Experimentelle Methoden zur Prüfung der Auswirkungen von Neurotrophic Peptide, ADNF-9, gegen den Alkohol-induzierte Apoptose während der Schwangerschaft in C57BL / 6 Mäuse

Die experimentellen Entwürfe hier vorgeschlagenen konzentrieren sich auf die Untersuchung der Auswirkungen von Alkohol-Exposition in der Apoptose und der Anwendung von neurotrophen Peptid während der Schwangerschaft in der fetalen Gehirns. Eine detaillierte Beschreibung aus der Zucht der Sammlung des fetalen Gehirns beschrieben. Techniken zur Bestimmung der Apoptose auch im Detail beschrieben.

Experimentelle Designs für die Untersuchung der Auswirkungen einer pränatalen Exposition Alkohol während der frühen embryonalen Stadien der fetalen Hirnentwicklung sind anspruchsvoll. Dies ist vor allem auf die Schwierigkeit der Mikrodissektion des fetalen Gehirns und ihre Schnitte zur Bestimmung von apoptotischen Zellen durch pränatale Alkohol verursacht. Die hier beschriebenen Experimente stellen visualisiert Techniken Zucht von Mäusen zur Identifizierung von Zelltod in fötalen Hirngewebe. In dieser Studie wurden C57BL / 6 Mäuse als Tiermodell für die Untersuchung fetalen Alkohol-Exposition und die Rolle der trophischen Peptid gegen Alkohol-induzierte Apoptose. Die Zucht besteht aus einem 2-Stunden-Matten Fenster, um die genaue Stadium der embryonalen Alter zu bestimmen. Eine etablierte fetalen Alkohol-Exposition Modell wurde in dieser Studie verwendet worden, um die Auswirkungen einer pränatalen Exposition Alkohol in fetalen Gehirn zu bestimmen. Dies beinhaltet den freien Zugang zu Alkohol-oder Paar-fed flüssige Ernährung als die einzige Quelle von Nährstoffen für die schwangeren Mäusen.

Zur Untersuchung der Apoptose werden fetale Gehirn zuerst in Gelatine eingebettet mit einer Peel-away-Form, um ihre Schnitte mit einem Vibratom Gerät zu erleichtern. Fetal Gehirn eingebettet und in Paraformaldehyd fixiert sind leicht geschnitten und die frei schwebende Abschnitte in SuperFrost sowie Folien zur Bestimmung der Apoptose oder Zelltod zu montieren.

TUNEL (TdT-vermittelte dUTP Nick End Labeling; TdT: Desoxyribonukleotidyltransferase)-Assay wurde verwendet, um den Zelltod oder Apoptose Zellen zu identifizieren. Es ist bemerkenswert, dass apoptosis und zellvermittelte Zytotoxizität von DNA-Fragmentierung ist. Somit sind die visualisiert TUNEL-positiven Zellen anzeigt, Zelltod oder apoptotischen Zellen.

Die experimentellen Entwürfe hier Informationen über die Verwendung von einem etablierten flüssige Diät für die Untersuchung der Wirkung von Alkohol und die Rolle von neurotrophen Peptide während der Schwangerschaft in der fetalen Gehirns. Dies beinhaltet Zucht und Fütterung schwangeren Mäusen, microdissecting fetale Gehirn und Bestimmen Apoptose. Zusammen könnten diese visuellen und textlichen Techniken eine Quelle für die Untersuchung von pränatalen Exposition von schädlichen Substanzen in der fötalen Gehirn sein.

Das Ziel der experimentellen hier beschriebenen Methoden ist es, die neuroprotektive Wirkung von trophischen Peptide in einer fetalen Alkohol-Exposition Modell mit mehreren Techniken, die Zucht zu beurteilen, Fütterung, microdissecting und Erfassen Zelltod. Arbeiten aus unserem Labor hat eine flüssige Diät mit Alkohol als ein Modell der moderate Alkoholkonsum, die ähnlich einem menschlichen trinken Paradigma in der Bezeichnung der Menge an Alkohol, vielleicht gemischt beteiligt verbraucht ^1-5. Wir und andere haben drei Peptidderivate, die neuroprotektive gegen die schädlichen Wirkungen von fetalen Alkohol Exposition identifiziert. Studien, die Alkohol-Exposition während der embryonalen Stadien anhand von Tiermodellen kann zur Identifizierung von potentiellen Mechanismen der Neuroprotektion führen und damit für die Entwicklung von Interventionsstrategien Verfahren. Dies kann umfassende Informationen über die neuroprotektive Effekte und Abschwächung der schädlichen Auswirkungen von Alkohol während der Schwangerschaft.

