Métodos experimentales para probar los efectos del péptido neurotrófico, ADNF-9, contra la apoptosis inducida por el alcohol durante el embarazo en C57BL / 6 ratones

Los diseños experimentales que aquí se proponen centrarse en el estudio de los efectos de la exposición al alcohol en la apoptosis y la aplicación de péptido neurotrófico durante el embarazo en el cerebro fetal. Se describe una descripción detallada de la cría a la colección de cerebros fetales. Las técnicas para la determinación de la apoptosis también se describen en detalle.

Diseños experimentales para la investigación de los efectos de la exposición prenatal al alcohol durante las etapas embrionarias tempranas en el desarrollo del cerebro fetal son desafiantes. Esto es debido a la dificultad de microdisección de los cerebros fetales y su corte por secciones Para la determinación de las células apoptóticas causadas por la exposición prenatal al alcohol en su mayoría. Los experimentos descritos aquí proporcionar técnicas visualizados a partir de ratones de cría para la identificación de la muerte celular en el tejido cerebral fetal. Este estudio utilizó ratones C57BL / 6 como el modelo animal para el estudio de la exposición al alcohol fetal y el papel de péptido trófico contra la apoptosis inducida por el alcohol. La cría se compone de una ventana de la estera de 2 horas para determinar el grado exacto de la edad embrionaria. Un modelo de la exposición al alcohol fetal establecido se ha utilizado en este estudio para determinar los efectos de la exposición prenatal al alcohol en el cerebro del feto. Esto implica el libre acceso a las dietas líquidas alcohol o par-alimentados como única fuente de nutrientes para los ratones embarazadas.

Para investigar la apoptosis, los cerebros fetales están integrados por primera vez en la gelatina con un desprendimiento del molde para facilitar su seccionamiento con un aparato vibratome. Cerebros fetales incrustados y fijados en paraformaldehído son fácilmente seccionada, y las secciones flotantes libres pueden ser montados en portaobjetos Superfrost Plus para la determinación de la apoptosis o muerte celular.

TUNEL (TdT-mediada por dUTP nick fin de etiquetado; TdT: desoxinucleotidil transferasa terminal) de ensayo ha sido utilizado para identificar la muerte celular o apoptosis. Es de destacar que apoptosis y la citotoxicidad mediada por células se caracterizan por la fragmentación del ADN. Por lo tanto, las células TUNEL-positivas visualizados son indicativos de la muerte celular o apoptosis.

Los diseños experimentales aquí proporcionan información sobre el uso de una dieta líquida establecido para el estudio de los efectos del alcohol y el papel de los péptidos neurotróficos durante el embarazo en los cerebros fetales. Se trata de la cría y la alimentación de los ratones embarazadas, microdissecting cerebros fetales, y la determinación de la apoptosis. En conjunto, estas técnicas visuales y de texto pueden ser una fuente para la investigación de la exposición prenatal de agentes nocivos en el cerebro del feto.

El objetivo de los métodos experimentales descritos aquí es para evaluar los efectos neuroprotectores de los péptidos tróficos en un modelo de exposición de alcoholismo fetal utilizando varias técnicas que incluyen la cría, alimentación, microdissecting, y la detección de la muerte celular. El trabajo de nuestro laboratorio ha supuesto una dieta líquida mezclada con alcohol como un modelo de consumo moderado de alcohol, que puede ser similar a un paradigma de consumo humano en términos de la cantidad de alcohol consumida ^1-5. Nosotros y otros han identificado tres derivados de péptidos que son neuroprotector frente a los efectos nocivos de la exposición fetal al alcohol. Estudios de investigación de la exposición al alcohol durante las etapas embrionarias en modelos animales pueden conducir a la identificación de los posibles mecanismos de neuroprotección y permitir el desarrollo de los procedimientos de intervención. Esto puede proporcionar una información amplia sobre los efectos neuroprotectores y de atenuación de los efectos nocivos de la exposición al alcohol durante el embarazo.

