finale di 100 microlitri ~.
18. Valida il pΔGOI con enzima di restrizione digerisce per misurare le dimensioni del plasmide DNA e verificare il DNA pΔGOI atteso banding pattern.
19. Finalizzare convalida di pΔGOI dal sequenziamento del DNA del 5 'e 3' fianchi rivolte genomici per verificare 100% sequenza di DNA sulla base dei dati di sequenza del genoma in http://www.ToxoDB.org .

Nota: Vicino perfetta omologia di sequenza è essenziale per massimizzare gene targeting efficienza ³ in quanto ogni coppia base di differenza costituisce una corrispondente riduzione nella lunghezza della perfetta omologia.

Nota: La sequenza del genoma del tipo II Δku80 sforzo in base al Pru genitori stpioggia non è disponibile in questo momento. Questo lavoro utilizza il tipo II ME49 sequenza del genoma come il genoma surrogato per la II Δ ceppo ku80 tipo. Sulla base di dati di sequenza in un numero di loci genetici, si stima che il ME49 genoma e il Pru genoma esibiscono polimorfismi a una frequenza di ~ 1 per 10.000 nucleotidi, o meno.

20. Genera> 200 mcg di pΔGOI stock di inoculando un ~ 250 ml 2xYT + AMP cultura durante la notte con gli stock di glicerolo da un E. convalidato coli miniprep clone.
21. PΔGOI isolare DNA plasmidico dal grande coltura usando un kit di isolamento del DNA maxiprep, risospensione in un volume finale di ~ 1.000 microlitri.
22. Ripetere enzima di restrizione digerisce, o DNA sequenziamento del DNA maxiprep pΔGOI di verificare la corretta molecola di DNA di targeting prima della trasfezione.
23. Linearizzare ~ 15 mcg pΔGOI all'estremità 5 'estremità usando l'enzima di restrizione unico X (RE.X)sito digest incorporato nella 5 'obiettivo di fianco (Figure 1B).

Nota: gene targeting in T. gondii richiede un minimo di ~ 10 pg di DNA di targeting per ottenere un efficiente frequenza di eventi rivolti al locus del gene di interesse ^2.

24. Convalidare linearizzazione di pΔGOI e determinare la concentrazione di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio o un metodo alternativo.

Nota: Se enzimi di restrizione al 5 'fianco non cede completa linearizzazione, il progettato 3' unico sito RE.Y digest può essere usato come un sito alternativo per la linearizzazione di pΔGOI.

Nota: Una molecola di DNA di targeting completamente linearizzato è essenziale per il successo del gene targeting per ricombinazione omologa nelle ku80 ceppi Δ.

25. Neutralizzare l'enzima di restrizione da incubatzione a 68 ° C per 15 - 20 min.
26. Preparare almeno 15 microgrammi di plasmide linearizzato in 100 ml di sterile H ₂ O. Conservare linearizzato pΔGOI a -20 ° C fino al momento della transfezione.

1.2 Preparazione di T. gondii parassiti, trasfezione, selezione, subcloning, validazione, archiviazione e mantenimento di ceppi geneticamente modificati

Metodi generali per la cultura e la manipolazione di T. gondii nei fibroblasti del prepuzio (HFF), le cellule umane sono descritte ^19-21. I Δ Δ ku80 hxgprt ceppi replicano normalmente in parassita infezione medio (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) terreno di crescita integrato con 1% di siero fetale bovino (FBS) e 1% contro funghi-antibiotico diluito da uno stock 100x) ^1,2. Tutto il lavoro con Toxoplasma gondii deve essere effettuata utilizzando il livello di biosicurezza 2 procedure. Il T. gondii RHΔ ku80 ² pareceppo ntale è stata generata dal RHΔ hxgprt ceppo dal Roos Lab ^14. Il PruΔku80 ¹ ceppo parentale è stata generata da PruΔhxgprt (Pru gniaud ceppo BSG-4 ²²⁾ che contiene un marcatore selezionabile CAT integrato stabilmente e una proteina (GFP) reporter fluorescente verde sotto il controllo della fase bradyzoite LDH2 promotore specifico.

1. Seminare una ² tarato da 25 cm contenente cellule HFF confluenti con 1 x 10 ⁶ praticabile tipo I RH Δ Δ ku80 hxgprt parassiti, o inoculare due 25 centimetri ² flaconi con 2 x 10 ⁶ praticabile tipo II Prugniaud (Pru) Δ Δ ku80 hxgprt parassiti.

Nota: i parassiti vitali sono definiti come parassiti extracellulari che hanno appena lisati fuori.

Nota: Questa scala fornisce un numero sufficiente di parassiti vitali per tre esperimenti di trasfezione.

2. Ispezionare le colture infette Δ Δ ku80 hxgprt ~ 68-72 ore post-infezione. Verificare la presenza di parassiti vitali e ~ 90-95% lisi delle cellule HFF per pianificare la tempistica precisa di trasfezione.

Nota: L'isolamento di parassiti appena egressed è essenziale per il successo di questo protocollo perché bassa vitalità parassita abolirà gene-targeting efficienza.

3. Agitare parassiti vitali in soluzione chiudendo il coperchio plug-sigillo sul ² tarato da 25 cm ed agitare vigorosamente il matraccio avanti e indietro per agitare i parassiti fino alla superficie di crescita senza spruzzi liquido sul lato interno del coperchio o il collo del pallone .

Nota: Parasite raccolto non necessita di liberatoria protocollo siringa con ago per il tipo I oTIPO II Δ ku80 ceppi.