Mögliche Prävention der Auswirkungen einer pränatalen Exposition Alkohol kann es sich um die Behandlung von schwangeren Mäusen mit Peptiden, die gezeigt haben, um bei der Neuroprotektion in vitro und in vivo ^{6,7 1,2,4,8,9} einbezogen werden. Unter dieser Peptide wird SALLRSIPA, wie ADNF-9 oder SAL bekannt, von Aktivitäts-abhängigen neurotrophen Faktor (ADNF) ^7,10 abgeleitet. Ein weiteres Peptid mit der Sequenz NAPVSIPQ Peptid bezeichnet NAP von leistungsabhängige neuroprotektive Protein (ADNP) ^6,11 abgeleitet ist, zeigte eine starke schützende Wirkung gegen oxidativen Stress mit Alkoholberührung ^12,13 verbunden. Darüber hinaus haben wir vor kurzem eine neue synthetisierte Peptid, colivelin, die eine wichtige neuroprotektive Rolle in der fetalen Alkohol-Exposition Modell ² zu spielen scheint identifiziert. Colivelin wird von ADNF-9 und AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP) zusammen. Die Bedeutung der Verwendung dieser Peptide ist, dass sie die Fähigkeit haben,überqueren die Blut-Hirn-Schranke, um die Auswirkungen von Alkohol-induzierten Apoptose und Gehirn Wachstum Defizite zu verhindern.

Die experimentellen Methoden C57BL / 6 Mäusen für die Prüfung der neuroprotektive Effekte gegen Alkohol-induzierte Apoptose. Wir haben einen 2-Stunden-Fenster statt über Nacht Zucht angenommen, um genau zu schätzen, die embryonalen Tag 0 (E0), wie es durch den Nachweis eines Spermiums Stecker und Vaginalabstrich ^1-5 enthüllt werden kann. Wir haben eine flüssige Diät mit Magensonden eingesetzt, da dies als kostenlosen Zugang statt Lieferung von Alkohol durch eine Magensonde Route, die Stress schwangeren Mäusen induzieren kann. Auf der anderen Seite kann eine Herausforderung sein Mikrodissektion aufgrund der Weichheit des fötalen Hirngewebe, die auftreten, wenn Sezieren fetale Gehirn in frühen embryonalen Stadien werden könnte. Hier zeigen wir, visualisiert Techniken, um mit all den Herausforderungen, denen Mikrodissektion umzugehen. Da die fötalen Gehirn Schneiden kann auch schwierig sein, haben wir angenommeneine Technik, die die Einbettung der fetalen Gehirn in Gelatine mit Peel-away Einbettschälchen beinhaltet. Wir haben in Schneiden der fetalen Gehirn in frei schwebende Abschnitte bei 50 um Dicke erfolgreich. Dies ermöglicht es uns, alle Änderungen von Inhalten Protein im fötalen Gehirn Abschnitte untersuchen, einschließlich der Identifizierung von Zelltod.

1. Tiere und Zucht Trophic Peptide Behandlung

1. Breed C57BL/mice indem die weiblichen Mäusen (~ 6 Wochen alten, Durchschnittsgewicht 20 g) in männliche Käfige für 2 Stunden.
2. Überprüfen Sie für ein Spermium Stecker und / oder vaginalen Abstrich sofort danach.
3. Wenn positiv, bezeichnen diesen Zeitpunkt wie embryonale Tag 0 (E0).
4. Auf E7, Gewicht-match trächtige Weibchen zu Kontroll-und Behandlungsgruppen (3 Gruppen) zugeordnet sind, wie beschrieben vor kurzem ^4: 1) Alkohol (Ethanol) flüssige Diät-Gruppe (ALC), 2) Paar gefütterte Kontrollgruppe (PF), 3) Peptide Behandlungsgruppe, die intraperitoneale (ip) Injektion von ADNF-9 Peptid neben Alkohol-Exposition flüssige Diät (ALC/ADNF-9) erhalten soll. Die Einzelheiten der Herstellung von ALC und PF Diäten und das Verfahren der ip-Injektionen können bei unseren letzten Arbeiten ⁴ gefunden werden.
5. Messen Sie täglich Alkohol flüssige Nahrung, die den freien Zugang als die einzige Quelle von Nährstoffen versorgt werden kann. PF flüssige Diät Joch individuell to ein ALC Damm kann täglich als auch gemessen werden.
6. Das Volumen der Flüssigkeit Ernährung während der vorangegangenen 24 Stunden verbraucht werden aus aufgezeichnet werden 30-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss und frisch zubereitete Ernährung sollte täglich von E7 bis E13 zur Verfügung gestellt werden.