Posible prevención de los efectos de la exposición prenatal al alcohol puede implicar el tratamiento de ratones hembra embarazadas con péptidos que han demostrado estar involucrados en la neuroprotección in vitro e in vivo ^{6,7 1,2,4,8,9.} Entre estos péptidos, SALLRSIPA, conocido como ADNF-9 o SAL, se deriva de la actividad dependiente de factor neurotrófico (ADNF) ^7,10. Otro péptido con la secuencia de péptido NAPVSIPQ, denominado NAP, deriva de la proteína dependiente de la actividad neuroprotectora (ADNP) ^6,11, demostrado un potente efecto protector contra el estrés oxidativo asociado con la exposición al alcohol ^12,13. Además, recientemente hemos identificado un nuevo péptido sintetizado, colivelin que parece desempeñar un papel clave neuroprotector en el modelo de exposición fetal al alcohol ^2. Colivelin se compone de ADNF-9 y AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). La importancia de la utilización de estos péptidos es que tienen la capacidad decruzar la barrera sangre-cerebro para prevenir los efectos de la apoptosis inducida por el alcohol y el déficit de crecimiento del cerebro.

Los métodos experimentales utilizaron ratones C57BL / 6 para probar los efectos neuroprotectores contra la apoptosis inducida por el alcohol. Hemos adoptado una ventana en lugar de cría durante la noche de 2 horas con el fin de calcular con exactitud el día embrionario 0 (E0), ya que puede ser revelado por la detección de un tapón de esperma y una citología vaginal ^1-5. Hemos utilizado una dieta líquida con tubos de alimentación, ya que se considera libre acceso en lugar de la entrega de alcohol por vía sonda, que puede inducir estrés ratonas preñadas. Por otro lado, microdisección puede ser un reto debido a la suavidad del tejido cerebral fetal, que se podría encontrar cuando la disección de los cerebros fetales en las etapas embrionarias tempranas. Aquí, mostramos las técnicas visualizados para hacer frente a todos los desafíos que implican microdisección. Además, como el seccionamiento del cerebro fetal también puede ser un reto, hemos adoptadouna técnica que consiste en incrustar el cerebro del feto en gelatina con desprendimiento incrustar moldes. Hemos tenido éxito en la reducción de los cerebros fetales en las secciones flotantes a 50 m de espesor. Esto nos permite investigar cualquier alteración del contenido de proteínas en las secciones del cerebro fetal, incluida la determinación de la muerte celular.

1. Los animales de cría y trófico Tratamiento Peptide

1. Raza C57BL/mice mediante la colocación de los ratones hembra (~ 6 semanas de edad, peso promedio 20 g) en jaulas de origen macho durante 2 horas.
2. Compruebe si hay un tapón de esperma y / o citología vaginal inmediatamente después.
3. Si es positivo, designar este punto en el tiempo como el día embrionario 0 (E0).
4. El E7, peso coincidir las mujeres embarazadas a los grupos de control y tratamiento (3 grupos) se asignan como se ha descrito recientemente ^4: 1) Alcohol (etanol) grupo de dieta líquida (ALC), 2) par-alimentados grupo control (PF), 3) Péptido grupo de tratamiento, que debe recibir una inyección intraperitoneal (ip) de péptido del ADNF-9 junto con el alcohol dieta líquida exposición (ALC/ADNF-9). Los detalles de la preparación de ALC y las dietas PF y el procedimiento de inyecciones ip se pueden encontrar en nuestra reciente trabajo ^4.
5. Mida diario dieta líquida alcohol que se puede proporcionar el acceso libre como la única fuente de nutrientes. Dieta líquida PF yugo individualmente to una presa de ALC se puede medir todos los días también.
6. El volumen de la dieta de líquidos consumidos durante las 24 horas anteriores puede ser grabado desde graduada de 30 ml tubos con tapa de rosca y la dieta recién preparada debe proporcionar todos los días de E7 a E13.