4. Trasferire la soluzione parassita ad una siringa 10 attaccato ad un supporto del filtro contenente una membrana 3 micron e posizionare l'unità filtro su di un tubo aperto 15 ml con tappo a vite. Siringa filtrare i parassiti in 15 ml di tubo con tappo a vite.

Nota: Filtro dei parassiti attraverso la membrana rimuove le cellule infette e detriti cellulari.

5. Determinare la concentrazione parassita (forma di tachizoiti per ml) con un emocitometro.

Nota: Opzionale: Utilizzando la soluzione parassita, ha istituito una unità di formazione di placca (PFU), saggio di ²¹ che verrà letto 7-8 giorni dopo per determinare un'adeguata redditività dei parassiti transfettate (PFU a tachizoite rapporto ≥ 0,2).

6. Pellet parassiti per 7 min a 1400 xg e aspirare il surnatante a ~ 0,4 ml senza disturbare il parassita pellet. Spin per 2 min a 1,400 xg ed aspirare rimanente surnatante a ~ 0,01 ml senza disturbare il parassita pellet.
7. Risospendere il pellet parassita da sfogliando il fondo della provetta e aggiungere immediatamente cytomix tampone ²³ (1,33 x concentrazione) al parassita pellet per ottenere una concentrazione parassita di 4 - 5 x 10 ⁷ parassiti / ml cytomix.

Nota: omettere l'aggiunta di ATP e glutatione per cytomix da queste aggiunte non migliorano l'efficienza del gene targeting.

8. Scongelare il 100 microlitri aliquota del linearizzato pΔGOI dal protocollo 1.1 (passo 26).
9. Trasferire 0,3 ml della soluzione cytomix parassita (~ 1,3-1,6 x 10 ⁷ parassiti) al 100 pl di linearizzata pΔGOI dal protocollo 1.1 (fase 26), e trasferire immediatamente l'intero 0,4 ml parassita + pΔGOI miscelato alla refrigerati gap di 2 mm elettroporazione cuvetta.
10. Electroporate i parassiti a 1,4 kV e 24 Ω.
11. Rest la cuvetta transfezione a temperatura ambiente per 5 min ~ quindi trasferire l'intero contenuto della cuvetta trasfezione in un pallone da 150 ² cm contenente cellule confluenti HFF con 30 ml di mezzo infezione e incubare la coltura overnight infetto.
12. Inizio selezione in acido micofenolico + xantina (MPA + X) ~ 20 ore post-trasfezione (Figura 2A) sostituendo il mezzo infezione con MPA + X mezzo di selezione (MPA (25 mcg / ml) e xantina (50 mcg / ml) in medie infezione).

Nota: Non disturbare il MPA incubazione + X pallone selezione.

13. Stimare il numero totale di PFUs nel MPA + X beuta selezione ~ 8 giorni dopo la trasfezione controllando visivamente il monostrato. Verificare la presenza di zone di sviluppo PFUs e sani di infezione al microscopio ottico.

Nota: se le placche non sono visibili di giorno 8, mantenere la selezione e il monitor per i segni di infettareione poiché ceppi mutanti possono avere una ridotta velocità di replicazione.

Nota: I Δ Δ ku80 hxgprt parassita ceppi hanno una bassissima sfondo di eventi nontargeted indesiderati, che consente l'isolamento di successo di ceppi mutanti con abbastanza grave, ma i difetti di crescita non letali. Se un gene è essenziale e non può essere eliminato, la trasfezione primaria, o successivamente passò popolazione parassita, può rivelare un fenotipo in cui i parassiti cessano di replicare durante la selezione come la popolazione decide di ko mirati.

14. Agitare il pallone come nel passaggio 3 per rimuovere i parassiti extracellulari dal monostrato [dopo placche visibili hanno sviluppato] per generare una soluzione parassita. Trasferimento ~ 0,5 ml della soluzione parassita dal MPA + X beuta selezione ad 25 cm ² MPA + X beuta selezione contenente cellule confluenti (HFF designare questa cultura passaggio 1A).
15. Sloggiare parassitas in originale 150 centimetri ² MPA + X pallone selezione ~ 3 giorni dopo e il trasferimento ~ 0,5 ml soluzione parassita ad un secondo 25 centimetri ² MPA + X pallone selezione contenente cellule HFF confluenti (designare questa cultura passaggio 1B).
16. Consentire zone di infezione da sviluppare in passaggio 1A e / o passano fiaschi 1B per ~ 5 giorni. Verificare visivamente al microscopio ottico che passa 1A e 1B flaconi contengono un minimo di 25 PFUs vitali con le zone sane di infezione.
17. Scegliere la 1A pass o pallone 1B pass per continuare il passaggio in MPA + X medie selezione in 25 centimetri ² fiaschi. Mantenere passaggio sotto MPA + selezione X.

Nota: I parassiti devono essere coltivate per un numero sufficiente di generazioni per cancellare episomi persistenti non integrati dalla popolazione prima subcloning. Non eseguire subcloning prima a 20 giorni dopo la trasfezione di tipo I RH Δ Δ ku80 hxgprt, o prima di 25 giorni dopo la trasfezione pertipo II Pru Δ Δ ku80 hxgprt parassiti per consentire un tempo sufficiente a diluire episomi non integrati ^1,2.

18. Parassiti subclone in un vassoio da 96 pozzetti contenenti cellule HFF confluenti con MPA + X medie selezione. Preparare un vassoio ad una concentrazione di 1 parassita / pozzetto ed un secondo vassoio ad una concentrazione di 2 parassiti / pozzetto.