2. Dissektion der Föten und Mikrodissektion der Fetal Brains

1. Opfern schwangeren Mäusen auf E13 von tief euthanizing die Mäuse mit einem CO _2-Verfahren durch einen Genickbruch folgte.
2. Reinigen Sie die Bauch-Website des Einschnitts mit 70% Ethanol.
3. Machen Sie einen Bauchschnitt mit einer sterilen Schere und Pinzette.
4. Wenn der Bauch offen ist, sezieren die Gebärmutter, indem sie mit einer Pinzette und mit den anderen um die Zange Mesometrium weg von der Gebärmutter reißen. Vergewissern Sie sich, um dieses Verfahren langsam zu tun, um zu vermeiden Durchstechen der Embryonen.
5. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und überführen sie in eine Zellkulturschale (60 mm x 15 mm) mit Hanks 'Balanced Salt Lösung (HBSS) in eiskaltem Wasser.
6. Dissect fetale Gehirn aus den ganzen Embryonen unter Stereomikroskop für die Mikrodissektion.
7. Mit ultra-feinen Pinzette für die Mikrodissektion, ziehen Sie die Haut der Embryonen am oberen Teil des Kopfes, um den Schädel freizulegen.
8. Sobald der Schädel freigelegt und übersichtlich visualisiert unter dem Stereomikroskop Mikrodissektion, dann ziehen Sie die Schädel ab dem hinteren Teil des Gehirns auf das Rückenmark und Hirnstamm Bereichen.
9. Achten Sie darauf, beim Abziehen der Schädel Stück für Stück von hinten nach vorne Teile des Kopfes.
10. Sobald fetale Gehirn visuell ausgesetzt sind, mit dem Extrahieren sie gehen.
11. Präparieren Sie die fötalen Gehirnen von der Basis des Primordium Riechkolben auf der Basis des metencephalon.
12. Postfix alle fetalen Gehirne in 4% Paraformaldehyd für 2-3 Tage seziert. Sie können auch einfrieren anderen fetalen Gehirne von jedem dam, wenn Sie testen sie für Western-Blot-oder enzymatische Assays.

3. Einbetten Fetal Brains in Gelatine für Schnitte

1. Bereiten Sie 10% von Gelatine Klasse A.
2. Füllen Sie eine Peel-away Einbettform halbem Weg und warten, bis die Gelatine erstarrt.
3. Ort-Steuerung und pränatal behandelt fetale Gehirn side-by-side auf der erstarrten Gelatine. Dies ist die konsequente Bedingungen Immunnachweis des Zelltods zwischen den beiden Kontroll-und experimentellen Gruppen zu halten.
4. In flüssigen Gelatine auf der Oberseite des fetalen Gehirns, um eine vollständige Form zu machen (stellen Sie sicher, die Gelatine ist nicht zu heiß).
5. Kühlen Sie die vorbereitete Gelatineform die fetale Gehirn hält für 15 min.
6. Peel offdie Einbettung Formenbau, Kunststoff-und übertragen dann die vorgefertigten Gelatine enthält fetale Gehirn in 4% Paraformaldehyd für zwei Tage.
7. Platz und Abschnitt befestigt fetale Gehirn in Gelatine mit Vibratom Schneiden Maschine (Leica VT 1000S) bei 50 um Dicke für koronale Schnitte. Diese Dicke ist in unseren Studien getestet, weil es besser anatomische Merkmale bietet. Darüber hinaus Dicken von 25 um und höher kann auch mit dieser Technik mit der fetalen Gehirne in 10% Gelatine eingebettet getestet werden. Beachten Sie, dass koronalen Abschnitte geschnitten wurden mit Vibratom an der Basalganglien Eminenz Ebene auf dem Vorderhirn
8. Sammeln der fötalen Gehirn Abschnitte in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
9. Montieren Sie die fetalen Gehirns Abschnitte in Superfrost Plus-Objektträger in Wasser.
10. Trocknen Sie die Teile montiert für 15 min.
11. Legen Sie die Folien (montiert mit den fetalen Gehirns Abschnitte) in PBS für nächsten Tag Prüfung der TUNEL Reaktion.