2. La disección de fetos y Microdisección de cerebros fetales

1. Sacrificar los ratones embarazadas en E13 profundamente por la eutanasia a los ratones con un procedimiento de CO ₂ seguido de una dislocación cervical.
2. Limpie la zona abdominal de la incisión con etanol al 70%.
3. Hacer una incisión abdominal con tijeras y pinzas estériles.
4. Una vez que el abdomen está abierto, diseccionar el útero sujetándolo con una pinza y el uso de las otras pinzas para romper el mesometrio fuera del útero. Asegúrese de hacer este procedimiento lentamente para evitar la punción de los embriones.
5. Eliminar los embriones del útero y transferirlos a una placa de cultivo celular (60 mm x 15 mm) que contiene solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) en agua helada.
6. Disecar cerebros fetales de todo los embriones bajo microscopio estereoscópico para microdisección.
7. Con unas pinzas ultrafinas de microdisección, salga de la piel de los embriones en la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.
8. Una vez que el cráneo y se expone claramente visualizó bajo el microscopio estereoscópico microdisección, a continuación, desprenderse el cráneo a partir de la parte posterior del cerebro en la zonas del tronco cerebral y la médula espinal.
9. Asegúrese de quitar el pedazo del cráneo por pieza de posterior a partes anteriores de la cabeza.
10. Una vez que los cerebros fetales están expuestos visualmente, proceder a su extracción.
11. Diseccionar los cerebros fetales a partir de la base del bulbo olfatorio primordio a la base de la metencéfalo.
12. Postfix todo diseca cerebros fetales en paraformaldehído al 4% durante 2-3 días. También se puede congelar otros cerebros fetales de cada presa si se está probando para la transferencia de Western o ensayos enzimáticos.

3. Incorporación de cerebros fetales en gelatina de seccionamiento

1. Preparar 10% de gelatina de grado A.
2. Llenar un molde desprendible incrustar hasta la mitad y espere hasta solidificación de gelatina.
3. Lugar de control y fetal cerebros de lado a lado prenatalmente tratada en la parte superior de la gelatina solidificada. Esto es para mantener condiciones constantes de inmunodetección de muerte celular entre el control y los grupos experimentales.
4. Añadir la gelatina líquida en la parte superior de los cerebros fetales para hacer un molde completo (asegúrese de que la gelatina no es demasiado caliente).
5. Refrigerar el molde de gelatina preparada que contiene cerebros fetales durante 15 min.
6. Despegarel plástico molde de inclusión y luego transferir los cerebros fetales que contienen gelatina pre-hechos en paraformaldehído al 4% durante dos días.
7. Lugar y sección fija cerebros fetales de gelatina que usa la máquina de seccionamiento vibratome (Leica VT 1000S) a 50 m de espesor de seccionamiento coronal. Este espesor se prueba en nuestros estudios, ya que proporciona mejores características anatómicas. Además, los espesores de 25 micras y superior también se puede probar con esta técnica que implica incrustada de cerebros fetales en 10% de gelatina. Tenga en cuenta que las secciones coronal se cortaron utilizando vibratome a nivel eminencia ganglios basales del cerebro anterior
8. Recoger las secciones cerebrales fetales en tamponada con fosfato solución salina (PBS).
9. Monte las secciones del cerebro del feto en Superfrost Plus diapositivas en el agua.
10. Secar las secciones montadas de 15 min.
11. Colocar los portaobjetos (montados con las secciones cerebrales fetales) en PBS para el próximo día de pruebas de reacción TUNEL.

4. TUNEL reacción de Deprotección de la muerte celular o apoptosis

(TUNEL: TDT mediada por dUTP nick fin de etiquetado; TDT: desoxinucleotidiltransferasa terminal). Este ensayo está dirigido para determinar la muerte celular.