Nota: i parassiti subclone che sono recentemente lisate (~ 90 - 95% delle cellule HFF nel pallone ² 25 cm) per assicurare che i parassiti hanno alta vitalità.

Nota: L'intervallo di tempo ottimale post-trasfezione per subclonaggio è stato istituito con la misura quanto rapidamente i parassiti mirati con successo nascono ad alta frequenza nella popolazione selezionata ^1.

19. Continuare a passare la popolazione primaria di parassiti trasfettati in MPA + medie selezione X usando un programma settimanale passaggio di infettareun matraccio HFF 25 cm ² con 10 microlitri della soluzione parassita.

Nota: se i cloni che trasportano il gene delezione mirata (ko) non sono ottenuti dalla prima subclonaggio nel passaggio 18, resubclone i parassiti da parte della popolazione in continuo mantenuto ~ 10 - 12 settimane dopo la trasfezione.

Nota: Uno dei motivi di un gene delezione non è ottenuta nasce dalla persistenza episomale di alcuni plasmidi pΔGOI. Persistenza episomiale è determinata dalle sequenze contenute nel 5 'e al 3' genomiche fianchi di targeting e non sembra derivare dall'elemento genetico HXGPRT. Circa il 5 - 10% di plasmidi di targeting presentare una significativa persistenza episomale che necessita di un tempo dopo di subcloning di permettere alla popolazione parassita un numero di volte sufficiente di generazione per diluire le episomi persistenti e risolvere la popolazione di integrants principalmente stabili.

20. Punteggio ottenuto il 96 pozzetti vassoio 6-7 giorni dopo subcloning (tipo parassiti I) o 7-8 giorni dopo subcloning (parassiti di tipo II) per i pozzi che contengono un singolo PFU, identificata come una singola zona di infezione in microscopia ottica a o 40X o 60X potere. Segnare un puntino sul coperchio del vassoio 96 pozzetti per indicare la posizione del PFU nel pozzo.
21. Mescolare il contenuto di ogni pozzetto contenenti un singolo PFU con una pipetta fissato a 50 pl (200 microlitri punta) da dirigere il flusso del fluido al di sopra del PFU per disperdere parassiti nel pozzo.

Nota: Mescolando il bene accelera lisi parassita del monostrato HFF. Tipo I ceppi RH farò lisare il bene ~ 4 giorni dopo la miscelazione, di tipo II Pru parassiti saranno lisare il bene ~ 5 giorni dopo la miscelazione.

22. Seleziona una dozzina lisati pozzi (cloni) e graffi nella parte inferiore di ciascuno di questi pozzi lisati utilizzando un 0,5-10 punta della pipetta ml e contemporaneamente di redazione 6 ml di soluzione di parassita. Transfer il 6 microlitri di soluzione parassita ad un pozzetto su una piastra a 24 pozzetti contenenti le cellule HFF confluenti in 1 ml MPA + X mezzo di selezione.

Nota: è essenziale graffiare il fondo del bene per mantenere l'apertura foro della punta della pipetta in costante contatto con parassiti che risiedono sul fondo del pozzo.

23. Monitorare il vassoio 24 pozzetti per la lisi delle cellule HFF.

Nota: Il tipo I parassiti RH in genere la lisi del bene nel formato a 24 pozzetti in ~ 4 giorni. Tipo II Pru parassiti in genere la lisi del bene in ~ 5 giorni.

24. Trasferire 2 ml di soluzione praticabile parassita graffiato dal fondo di ciascun pozzetto nel formato 24 pozzetti alla corrispondente pozzo di un nuovo vassoio 24 pozzetti contenenti cellule HFF confluenti e 1 ml MPA + X mezzo di selezione per pozzetto.

Nota: Tutti i parassiti cloni e le linee possono essere continuamente principalecontenute passando 2 microlitri di soluzione praticabile parassita ogni 7 giorni in questo formato vassoio 24 pozzetti.

25. Verificare che i parassiti sono stati trasferiti con successo in un nuovo vassoio 24 pozzetti di ispezione visiva con microscopio ottico ~ 18 ore dopo il passaggio.
26. Parassiti raccolto dai pozzi lisati del vassoio 24 e dal punto 23-24 utilizzando sia un 1 ml o 10 ml pipetta e trasferire la soluzione parassita di una provetta Eppendorf.
27. Pellet i parassiti a 1.400 x g per 7 minuti, lavare una volta in 1 ml di tampone fosfato (PBS), e pellet di nuovo a 1.400 x g per 3 min.
28. Aspirare il PBS dal pellet, quindi aggiungere 200 microlitri di PBS al pellet per risospendere le parassiti. Congelare la soluzione parassita a -80 ° C fino isolamento del DNA.
29. Isolare DNA parassita da ogni clone utilizzando un tessuto DNA isolamento minikit.
30. Convalidare la delezione del gene targeting (knockout) mediante PCR utilizzando primer di validazione (figure 2A-C). Test per laassenza del funzionale regione codificante del gene di interesse e usando l'upstream e downstream CxF cxr primer di DNA genomico (figure 2A-B) Test per la presenza di prodotti di PCR che abbracciano i fianchi di targeting genomiche e HXGPRT dimostrare esatta 5 'e 3 'integrazione mirata del gene HXGPRT nel locus genico eliminato.

Nota: Primer per la validazione deve essere unico per il gene di interesse o di un risultato falso positivo può essere ottenuto. Progettazione Primer può essere convalidato in http://www.toxodb.org facendo saltare sequenze primer per il genoma (s) per verificare primer sono unici.