4. TUNEL Reaktion für DeSchutz von Zelltod oder Apoptose

(TUNEL: TdT-vermittelte dUTP Nick End Labeling; TdT: Desoxyribonukleotidyltransferase). Dieser Test zielt darauf ab, den Zelltod zu bestimmen.

1. Gönnen fetalen Gehirns Abschnitte in Superfrost Plus-Objektträger mit Proteinase K (20 ug / ml) für 5 min bei 37 ° C (300 ul Proteinase K gemischt in 20 ml PBS) montiert. Slides sind in 5-Plend offenen maile montiert).
2. Spülen fetalen Gehirns Abschnitte (montiert in Dias) mit PBS dreimal für 5 min unter Orbital Shaker.
3. Inkubation der Schnitte mit 3% H ₂ O ₂ in Methanol für 10 min bei Raumtemperatur (3 ml 30% H ₂ O ₂ in 27 ml 100% Methanol) (Folien sollten nicht in einem Shaker sein).
4. Spülen Abschnitte mit PBS dreimal 5 min in Schüttler.
5. Inkubieren Abschnitte in Permeabilisierung Lösung (0,1% Triton-100 in 0,1% Natriumcitrat) für 2 min auf Eis (4 ° C) (100 ul TritonX + 0,1 g Natriumcitrat + 99,9 ml destilliertemd Wasser).
6. Spülen Abschnitte in PBS zweimal für 5 min in Schüttler.
7. Dry Gegend um Abschnitte in den Folien.
8. Zeichnen Barriere auf Superfrost Plus-Objektträger mit PAP Pen. Dies zielt darauf ab, jede Austreten von Lösung, die verwendet werden, um die Abschnitte für den Nachweis von TUNEL-positiven Zellen zu behandeln verhindern.
9. Inkubieren der Abschnitte mit TUNEL Reaktionsmischung (50 ul von Flasche 1 und 450 ul aus der Flasche 2) für 1 Stunde bei 37 ° C, wird die Steuerung durch Inkubation in Lösung aus der Flasche 2 verwendet werden.
10. Abspülen mit PBS dreimal 5 min unter Orbit Shaker.
11. Dry Umgebung Gewebe.
12. Inkubieren Abschnitte mit Wandler-POD 30 min bei 37 ° C.
13. Spülen Sie die Abschnitte dreimal 5 min mit Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M).
14. Inkubieren Sie die Schnitte für 7 min in 0,05% 3'-3'-Diaminobenzidin (DAB) und 0,003% H ₂ O ₂ (25 ml Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 ul 3% H ₂ 0 ₂ + 500 ul DAB) Unter Oribtal Schüttler bei 4 ° C (in Eis) und in dunklen (stellen Sie sicher, dieses Verfahren in neue 5-Plend offenen Mailer tun).
15. Spülen Sie die Schnitte mit PBS dreimal 5 min unter Orbital Shaker.
16. Halten Sie die Folien Abschnitte in PBS für nicht mehr als 24 Stunden in PBS, dann verarbeiten sie für Nissl-Färbung, wie im nächsten Abschnitt Protokoll.

Hinweis: DAB ist krebserregend. Verwenden Sie Handschuhe und reinigen Sie alle Gerichte mit dem Bleichmittel einmal fertig mit all den Experimenten verwendet.