1. Tratar a las secciones del cerebro fetales montados en portaobjetos Superfrost Plus con proteinasa K (20 mg / ml) durante 5 min a 37 ° C (300 l de proteinasa K mixta en 20 ml de PBS). Las diapositivas se reunieron en 5 plend abierto Maile).
2. Enjuague secciones cerebrales fetales (montadas en diapositivas) con PBS tres veces durante 5 min bajo agitador orbital.
3. Incubar las secciones con 3% de H ₂ O ₂ en metanol durante 10 min a temperatura ambiente (3 ml de 30% de H ₂ O ₂ en 27 ml de metanol al 100%) (diapositivas no deben estar en un agitador).
4. Enjuague secciones con PBS tres veces durante 5 minutos en un agitador orbital.
5. Incubar las secciones en solución de permeabilización (0,1% Triton X-100 en 0,1% de citrato de sodio) durante 2 min en hielo (4 ° C) (100 l Triton X + 0,1 g de citrato de sodio + 99,9 ml destiladaagua d).
6. Enjuague secciones en PBS dos veces durante 5 minutos en un agitador orbital.
7. Seque el área alrededor de las secciones en las diapositivas.
8. Dibuja barrera en Superfrost Plus diapositivas utilizando PAP Pen. Esto está dirigido a evitar cualquier fuga de la solución que se utiliza para el tratamiento de las secciones para la detección de células TUNEL-positivas.
9. Se incuban las secciones con mezcla de reacción TUNEL (50 l de la botella 1 y 450 de la botella de 2 l) durante 1 hora a 37 ° C, el control va a ser utilizado por la incubación en solución de la botella 2.
10. Enjuagar con PBS tres veces 5 min bajo Orbit agitador.
11. Seque el área alrededor del tejido.
12. Incubar las secciones con el convertidor-POD durante 30 min a 37 ° C.
13. Enjuague las secciones tres veces durante 5 min con Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M).
14. Incubar las secciones 7 min en 0,05% tetrahidrocloruro 3'-3'-diaminobencidina (DAB) y 0,003% de H ₂ O ₂ (25 ml Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 l 3% de H ₂ 0 ₂ 500 + DAB l) Bajo Oribtal agitador a 4 ° C (en hielo) y en la oscuridad (asegúrese de hacer este procedimiento en la nueva 5 plend abierto mailer).
15. Enjuague las secciones con PBS tres veces 5 min bajo agitador orbital.
16. Mantenga las secciones de diapositivas en PBS durante no más de 24 horas en PBS, y luego procesarlos para la tinción de Nissl como se detalla en la siguiente sección de protocolo.

Nota: DAB es un carcinógeno. Use guantes y limpiar todos los platos usados ​​con el cloro, una vez terminado con todos los experimentos.

5. Tinción Nissl para la preparación de las secciones del cerebro del feto para la observación microscópica

1. Procedimiento de tinción de Nissl se debe hacer en una campana de seguridad biológica.
2. Enjuague las secciones de deslizamiento con agua desionizada durante 2 min.
3. Incubar las secciones en etanol al 70% durante 2 min.
4. Incubar las secciones en etanol al 95% durante 6 min.
5. Incubar las secciones en etanol al 70% durante 2 min.
6. Enjuague las secciones desionizada water durante 2 min.
7. Incubar las secciones de cresil violeta Mancha durante 3 min.
8. Enjuague las secciones en agua desionizada durante 2 min.
9. Incubar las secciones en etanol al 70% durante 2 min.
10. Incubar las secciones en etanol al 95% + 3 ml de ácido acético glacial durante 3 min.
11. Incubar las secciones en etanol al 95% durante 2 min.
12. Incubar las secciones en etanol al 100% durante 2 min tres veces.
13. Incubar las secciones en xileno durante 10 minutos tres veces.
14. Diapositivas que sostienen las secciones del cerebro del feto se puede montar utilizando Permount y cubierta de láminas de vidrio deslizantes.
15. Deja el montaje se desliza durante la noche antes de la observación y análisis microscópico.
16. Observación microscópica y fotomicrografías pueden realizarse bajo Leica microscopio vertical.