31. Passage cloni parassita su una pianificazione settimanale, come descritto al punto 24. Una volta che la delezione mirata è stato convalidato, continuando selezione nel MPA + X è facoltativo.
32. Archivio parassita cloni preparando scorte congelatore. Pellet parassiti extracellularidalle cellule HFF lisate in un pallone di coltura 25 centimetri ^2, rimuovere i supporti e delicatamente risospendere parassita pellet in coltura cellulare congelamento medio ad una concentrazione parassita> 4 x 10 ⁷ parassiti per ml. Trasferire aliquote di cryovials e parassiti negozio indefinitamente in azoto liquido, oppure a -80 ° C.

2. Soppressione di HXGPRT

Questo protocollo è progettato per rimuovere il marcatore HXGPRT dal suo sito di integrazione nel genoma di un Δ ku80 ceppo geneticamente manipolati. Rimozione di HXGPRT permette il recupero marcatore e la generazione di ceppi con molteplici manipolazioni genetiche utilizzando solo le selezioni a base di HXGPRT ^1-3. Mentre il protocollo descritto di seguito descritto il metodo di riorientamento di un locus per eliminare HXGPRT, va notato che la rimozione del HXGPRT al locus del gene di interesse consente inoltre simultanea reintegrazione del gene wild-type (complementation), re-integrazione di un gene mutante, così come ri-integrazione di un gene tag (N-o C-terminale GFP, HA tag, ecc,), consentendo una varietà di manipolazioni genetiche. I meccanismi d'azione ²⁴ e targeting protocolli mediante selezioni 6-thioxanthine sono stati precedentemente descritti ^1-3,15.

2.1 Elimina HXGPRT

1. Accise il marcatore selezionabile HXGPRT da pΔGOI da digerire con RE.Z per tagliare le uniche siti di enzimi di restrizione che fiancheggiano il HXGPRT (Figura 1B).
2. Verifica completa digestione del DNA tramite elettroforesi su gel di agarosio. Isolare la più grande delle due bande di gel di agarosio.

Nota: La più grande delle due bande contiene il plasmide con il 5 'e 3' del DNA bersaglio fianchi, ma non il gene HXGPRT.

3. Posizionare la sezione di agarosio contenente la banda di DNA più grande in una layin colonna di sping il piatto gel sulla membrana. Centrifugare a 13.000 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere sterile H ₂ O al flusso passante per portare il volume a 100 microlitri.

Nota: Altri metodi commerciali sono disponibili per isolare il DNA da agarosio.

4. Concentrare DNA da EtOH precipitazione, risospendere il DNA in un volume finale di 18 microlitri sterile H ₂ O.
5. Miscelare 1 ml di DNA concentrato con 7 ml di H ₂ O, 1 microlitri di buffer legatura 10x e 1 microlitri DNA ligasi T4 (5 unità) e posizionare la reazione a 4 ° C per una notte per generare pΔGOIc (pΔGOIclean) (Figura 3A).

Nota: frammenti di DNA con RE.Z contenenti estremità del DNA possono essere progettati e inclusi in questo passaggio per creare plasmidi adatti mirata re-integrazione del gene wild-type (complementazione), mirata re-integrazione di un gene mutante, nonché mirati re-integrazione di un gene con tag(N-o C-terminale GFP, HA tag, ecc).

6. Diluire il 2x reazione con sterile H ₂ O prima di elettroporazione.
7. Trasforma pΔGOIc in E. coli come nel protocollo 1.1 a sottoclone, isolare, e convalidare il plasmide di mira. Poi linearizzare pΔGOIc in preparazione per trasfezione (vedere i passaggi 1.1.11 a 1.1.26).
8. Ripetere il protocollo di trasfezione parassita come indicato nel protocollo 1.2 (punti da 1 a 11).

Nota: Prima di svolgere i punti da 1 a 8, verificare che la rimozione mirata di HXGPRT è fattibile nel ceppo mutante. Infettare un pallone ² 150 centimetri di cellule HFF confluenti con 1 x 10 ⁶ tachizoiti del ceppo mutante che utilizzano 6-thioxanthine (6TX) medio selezione (200 mcg / 6TX in media infezione ml) e posizionare il pallone in un saggio di PFU. Ispezionare il pallone otto giorni dopo per verificare che nessuno (o molto pochi; <10) PFU sono visibili, il che è essenziale stabilire che il potenzialegene ziale di targeting efficienza supererà qualsiasi potenziale reversione spontanea del ceppo mutante di un fenotipo con espressione HXGPRT ridotta (una resistenza fenotipo 6TX).

Nota: Circa il 5 - 10% dei siti di integrazione HXGPRT presentano una frequenza significativa e spontanea di resistenza 6TX anche se il marcatore HXGPRT è ancora integrato nel sito di destinazione (vedere la sezione Risultati rappresentante per la spiegazione).

9. Inizia selezione 6TX ~ 20 ore dopo la trasfezione, cambiando il medium nel ² pallone da 150 cm a 6TX medie selezione.

Nota: Non disturbare il pallone per ~ 10 giorni dopo la trasfezione.

10. Ispezionare il pallone per la formazione di PFU al giorno 10 - 12 post-trasfezione (tipo I parassiti) o il giorno 10 - 16 post-trasfezione (parassiti di tipo II).