5. Nissl Färbung für Herstellung von Fetal Gehirn Bereiche zur mikroskopischen Beobachtung

1. Nissl Färbung Verfahren sollte in einer biologischen Schutzhaube vorgenommen werden.
2. Spülen Sie die Gleitabschnitte mit entionisiertem Wasser für 2 min.
3. Inkubieren der Abschnitte in 70% Ethanol für 2 min.
4. Inkubieren der Abschnitte in 95%-igem Ethanol für 6 min.
5. Inkubieren der Abschnitte in 70% Ethanol für 2 min.
6. Spülen Sie die Abschnitte in deionisiertem water für 2 min.
7. Inkubieren die Abschnitte in Kresylviolett für 3 min Stain.
8. Spülen Sie die Abschnitte in entionisiertem Wasser für 2 min.
9. Inkubieren der Abschnitte in 70% Ethanol für 2 min.
10. Inkubieren Sie die Schnitte in 95% Ethanol + 3 ml Eisessig 3 min.
11. Inkubieren der Abschnitte in 95% Ethanol für 2 min.
12. Inkubieren der Abschnitte in 100% Ethanol für 2 min dreimal.
13. Inkubieren der Abschnitte in Xylol für 10 min dreimal.
14. Slides hält die fetalen Gehirns Abschnitten montiert mit Permount und Deckglas Glasplättchen werden.
15. Lassen Sie das gerahmte Dias über Nacht vor der mikroskopischen Beobachtung und Analysen.
16. Mikroskopische Beobachtung und Aufnahmen können unter Leica aufrechten Mikroskop durchgeführt werden.

Die experimentellen hier beschriebenen Methoden zeigen, dass ein 2-Stunden-Fenster Zucht unerlässlich, um eine genaue Schätzung ist Schwangerschaftsdiabetes Bühne. Wir haben die Zerlegung der Embryonen im Alter von E13 gezeigt. Wir zeigten auch Mikrodissektion des fetalen Gehirns bei E13. Das Verfahren umfasst mehrere Schritte (ac), wie in Abbildung 1 beschrieben. Fetal Gehirne sind von der Basis des Primordium Riechkolben auf der Basis des metencephalon (Abbildung 1) seziert. Fetal Gehirne werden dann in 4% Paraformaldehyd für immunchemischen Nachweis befestigt. Nach dem Fixieren werden fötalen Gehirn in 10% Gelatine eingebettet und für Vibratom Schnittdarstellung wie in Fig. 2 beschrieben. Beachten Sie, dass die Schritt-für-Schritt-Einbettung von fetalen Gehirn bei geringer Vergrößerung durchgeführt wurde. Fetal Gehirn eingebettet werden bei höherer Vergrößerung in Abbildung 1 visualisiert werden. Darüber hinaus kann koronalen fötalen Gehirn Abschnitte auf der Ebene der Ganglien-Vorrang auf dem Vorderhirnunter Verwendung der Vibratom und montiert werden in Folien für immunhistochemische Nachweis. Dies beinhaltet die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen (Abb. 3). Wir zeigen hier, dass pränatale Exposition Alkohol steigt in TUNEL-positiven Zellen in Ganglien Eminenz (3b) im Vergleich zu PF Kontrollgruppe (Abb. 3a) induziert. ADNF-9 Verwaltung erheblich Alkohol-induzierte Zunahme der TUNEL-positiven Zellen (Abbildung 3c und 3d) im Vergleich zu ALC-Gruppe reduziert.

Abbildung 1. Mikrodissektion der fetalen Gehirn bei E13. Stages ac zeigen Schritt-für-Schritt-Verfahren s aus Embryonen zu fetalen Gehirn seziert. A) Dissected Steuerung (PF) und Alkohol (ALC) pränatal Embryonen ausgesetzt. B) Haut abgezogen, um die fetale Gehirn von PF und ALC Gruppen freizulegen. c) Dissected fötalen Gehirnen von PF und ALC-Gruppen.

Abbildung 2. Verfahren zur Einbettung fetalen Gehirn zum Schneiden. Stages (ae) zeigen Schritt-für-Schritt-Anleitungen von der Vorbereitung der Einbettung des fetalen Gehirns auf die Einstellung der Gelatine-Block im Objekt für Vibratom schneiden. A) Peel-away Einbettform gefüllt Hälfte mit Gelatine, b) fötalem Gehirn von PF-Steuerung und ALC-Gruppen sind Seite an Seite in der Form gelegt und mit Gelatine, c) Peel-away Einbettform an vier Seiten; d) fötalem Gehirn eingebettet Gelatine und bereit in Paraformaldehyd fixiert werden; e) gelatin enthaltende Form fetalen Gehirne sind in dem Objekt für Vibratom Schnitte platziert.

