Metodi sperimentali per testare gli effetti del peptide neurotrofico, ADNF-9, Contro L'apoptosi indotta da alcol durante la gravidanza in topi C57BL / 6

I disegni sperimentali proposti qui concentrarsi sullo studio degli effetti dell'esposizione alcol in apoptosi e l'applicazione del peptide neurotrofico durante la gravidanza nel cervello del feto. Una descrizione dettagliata dall'allevamento alla raccolta di cervelli fetali è descritto. Tecniche per la determinazione di apoptosi sono anche descritte in dettaglio.

Disegni sperimentali per indagare gli effetti dell'esposizione prenatale durante le prime fasi embrionali in crescita del cervello del feto sono impegnative. Ciò è dovuto principalmente alla difficoltà di microdissezione dei cervelli fetali e loro sezionamento per la determinazione delle cellule apoptotiche causate dall'esposizione prenatale all'alcol. Gli esperimenti qui descritti fornire tecniche visualizzati da topi allevamento all'identificazione della morte cellulare nel tessuto cerebrale fetale. Questo studio ha utilizzato C57BL / 6 topi come modello animale per studiare l'esposizione fetale alcol e ruolo trofico peptide contro l'apoptosi indotta da alcol. L'allevamento costituita da una finestra stuoia 2-ore per determinare lo stadio esatto di età embrionale. Un modello di esposizione fetale alcolico stabilito è stato utilizzato in questo studio per determinare gli effetti dell'esposizione prenatale dell'alcool nel cervello fetale. Questo comporta il libero accesso a alcol o pair-fed diete liquide come unica fonte di nutrimento per i topi in gravidanza.

Per indagare l'apoptosi, cervelli fetali vengono prima inseriti in gelatina con una buccia-away stampo per facilitare il loro sezionamento con un apparato vibratome. Cervelli fetali incorporati e fissati in paraformaldeide sono facilmente sezionato, e le sezioni fluttuanti possono essere montati in SuperFrost più vetrini per la determinazione di apoptosi o morte cellulare.

TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminale deoxynucleotidyl transferasi) test è stato utilizzato per identificare la morte delle cellule o di cellule apoptotiche. È interessante notare che apoptosis e citotossicità cellulo-mediata sono caratterizzati dalla frammentazione del DNA. Così, le cellule TUNEL-positive visualizzati sono indicativi di morte cellulare o cellule apoptotiche.

I disegni sperimentali qui forniscono informazioni circa l'uso di una dieta liquida stabilito per studiare gli effetti di alcool e il ruolo dei peptidi neurotrofici durante la gravidanza, nel cervello del feto. Ciò comporta allevamento e di alimentazione topi in gravidanza, microdissecting cervelli fetali, e determinando l'apoptosi. Insieme, queste tecniche visive e testuali potrebbero essere una fonte per indagare l'esposizione prenatale di agenti nocivi nel cervello del feto.

L'obiettivo dei metodi sperimentali descritti qui è quello di valutare gli effetti neuroprotettivi di peptidi trofiche in un modello di esposizione alcolica fetale utilizzando diverse tecniche che comportano l'allevamento, l'alimentazione, microdissecting, e rilevando la morte cellulare. Lavora dal nostro laboratorio ha coinvolto una dieta liquida mescolata con alcol come un modello di consumo di alcol moderato, che potrebbe essere simile a un bere paradigma umano in termini di quantità di alcol consumato ^1-5. Noi e altri abbiamo identificato tre derivati ​​peptidici che sono neuroprotettivo contro gli effetti deleteri di esposizione alcolica fetale. Studi che hanno valutato l'esposizione di alcol durante le fasi embrionali utilizzando modelli animali possono portare all'identificazione di potenziali meccanismi di neuroprotezione e consentire lo sviluppo di procedure di intervento. Questo può fornire ampie informazioni sugli effetti neuroprotettivi e di attenuazione degli effetti deleteri di esposizione alcol durante la gravidanza.

Possibile prevenzione degli effetti dell'esposizione prenatale può comportare il trattamento di topi in gravidanza con peptidi che hanno dimostrato di essere coinvolti in neuroprotezione in vitro e in vivo ^{6,7 1,2,4,8,9.} Tra questi peptidi, SALLRSIPA, noto come ADNF-9 o SAL, è derivato da attività dipendente fattore neurotrofico (ADNF) ^7,10. Un altro peptide con la sequenza NAPVSIPQ peptide, PNA definito, derivato dalla proteina neuroprotettiva attività-dipendente (ADNP) ^6,11, dimostrato un potente effetto protettivo contro lo stress ossidativo associato con l'esposizione di alcol ^12,13. Inoltre, abbiamo recentemente identificato un nuovo peptide sintetizzato, colivelin che sembra giocare un ruolo chiave nel neuroprotettivo alcool modello esposizione fetale ^2. Colivelin è composto ADNF-9 e-AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). L'importanza dell'uso di questi peptidi è che hanno la capacità diattraversare la barriera sangue-cervello per evitare che gli effetti di apoptosi indotta da alcol e deficit di crescita del cervello.