Nota: ParasiTES essere mirati per la cancellazione di HXGPRT non cominceranno a crescere sotto selezione 6TX fino a quando il gene HXGPRT e mRNA viene eliminato, e la proteina HXGPRT residuo viene inattivato.

11. Agitare il matraccio di selezione per creare una soluzione parassita, e trasferimento 0.5 - 1.0 ml della soluzione parassita ad un nuovo ² tarato da 25 cm contenente cellule HFF confluenti e 5 ml 6TX mezzo di selezione. Ripetere il trasferimento dal primario 150 centimetri ² a ^New 25 centimetri ² boccette una volta al giorno per altri due giorni.

Nota: un campionamento multiplo aumenta le probabilità di catturare parassiti mirati vitali che hanno perso il gene HXGPRT.

12. Ispezionare la 25 centimetri ² palloni ~ 5 giorni dopo l'infezione per verificare la presenza di sviluppare PFUs con zone di parassiti replicanti sani. Selezionare uno o due flaconi contenenti zone di infezione.

Nota: Parassiti cancellati della replica gene HXGPRT ad un tasso di crescita normale in selezione 6TX.

13. Continuare a passare i parassiti nelle 6TX medio selezione.
14. Subclone la popolazione parassita dopo 25 - 30 giorni di selezione. Impostare un vassoio da 96 pozzetti con ~ 1 parassita / bene e un altro con ~ 2 parassiti / e.
15. Preparare DNA parassita da cloni isolati e mantenere cloni in una cultura formato a 24 pozzetti secondo il protocollo 1.2 (misure 19-29).
16. Convalida cancellazione di HXGPRT mediante PCR utilizzando la strategia delineata nelle figure 3A-B.

3. C-terminale Tagging delle Proteine

Questo protocollo è progettato per C-terminale di codifica di proteine ​​di mira il tag per integrazione mediante doppia croce oltre ricombinazione omologa al locus genomico del gene utilizzando MPA + X selezione ^2,4. Questo protocollo funziona efficiente perché la sequenza 5 'della DHFR HXGPRT marcatore è un funzionale regione 3 'non tradotta completamente validato per altri geni ^2,4.

3.1 diretto marcatura C-terminale delle proteine ​​a loci genetici endogeni

1. Creare il targeting pΔGOItag costrutto plasmidico utilizzando lievito clonazione recombinational (Figura 4) e metodi descritti nel protocollo 1.1. Il 5 'genomica fianco di mira contiene gli ultimi 800 a 1200 bp della regione codificante (o DNA genomico) del GOI, tranne il codone di terminazione viene spostato in una posizione 3' al tag di scelta (HA tag, tag di Myc, la sua etichetta , ecc)
2. Creare l'inserimento mirato del tag C-terminale al locus del gene endogeno codificanti proteine ​​seguendo la procedura descritta in protocollo 1.1 e 1.2 utilizzando la strategia delineata (Figura 4).
3. Verificare l'inserimento del tag C-terminale al locus del gene endogeno utilizzando una strategia PCR.
4. Reindirizza il locus genico utilizzando metodi descritti nel protocollo 1 e 2 del protocollo di dElete il marcatore selezionabile HXGPRT per creare un endogeno locus genico regolato con precisione che esprime una proteina marcata. Questo protocollo recupera anche il marcatore selezionabile HXGPRT che può essere utilizzato nuovamente per indirizzare un altro locus nel ceppo targhetta (vedi protocollo 1).

Un modello dettagliato è fornito per la costruzione di un plasmide di targeting per eliminare un gene, compreso il posizionamento di siti di enzimi di restrizione e la generazione dei primer che facilitano il targeting genetico e convalida di gene targeting, così come la costruzione plasmide per la successiva eliminazione di HXGPRT in un processo a singola fase (Figure 1A-C, Figura 2A, Figura 3A). Uno schema di massima è presentato per fare una delezione mirata gene (Figura 2A), le coppie di primer utilizzati per convalidare l'eliminazione di un knockout, per esempio, di tipo I rop18 (Figura 2B), e risultati rappresentativi della convalida PCR sono riportati (Figura 2C). Questo risultato rappresentativo è mostrato per illustrare la gamma dei risultati ottenibili in loci genetici che sono relativamente difficili da bersaglio. Un gene delezione mirata successo comporterà l'assenza del gene di ateresse prodotto di PCR (PCR 1), la presenza del 3 'genomica fianco di targeting (PCR2), e la presenza del marcatore selezionabile HXGPRT adeguatamente integrato tra il 5' e fianchi rivolti genomiche 3 'che definiscono la cancellazione (PCR3 e pCR4) . Cloni 3, 4, 5, 6, 8, 9, e 11 vengono convalidati delezioni geniche mirate (KO), dove HXGPRT ha sostituito il GOI (Figura 2C).