Abbildung 3. Effekte von neurotrophen Peptid, ADNF-9, gegen Alkohol-induzierte Apoptose mit TUNEL-Assay in Ganglien Eminenz bei E13 Bühne. Pränatale Alkohol-Exposition steigt in den Zelltod induziert als durch Pfeilspitzen in ALC-Gruppe (b) im Vergleich zum PF-Gruppe (a) angegeben. ADNF-9 Verwaltung neben pränatalen Exposition Alkohol zeigte sich eine Abnahme in TUNEL-positiven Zellen (c). Statistische Analysen zeigten, dass ADNF-9 Verwaltung Alkohol-induzierten Anstieg der TUNEL-positiven Zellen (d) verhindert. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. * P <0,05; ** p <0,01 (Newman-Keul die Post-hoc-Test). N = 4 für jede Gruppe. Maßstab bar = 100 um. Nachdruck aus der Veröffentlichung (4), mit freundlicher Genehmigung von Elsevier (Lizenz # 2904310752995).

Die Methodik und die Technologie in dieser Studie dargestellt sind, zeigen die Auswirkungen der pränatalen Exposition gegenüber Alkohol im fetalen Gehirn und die Rolle der trophischen Peptide bei der Prävention dieser Effekte. Diese können Informationen darüber, wie zu anderen Drogen oder andere giftige Chemikalien in der fötalen Gehirn während der verschiedenen Stadien der Schwangerschaft zu untersuchen.

In Bezug auf die Zucht Paradigma, in einigen Fällen ist die Erfassung der Spermien Stecker kann nicht beobachtet werden. An diesem Punkt ist es wichtig, die Vaginalabstrich in einer Folie unter mikroskopischer Beobachtung zu testen, das die nötige möglich Spermien positive Detektion.

Es wird in dieser Studie festgestellt, dass die Fütterung freien Zugang von flüssigen Ernährung mit PF-Steuerung und Alkohol beinhaltet. Mindestens 30% Feuchtigkeit und einer Temperatur von nicht mehr als 22-24 ° C sind erforderlich, um die Qualität der Ernährung während der 24-Stunden freien Zugang zu der Diät ^1,2 überwachen. Es ist auch erforderlich, dass dieErnährung täglich frisch zubereitet werden. Die Magensonden sollte nach jedem Gebrauch gereinigt werden.

Es gibt Schwierigkeiten bei der Mikrodissektion des fetalen Gehirns. Diese sind abhängig von der embryonalen Phase getestet abhängen. Beispielsweise kann fötalen Gehirn im Alter von E13 seziert schwierig sein, mit im Vergleich zu fötalem Gehirn bei E18 seziert umzugehen. Dies liegt in der Tatsache, dass bei E18, die fetale Gehirn gut entwickelt sind und der Schädel wird einfach abziehen Vergleich zu E13, wenn der Schädel noch weich und schwer zu ziehen aus. An diesem Punkt, wenn Sezieren fetalen Gehirn bei E13, ist es wichtig, ziehen Sie den Schädel Stück-für-Stück wie in dem Video mit diesem Manuskript geliefert demonstriert.

In Bezug auf die Einbettung fetale Gehirn in Gelatine, fanden wir, dass dies die beste Technik, um Abschnitte, die bereit sind, für immunhistochemische Analyse verwendet werden sollen erhalten ist. Zur besseren Schneiden des fötalen Gehirn haben, ist es wichtig, dass die Fixierung in 4% Paraformaldehyd desGelatine Block mit fetalen Gehirns abgeschlossen ist. So kann dies mindestens zwei Tage, und die Gelatine Block vielleicht bereit sein, für das Schneiden am dritten Tag. Die Dicke der Abschnitte ist auch ein Faktor, 50 um Dicke ist in der Regel für immunchemischen Nachweis, wie ^1,2,4 TUNEL-Assay getestet. Allerdings Dicken von 25 um und höher kann auch getestet werden.

Keine Angaben gemacht werden.

Dieses Forschungsprojekt wurde von Verleihungsnummer R21AA017735 (YS) aus der National Institutes für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung des Autors und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute on Alkoholmissbrauch und Alkoholismus oder der National Institutes of Health. Der Autor möchte auch Charisse Montgomery für die Bearbeitung des Manuskripts danken.