I metodi sperimentali utilizzati C57BL / 6 topi per testare gli effetti neuroprotettivi contro l'apoptosi indotta da alcol. Abbiamo adottato una finestra 2-ore anziché overnight allevamento al fine di stimare con precisione il giorno embrionale 0 (E0), come può essere rivelato dal rilevamento di una spina sperma e striscio vaginale ^1-5. Abbiamo usato una dieta liquida con tubi di alimentazione, in quanto questo è considerato libero accesso al posto di consegna di alcol attraverso la via sonda gastrica, che può indurre stress a topi in gravidanza. D'altra parte, microdissezione può essere difficile a causa della morbidezza del tessuto cerebrale fetale, che si possono verificare durante la dissezione cervelli fetali in primi stadi embrionali. Qui vi mostriamo le tecniche visualizzati per affrontare tutte le sfide che coinvolgono microdissezione. Inoltre, poiché il sezionamento cervello fetale può anche essere impegnativo, abbiamo adottatouna tecnica che prevede l'incorporamento il cervello del feto in gelatina con pelabile incorporamento stampi. Abbiamo avuto successo nel ridurre i cervelli fetali nelle sezioni fluttuanti a 50 micron di spessore. Questo ci permette di indagare eventuali alterazioni delle proteine ​​contenuti in sezioni di cervello fetale, compresa l'individuazione di morte cellulare.

1. L'allevamento e la trofico trattamento con il peptide

1. Razza C57BL/mice mettendo i topi di sesso femminile (~ 6 settimane di età, peso medio 20 g) in gabbie a casa maschi per 2 ore.
2. Verificare la presenza di un tappo di spermatozoi e / o striscio vaginale subito dopo.
3. In caso positivo, indicare questo punto di tempo come embrionale giorno 0 (E0).
4. Su E7, peso-match femmine gravide di controllo e di trattamento (3 gruppi) sono assegnati come descritto di recente ^4: 1) (etanolo) gruppo alcolico liquido dieta (ALC), 2) pair-fed gruppo di controllo (PF); 3) gruppo di trattamento con il peptide, che dovrebbe ricevere intraperitoneale (ip) iniezione di ADNF-9 peptide accanto alcool esposizione dieta liquida (ALC/ADNF-9). I dettagli della preparazione di ALC e diete PF e la procedura di iniezioni ip possono essere trovati nel nostro recente lavoro ^4.
5. Misurare dieta liquida alcol quotidiana che può essere fornito come accesso libero come unica fonte di nutrienti. Dieta liquida PF aggiogato individualmente tO una diga di ALC può essere misurata ogni giorno pure.
6. Il volume di dieta liquida consumata durante il precedente 24 ore può essere registrato da 30 ml graduato provette con tappo a vite e la dieta preparata deve essere fornito ogni giorno da E7 a E13.

2. Dissezione dei feti e microdissezione dei cervelli fetali

1. Sacrifica topo gravide su E13 da profondamente eutanasia i topi con una procedura di CO ₂ seguito da una dislocazione cervicale.
2. Pulire il sito di incisione addominale con il 70% di etanolo.
3. Praticare un'incisione addominale con forbici e pinze sterili.
4. Una volta che l'addome è aperto, sezionare l'utero tenendola con una pinza e con le altre pinze per strappare la mesometrio via dall'utero. Assicurati di fare questa procedura lentamente per evitare la puntura degli embrioni.
5. Rimuovere gli embrioni dall'utero e trasferirli in un piatto di coltura cellulare (60 mm x 15 mm) contenente una soluzione salina bilanciata Hanks ' (HBSS) in acqua ghiacciata.
6. Sezionare cervelli fetali da tutto embrioni sotto stereomicroscopio per microdissezione.
7. Utilizzando ultra-pinza sottile per microdissezione, tirare fuori la pelle degli embrioni nella parte superiore della testa per esporre il cranio.
8. Una volta che il cranio è esposto e chiaramente visualizzato con lo stereomicroscopio microdissezione, poi staccare il cranio partendo dalla parte posteriore del cervello al midollo spinale e aree del tronco cerebrale.
9. Assicurarsi di staccare il pezzo di cranio per pezzo da posteriore a parte anteriore della testa.
10. Una volta che il cervello fetale sono esposti visivamente, procedere alla loro estrazione.
11. Sezionare i cervelli fetali dalla base del bulbo olfattivo primordium alla base del metencephalon.
12. Postfix tutto sezionato il cervello fetale in paraformaldeide al 4% per 2-3 giorni. È inoltre possibile bloccare altri cervelli fetali da ogni diga se li sta testando per Western Blot o saggi enzimatici.