Un clone che non contiene un gene delezione può essere rappresentata da una varietà di modelli striature. Tipicamente, un clone senza gene delezione rispecchierà il ceppo parentale (pattern parentale) con bande osservati per PCR1 e PCR2, ma non per PCR3 o pCR4 come visto per i cloni 1 e 2 (Figura 2C). Questo "modello genitoriale" nasce da alcuni meccanismi potenziali. Di tanto in tanto, MPA parassiti selezionati resistenti portano non integrati episomi persistenti del pΔGOI rivolte plasmide, e notiamo che la continua selezione spesso costringe questi episomida integrare. Osserviamo anche alcuni retroscena rara nel tipo I Δ ku80 ceppo a causa di integrazione non intenzionale del pΔGOI mira plasmide, che contiene un HXGPRT cDNA espresso tramite DHFR 5 'e 3' elementi del promotore, in nessuna locus DHFR o nel HXGPRT parzialmente cancellato locus ^14. Anche se questo è un evento raro integrazione mirata, non è stata l'integrazione prevista e serve come un punto chiave da ricordare nella progettazione di qualsiasi strategia di sostituzione del gene. Omologia DNA superiore a 120 bp effettuate sul tuo pΔGOI mira plasmide può fornire un sito alternativo per la ricombinazione in Δ ku80 ² ceppi che potrebbero dare indietro un fondo indesiderato. Nel tipo II Pru Δ ku80 ceppo questo sfondo è ridotto o inesistente rispetto al tipo I, perché il marcatore selezionabile HXGPRT si basa su sequenze di tipo I che presentano polimorfismi nucleotidici se confrontato con il DNA di tipo II cheriduce notevolmente questa rara esperienza in esperimenti che utilizzano il tipo II Pru Δ ku80 ceppo ^1. Se un locus genico è essenziale (non possono essere eliminati), o ha un gene estremamente bassa di mira frequenza al locus, o se persiste [non integrati] episomi non vengono facilmente eliminati attraverso la crescita e la selezione, questo modello genitoriale dominerà il pattern osservato in MPA cloni resistenti. In alternativa, la molecola di DNA di targeting si osserva talvolta ad integrare a solo il 5 'o 3' genomica fianco targeting e una banda viene osservata sia per PCR3 o pCR4 (ma non entrambi) insieme PCR1 e PCR2 come visto per il clone 10 (5 'integrazione) e clone 7 (3' integrazione) (Figura 2C). Questi modelli suggeriscono infrequente il verificarsi di un singolo croce sopra integrazione del plasmide mira al locus che integra HXGPRT ma questa integrazione mirata non elimina il gene di interesse. Questo modello (corsie 7 e 10 in Figura 2C) emphasizes la necessità di riferire dati PCR per verificare che l'integrazione mirata verificato anziché un'unica omologa attraversare e un secondo non omologa integrazione della molecola targeting. Raramente, osserviamo un misto genetico rappresentato da clone 12 (Figura 2C) che rappresenta sia un modello genitoriale e un modello di eliminazione mirata. Questo modello deriva probabilmente in occasione di due genotipi parassite che sono presenti nella stessa posizione in un ben clonazione.

Viene mostrato un schema generale per la rimozione di HXGPRT da Δ ku80Δgoi :: HXGPRT eliminare HXGPRT dal ceppo (Figura 3A). La coppia di primer utilizzato per convalidare la rimozione di HXGPRT da ku80 Δ Δ gra2 :: HXGPRT (Figura 3B) amplifica un unico ~ 1,2 Kbp banda in PCR5 come visto nella cloni 4, 7, 9, 11 e 12 (Figura 3C). Se HXGPRT non viene rimosso dal locus, a ~ 3.Si osserva 4 banda Kbp (cloni 1, 2, 3, 6, 8, 10, e il controllo dei genitori). Diversi meccanismi agiscono per rendere la rimozione di HXGPRT (6TX selezione) più impegnativo e meno efficiente l'integrazione di HXGPRT (MPA + X selezione). Selezione MPA è semplicemente più efficiente di 6TX selezione ^14,16. Inoltre, sono necessari alti livelli di espressione HXGPRT per la selezione 6TX che per MPA selezioni ^16,24. Di conseguenza, le mutazioni che possono ridurre l'attività dell'enzima HXGPRT o mutazioni o cambiamenti epigenetici che riducono il livello di espressione di HXGPRT al locus di un gene potenzialmente in grado di abolire l'efficacia della selezione 6TX. Anche con queste sfide di selezione 6TX, il tasso di successo della selezione 6TX in Δ ku80 ceppi è superiore del 90% al primo tentativo ^1-3.

Viene mostrato un modello generale di codifica C-terminale diretto di geni codificanti proteine ​​(Figura 4). Questoschema utilizza integrazione diretta tramite doppia croce sopra ricombinazione omologa di HXGPRT 3 'del gene etichettato e impiega anche strategie convalida analoghe a quelle sopra descritte. Quando un gene è sospettato di essere un gene essenziale questo può essere verificata utilizzando una seconda trasfezione con un isolato indipendente di targeting DNA plasmidico. Metodi alternativi, come i regimi per l'espressione genica regolata, sono a disposizione per ulteriori verificare se un gene è essenziale ^25.

Figura 1. Presentazione del progetto di un DNA di targeting plasmide. Un. Schema per la progettazione di sovrapposizione primer utilizzati per la PCR amplifica il 5 'e 3' fianchi di destinazione con 33 sovrapposizioni bp per la navetta vettore pRS416 e cassette minigene HXGPRT. Primer raffigurati nello schema eranoutilizzato per generare il 5 'e 3' fianchi bersaglio di pΔROP18 ^10. B. Strategia generale per la progettazione di una molecola di DNA di targeting. La spina dorsale della pΔGOI è il pRS416 navetta vettore contenente uracile (URA) e ampicillina (AMP) marcatori selezionabili. Inserita in pRS416 è un ~ 1 Kbp 5 'DNA bersaglio fianco amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni per la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando i primer F1 e R1, un ~ 1 Kbp 3' del DNA fianco bersaglio viene amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni di la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando i primers F2 e R2 e la cassetta minigene HXGPRT. I seguenti enzimi di restrizione unici siti digest sono aggiunti i primer: RE.X (sito di restrizione enzimatica taglio X) nel primer F1 per tagliare il plasmide all'estremità 5 'estremità del 5' DNA bersaglio fianco, RE.Y in R2 Primer per tagliare il plasmide alla 'fine del 3' del DNA bersaglio 3 affiancare e RE.Z nei primers R1 e F2 di asportare il HXGPRT mincassette igene. C. sequenze dei primer utilizzati per generare il costrutto di mira per la cancellazione di rop18. Le regioni in grassetto corrispondono a T. gondii sequenza genomica, e le regioni nonbold corrispondono ai siti degli enzimi di restrizione e sequenze che si sovrappongono con pRS416 e la cassetta minigene HXGPRT. La coppia di primer HX_F e HX_R amplifica il HXGPRT cassetta minigene ^14. Primer letti da 5 'a 3'. Tabella adattata da Fentress et al ^10. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Panoramica del protocollo per la delezione di un gene utilizzando HXGPRT. Un. Disruption di un MOL nel ceppo Δ ku80Δhxgprt da un doppio incrocio evento di ricombinazione omologa con un ~ 1 Kbp 5 'DNA bersaglio fianco e un ~ 1 Kbp 3' del DNA bersaglio fianco sul pΔGOI plasmide. Una strategia di PCR utilizzando PCR1, PCR2, PCR3 e pCR4 (non in scala) e 'stato che permette la verifica genotipo di convalidare cloni con l'integrazione mirata di HXGPRT e delezione del locus GOI. B. coppie di primer Rappresentante progettato per convalidare l'eliminazione della rop18 . ROP18_DF e ROP18_DR amplificano PCR1, ROP18_ExF e ROP18_CxR amplificano PCR2, ROP18_CxF e DHFR_CxR amplificano PCR3 e DHFR_CxF e ROP18_CxR amplificare pCR4 (Figura 2A). Primer letti da 5 'a 3'. Tabella adattata da Fentress et al ^10. C. I risultati rappresentativi di validazione di una mirata delezione del gene (rop18) utilizzando HXGPRT. Dopo la trasfezione di plasmidi pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt e selezione in MPA +X, MPA + X cloni resistenti sono stati saggiati per la cancellazione di rop18. Ceppo parentale Il controllo è positivo per la PCR 1 (~ 400 bp) e la PCR 2 (~ 650 bp) del prodotto e negativo per la PCR 3 (~ 1.200 bp) e la PCR 4 (~ 1.300 bp) del prodotto. Una mirata GOI knockout è positivo per i PCR2, PCR3 e pCR4 prodotti ed è negativo per la PCR 1 prodotto (vedere la Figura 2A). Visualizzati sono pannelli rappresentativi dei risultati di PCR1 e PCR2 (pannello superiore), PCR3 (pannello centrale), e pCR4 (pannello inferiore). Cloni 3, 4, 5, 6, 8, 9 e 11 mostrano il corretto pattern di bande di PCR 1, PCR2, PCR3 e pCR4 che definisce un evento gene delezione mirata nel clone. Cloni 1, 2, 7, 10 e 12 non sono delezioni geniche, e corrispondono ad altri potenziali risultati rappresentativi. (C = ceppo di controllo parentale Δ ku80Δhxgprt, M = segnataglie). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Panoramica del protocollo per la ri-mira il gene di interesse a cancellare HXGPRT. A. Strategia per la rimozione del marcatore selezionabile HXGPRT da un doppio incrocio evento di ricombinazione omologa nel ceppo Δ ku80Δgoi :: HXGPRT usando un ~ 1 Kbp 5 'DNA bersaglio fianco e un ~ 1 Kbp 3' del DNA bersaglio fianco sul pΔGOIc plasmide. La strategia PCR per la verifica genotipo è raffigurato con una coppia di primer di saggio per un prodotto di PCR (PCR5) che attraversa la delezione (non in scala). B. Una coppia rappresentante Primer progettato per convalidare la rimozione del marcatore selezionabile HXGPRT dal gra2 locus nel ceppo Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primer GRA2 _CLF e GRA2_CxR amplificano PCR5. Primer leggere da 5 'a 3' del pannello. C. Rappresentante di cloni 6TX resistenti che possono essere ottenuti a seguito di trasfezione pΔGOIc plasmide in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT e selezione in 6TX. Cloni 4, 7, 9, 11 e 12 mostrano il corretto pattern di bande di PCR5 che corrisponde alla delezione mirata del marcatore HXGPRT (~ 1,2 Kbp prodotto che abbraccia 'al fianco con leggera sovrapposizione con il 5' 3 il fianco e all'esterno 3 ' fianco). Cloni 1, 2, 3, 6, 8, e 10 (questa banda è luce) rappresentano il pattern di bande atteso di circa ~ 3,4 kbp corrispondente al clone genotipo parentale, anche se questi cloni mostravano un grado di resistenza al 6TX quella ammessa la loro selezione (questo fenotipo può occasionalmente sorgere spontaneamente da arresto di espressione HXGPRT (vedi nota a protocollo 2.1 (punto 8), e la sezione Risultati Rappresentante). (C = ceppo di controllo parentale Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = segnataglie).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.