3. Incorporare Brains fetali in gelatina per il sezionamento

1. Preparare il 10% di gelatina di grado A.
2. Riempire uno stampo peel-away incorporamento a metà strada e attendere finché le solidifica gelatina.
3. Controllo e posto prenatally trattata fetale cervelli side-by-side in cima alla gelatina solidificata. Questo per mantenere condizioni coerenti di immunorivelazione di morte cellulare sia tra gruppi di controllo e sperimentali.
4. Aggiungere liquido gelatina sulla parte superiore dei cervelli fetali per fare uno stampo completo (assicurarsi che la gelatina non è troppo caldo).
5. Mettete in frigo lo stampo gelatina preparata che contiene il cervello fetale per 15 min.
6. Staccarel'embedding muffa di plastica e quindi trasferire il pre-fatte di gelatina contenenti cervello fetale in paraformaldeide al 4% per due giorni.
7. Luogo e sezione fissa cervelli fetali in gelatina per mezzo della macchina di sezionamento vibratome (Leica VT 1000S) a 50 micron di spessore per il sezionamento coronale. Questo spessore è testato nei nostri studi perché fornisce migliori caratteristiche anatomiche. Inoltre, spessori di 25 micron e superiori possono essere testati con questa tecnica che coinvolge integrata di cervelli fetali nel 10% di gelatina. Si noti che le sezioni coronali sono state tagliate utilizzando vibratome a livello eminenza gangli basali sul prosencefalo
8. Raccogliere le sezioni del cervello fetale in tamponata con fosfato soluzione salina (PBS).
9. Montare le sezioni del cervello fetale in Superfrost Plus. vetrini in acqua.
10. Asciugare le sezioni montate per 15 min.
11. Porre i vetrini (montata con le sezioni del cervello del feto) in PBS per il prossimo test giorno di reazione TUNEL.

4. TUNEL reazione per Deprotezione della morte cellulare o apoptosi

(TUNEL: TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminale deoxynucleotidyl transferasi). Questo dosaggio è finalizzata a determinare la morte cellulare.

1. Trattare sezioni di cervello fetale montate in Superfrost Plus. vetrini con proteinasi K (20 pg / ml) per 5 min a 37 ° C (300 ml di proteinasi K misto in 20 ml di PBS). I vetrini sono assemblati in 5 Plend aperto Maile).
2. Sciacquare sezioni del cervello fetale (montato in diapositive) con PBS per tre volte per 5 min sotto Agitatore orbitale.
3. Incubare le sezioni con 3% H ₂ O ₂ in metanolo per 10 min a temperatura ambiente (3 ml 30% H ₂ O ₂ in 27 ml di metanolo 100%) (vetrini non dovrebbero essere in una manetta).
4. Sciacquare le sezioni con PBS per tre volte per 5 min in agitatore orbitale.
5. Incubare le sezioni in soluzione di permeabilizzazione (0,1% TritonX-100 in 0,1% di citrato di sodio) per 2 min in ghiaccio (4 ° C) (100 TritonX microlitri + 0,1 g di sodio citrato + 99,9 ml distilled acqua).
6. Lavare le sezioni in PBS due volte per 5 minuti in agitatore orbitale.
7. Zona secca intorno sezioni nelle diapositive.
8. Disegnare barriera su Superfrost Plus. diapositive utilizzando penna PAP. Questo ha lo scopo di impedire qualsiasi fuoriuscita di soluzione che viene utilizzato per trattare le sezioni per la rilevazione di cellule TUNEL-positive.
9. Incubare le sezioni con miscela di reazione TUNEL (50 microlitri dal flacone 1 e 450 microlitri da bottiglia 2) per 1 ora a 37 ° C, il controllo sarà utilizzato da incubazione in soluzione dalla bottiglia 2.
10. Risciacquare con PBS tre volte 5 min sotto Orbit shaker.
11. Zona secca intorno tessuto.
12. Incubare le sezioni con convertitore-POD per 30 min a 37 ° C.
13. Risciacquare le sezioni tre volte per 5 min con Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M).
14. Incubare le sezioni per 7 min a 0,05% tetraidrocloride 3'-3'-diaminobenzidina (DAB) e 0,003% H ₂ O ₂ (25 ml Tris HCl, pH7.5, 0,05 M + 25 pl 3% H ₂ 0 ₂ + 500 DAB microlitri) Sotto Oribtal shaker a 4 ° C (nel ghiaccio) e scuro (assicurarsi di fare questa procedura nel nuovo 5 Plend aperto mailer).
15. Sciacquare le sezioni con PBS tre volte 5 min sotto Agitatore orbitale.
16. Tenere le sezioni diapositive in PBS per non più di 24 ore in PBS, poi elaborarli per la colorazione di Nissl come dettagliato nel protocollo sezione successiva.