Figura 4. Progettazione di una molecola di DNA di targeting per contrassegnare il C-terminale di una proteina. La strategia si basa sulla capacità del marcatore HXGPRT di funzionare anche come un 3 'regione regolatoria a valle. La spina dorsale della pΔGOItag è il pRS416 navetta vettore contenente uracile (URA) e ampicillina (AMP) marcatori selezionabili. Inserita in pRS416 è un ~ 1 Kbp 5 'DNA bersaglio fianco amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni per la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando il Fgoi e rTag primer, un ~ 1 Kbp 3' del DNA fianco bersaglio viene amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni di la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando la F2 e R2primer e la cassetta minigene HXGPRT. Il 5 'DNA bersaglio fianco sostituisce il codone di terminazione con il tag (HA, Myc, His, ecc) seguita da un codone di terminazione sostituzione. MPA + X selezione integra il tag C-terminale ed un HXGPRT valle, e sposta il 3 'UTR ad una posizione dopo il marcatore HXGPRT. I seguenti enzimi di restrizione unici siti digest sono aggiunti i primer: RE.X (sito di restrizione enzimatica taglio X) nel primer Fgoi per tagliare il plasmide all'estremità 5 'estremità del 5' DNA bersaglio fianco, e RE.Y nella Primer R2 per tagliare il plasmide alla 'fine del 3' del DNA 3 fianco bersaglio, e RE.Z nel rTag primer e F2 per asportare la cassetta minigene HXGPRT all'impiego per la costruzione del plasmide di riorientamento di locus del gene etichettato eliminare il marcatore HXGPRT da ristabilire la collocazione del 3 'UTR.

Qui forniamo un protocollo per genica mirati ed efficaci in Δ ku80 parassita ceppi per permettere il recupero efficiente di progenie geneticamente manipolata che possiedono delezioni geniche mirate, sostituzioni geniche e / o geni marcati. L'esecuzione sequenziale di questi metodi fornisce un approccio affidabile per l'isolamento di mutanti parassita che contengono manipolazioni genetiche mirate singoli o multipli ^1-3. Mentre la generazione di una delezione mirata dipende da molteplici fattori, l'uso del ceppo ku80 Δ con la strategia e protocollo presentato aumenta notevolmente l'efficienza e la facilità di fare ceppi mutanti ben definiti di T. gondii per studi di genomica funzionale.

Il genoma di T. gondii durante le fasi asessuali è aploidi. Pertanto vantaggi di fare quando si pianifica di eliminare un gene è il gene che non deve essere essenziale in vitro. Tuttavia, l'efficienza di targeting gene ko in Δ ku80 ceppi è estremamente elevata, e questo permette l'isolamento di ceppi mutanti con tassi di replica significativamente compromessa. Se un gene mirato è essenziale, parassiti spesso cessano di replicare durante la selezione. Un altro fattore critico mirata manipolazione genetica è quella perfetta omologia con almeno 620 bp del fianco di mira genomico è necessaria per ottenere integrazioni mirate rilevabili ^2. Regioni più lunghi di omologia producono elevate efficienze di targeting e il targeting utilizzando fianchi di DNA di circa 1.000 bp è un metodo affidabile ed efficiente ^1-4. Per questo motivo è importante che genomiche fianchi di targeting sono generati dallo stesso ceppo di T. gondii (RH, Pru) come il ceppo che viene geneticamente manipolato. Mancanza di sufficiente omologia può spesso provocano la integrazione mirata di un fianco di targeting genomico, ma non l'altro. Integrazione incompleto o mancato ottenimento di un ma koy anche essere dovuto alla persistenza episomiale. Subito dopo la trasfezione, tutte le molecole di targeting sono episomi non integrati, e qualche volta le molecole di targeting può persistere come episomi per molte generazioni. Utilizzando bersaglio fianchi di DNA di ~ 1 Kbp e continuando a passare i parassiti sotto la selezione prima di ri-subcloning risolve spesso i problemi connessi con la persistenza episomiale.

Una volta che un knockout è convalidata e il marcatore HXGPRT viene rimosso, la strategia di targeting gene può essere ripetuta su un secondo GOI di generare più gene delezioni in un singolo ceppo parassita ^1-3. La generazione di delezioni, sostituzioni, o geni con tag può anche essere realizzato utilizzando diversi marcatori selezionabili (bleomicina, CAT, pirimetamina resistente DHFR, ecc.) Sebbene il marcatore selezionabile CAT attualmente è presente nel tipo II Δ ku80 Pru genoma ^1, questo marcatore può essere rimosso usando il HXGPRT protocollo di selezione descritti qui. Nelle nostre mani, la selezione HXGPRT è il più sicuro e il marcatore più efficace con la più alta efficienza di mira in cui una singola copia di inserimento mirato è sufficiente per la selezione robusta nel MPA + X medie. HXGPRT fornisce anche l'approccio unico momento utile per l'eliminazione mirata di un marcatore selezionabile (Figura 3) usando 6-thioxanthine (6TX) Selezione ^2,3. Così questo protocollo fornisce l'unica attuale approccio per lo sviluppo di ceppi mutanti definiti con diverse manipolazioni genetiche mirate.

Questo protocollo fornisce un metodo valido ed efficace per la manipolazione genetica mirata a Δ ku80 ceppi di Toxoplasma gondii e si applica all'analisi di un singolo gene, una famiglia di geni, o genoma studi di genomica funzionale. Prima della disponibilità di ceppi Δ ku80 ^1,2, questi approcci non erano ampiamente possibile a causa della ineFficiency di questi metodi. Di conseguenza, questo protocollo è ampiamente applicabile per mirati manipolazione genetica di Toxoplasma gondii ed è accessibile a tutti i ricercatori interessati ad affrontare una serie di domande sulla biologia dei parassiti, risposta dell'ospite, e la genomica funzionale.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH per DJB (AI041930, AI073142, AI075931 e AI091461).