Nota: DAB è una sostanza cancerogena. Utilizzare guanti e pulire tutti i piatti utilizzati con la candeggina, una volta finito con tutti gli esperimenti.

5. Colorazione di Nissl per la preparazione di sezioni di cervello fetale per l'osservazione microscopica

1. Procedura di colorazione Nissl dovrebbe essere fatto in una cappa di sicurezza biologica.
2. Sciacquare le sezioni di diapositive con acqua deionizzata per 2 min.
3. Incubare le sezioni in etanolo al 70% per 2 min.
4. Incubare le sezioni in etanolo al 95% per 6 min.
5. Incubare le sezioni in etanolo al 70% per 2 min.
6. Lavare le sezioni in deionizzata water per 2 min.
7. Incubare le sezioni in violetto cresolo Stain per 3 min.
8. Lavare le sezioni in acqua deionizzata per 2 min.
9. Incubare le sezioni in etanolo al 70% per 2 min.
10. Incubare le sezioni in etanolo al 95% + 3 ml di acido acetico glaciale per 3 min.
11. Incubare le sezioni in etanolo al 95% per 2 min.
12. Incubare le sezioni in 100% di etanolo per 2 min tre volte.
13. Incubare le sezioni in xilene per 10 minuti tre volte.
14. Slides possesso sezioni cerebrali fetali possono essere montati utilizzando Permount e copertura antiscivolo vetrini.
15. Lascia il diapositive montate durante la notte prima di osservazione microscopica e analisi.
16. Osservazione microscopica e microfotografie possono essere eseguite sotto Leica microscopio verticale.

I metodi sperimentali descritti mostrano che una finestra di riproduzione 2-HR è essenziale per stimare fase gestazionale accurata. Abbiamo dimostrato la dissezione degli embrioni, all'età di E13. Abbiamo inoltre dimostrato microdissezione dei cervelli fetali a E13. La procedura comporta varie fasi (AC), come descritto in Figura 1. Cervelli fetali sono sezionati dalla base del bulbo olfattivo primordium alla base del metencephalon (Figura 1). Cervelli fetali vengono poi fissati in paraformaldeide al 4% per la rilevazione immunochimica. Dopo fissazione, cervelli fetali sono incorporati in 10% di gelatina e preparati per vibratome sezionamento come descritto nella Figura 2. Notare che passo-passo incorporamento di cervelli fetali è stata eseguita con ingrandimento inferiore. Cervelli fetali incorporati possono essere visualizzati a maggiore ingrandimento nella figura 1. Inoltre, sezioni coronali di cervello fetale a livello di eminenza gangliare sul prosencefalo puòessere ottenuti utilizzando il vibratome e montato in diapositive per la rilevazione immunoistochimica. Si tratta del numero di cellule TUNEL-positive (figura 3). Mostriamo qui che l'esposizione prenatale indotto aumenti di cellule TUNEL-positivi in eminenza gangliare (Figura 3b) rispetto al gruppo di controllo PF (Figura 3a). ADNF-9 l'amministrazione ha ridotto in modo significativo aumento di alcol-indotta nelle cellule TUNEL-positivi (Figura 3c e 3d) rispetto al gruppo di ALC.

Figura 1. Microdissezione dei cervelli fetali a E13. Stages ac mostra passo-passo procedura s da embrioni di cervelli fetali sezionati a.) Dissected controllo (PF) e alcol (ALC) esposti prima della nascita degli embrioni. B) pelle staccata per esporre i cervelli fetali di PF e gruppi di ALC. c) Dissected cervelli fetali di PF e gruppi di ALC.

Figura 2. Metodo per l'incorporamento cervelli fetali per il sezionamento. Stages (ae) mostrano le procedure passo-passo della preparazione del radicamento del cervello fetale per l'impostazione del blocco di gelatina in oggetto per il taglio vibratome a.) Peel-away incorporamento stampo riempito metà con gelatina; b) da cervello fetale controllo PF e gruppi ALC sono collocati fianco a fianco nello stampo e coperto con gelatina; c) pelabile embedding stampo tagliato in quattro lati; d) cervelli fetali incorporati in gelatina e pronto da fissare in paraformaldeide, e) gestampo latino contenente cervelli fetali vengono inseriti nell'oggetto per vibratome sezionamento.

Figura 3. Effetti del peptide neurotrofico, ADNF-9, contro l'alcool apoptosi indotta mediante TUNEL in eminenza gangliare a E13 stadio. Esposizione prenatale indotto aumenti di morte cellulare come indicato dalle frecce al gruppo ALC (b) rispetto al gruppo PF (a). ADNF-9 amministrazione accanto esposizione prenatale ha mostrato diminuzione delle cellule TUNEL-positive (c). Le analisi statistiche hanno dimostrato che ADNF-9 somministrazione impedito aumenti alcol indotti in cellule TUNEL-positive (d). I valori sono riportati come media ± SEM. * P <0.05; ** p <0,01 (test di Newman-Keul post hoc). N = 4 per ogni gruppo. Barra di scala = 100 micron. Ristampato dalla pubblicazione (4), con il permesso di ElSevier (licenza # 2904310752995).

La metodologia e la tecnologia presentata in questo studio dimostrano gli effetti dell'esposizione prenatale ad alcol nel cervello fetale e il ruolo dei peptidi trofici nella prevenzione di questi effetti. Questi possono fornire informazioni sul modo di studiare altre sostanze d'abuso o di altre sostanze chimiche tossiche nel cervello del feto durante le diverse fasi della gravidanza.

Riguardo il paradigma allevamento, in alcuni casi la rilevazione della spina spermatozoi potrebbe non essere osservabile. A questo punto, è importante testare il striscio vaginale in un vetrino sotto osservazione microscopica, che può fornire possibili spermatozoi rilevazione positiva.

Si afferma in questo studio che l'alimentazione prevede il libero accesso di dieta liquida contenente il controllo PF e alcol. Almeno il 30% di umidità e una temperatura non superiore a 22-24 ° C sono necessari per monitorare la qualità della dieta durante la 24-ore di accesso gratuito al ^1,2 dieta. E 'anche necessario che ladieta essere preparato fresco ogni giorno. I tubi di alimentazione devono essere puliti dopo ogni utilizzo.

Ci sono difficoltà di microdissezione del cervello fetale. Queste dipendono dalla fase embrionale testato. Per esempio, il cervello del feto sezionati all'età di E13 possono essere difficili da affrontare rispetto a cervelli fetali sezionati a E18. Ciò è dovuto al fatto che a E18, i cervelli fetali sono ben sviluppati e il cranio diventa facile da tirare fuori rispetto a E13, quando il cranio è ancora morbido e difficile da staccare. A questo punto, quando sezionare cervelli fetali a E13, è importante per tirare fuori il cranio pezzo per pezzo come dimostrato nel video fornito con questo manoscritto.

Per quanto riguarda l'incorporamento cervelli fetali in gelatina, abbiamo scoperto che questa è la tecnica migliore per ottenere sezioni che sono pronti per essere utilizzati per l'analisi immunoistochimica. Al fine di avere una migliore taglio del cervello fetale, è importante che la fissazione in paraformaldeide al 4% delblocco di gelatina contenenti cervelli fetali è completa. Così, questo può richiedere almeno due giorni, e il blocco di gelatina potrebbe essere pronto per il taglio da parte del terzo giorno. Lo spessore delle sezioni è anche un fattore; 50 micron di spessore è solitamente testato per rilevazione immunochimica come TUNEL ^1,2,4. Tuttavia, spessori di 25 micron e superiori possono essere testati.

Non ci sono informazioni da fornire.

Questo progetto di ricerca è stata sostenuta da Premio Numero R21AA017735 (YS) dagli Istituti nazionale su abuso di alcool e l'alcolismo. Il contenuto è di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali dell'Istituto nazionale su abuso di alcool e l'alcolismo o la National Institutes of Health. L'autore desidera inoltre ringraziare Charisse Montgomery per la modifica di questo manoscritto.