Los métodos experimentales descritos aquí muestran que una ventana de reproducción 2-hr es esencial para estimar la edad gestacional exacta. Hemos demostrado la disección de los embriones a la edad de E13. Se demostró además microdisección de cerebros fetales E13. El procedimiento implica varias etapas (ac), como se describe en la Figura 1. Cerebros fetales se disecan a partir de la base del bulbo olfatorio primordio a la base de la metencéfalo (Figura 1). Cerebros fetales se fijaron a continuación en paraformaldehído al 4% para la detección inmunoquímica. Después de la fijación, los cerebros fetales están incrustadas en 10% de gelatina y se prepararon para vibratome seccionamiento como se describe en la Figura 2. Tenga en cuenta que paso a paso incrustación de cerebros fetales se realizó a baja magnificación. Cerebros fetales incrustados se pueden visualizar a mayor aumento en la Figura 1. Por otra parte, secciones coronales de cerebro fetal en el nivel de la eminencia ganglionar en el cerebro anterior puedeser obtenido usando el vibratome y montados en portaobjetos para la detección inmunohistoquímica. Esto implica que el número de células TUNEL positivas (Figura 3). Hemos demostrado que la exposición prenatal al alcohol aumenta en las células TUNEL-positivas en eminencia ganglionar (Figura 3b) inducida en comparación con el grupo control PF (Figura 3a). Administración ADNF-9 reduce significativamente aumento inducido por el alcohol en las células TUNEL-positivas (Figura 3c y 3d) comparado con el grupo ALC.

Figura 1. Microdissection de cerebros fetales E13. Etapas ac muestran paso a paso el procedimiento s de los embriones a los cerebros fetales disecados. A) el control disecado (PF) y el alcohol (ALC) expuestos prenatalmente embriones. B) piel pelada para exponer el cerebro fetal de la PF y los grupos de ALC. c) los cerebros de fetos disecados de PF y los grupos de ALC.

Figura 2. Método para la incrustación de los cerebros fetales para seccionar. Etapas (ae) procedimientos muestran paso a paso de la preparación de la incrustación de los cerebros fetales para el ajuste del bloque de gelatina en el objeto para el corte vibratomo. A) de desprendimiento de molde incrustación de llenado hasta la mitad con la gelatina, b) los cerebros fetales de control de PF y grupos ALC se colocan de lado a lado en el molde y se cubren con gelatina, c) de desprendimiento del molde incrustar cortado en cuatro lados; d) cerebros fetales incrustados en gelatina y listo a fijarse en paraformaldehído; e) GEmolde latino que contiene el cerebro del feto se coloca en el objeto para vibratome seccionamiento.

Figura 3. Efectos de péptido neurotrófico, ADNF-9, contra la apoptosis inducida por el alcohol usando el ensayo de TUNEL en eminencia ganglionar en la etapa E13. Exposición prenatal al alcohol indujeron aumentos en la muerte celular como se indica por puntas de flecha en el grupo ALC (b) en comparación con el grupo PF (a). ADNF-9 junto con la administración de la exposición prenatal al alcohol mostró una disminución en las células TUNEL positivas (c). Los análisis estadísticos demostraron que la administración del ADNF-9 impedido aumentos inducidos por el alcohol en células TUNEL positivas (d). Los valores se expresan como media ± SEM. * P <0,05; ** p <0,01 (prueba post hoc de Newman-Keul). N = 4 para cada grupo. Barra de escala = 100 micras. Reproducido de la publicación (4), con el permiso de ElSevier (licencia # 2904310752995).

La metodología y tecnología presentada en este estudio demuestran los efectos de la exposición prenatal al alcohol en los cerebros fetales y el papel de los péptidos tróficos en la prevención de estos efectos. Estos pueden proporcionar información sobre la forma de estudiar otras drogas de abuso u otros productos químicos tóxicos en el cerebro del feto durante las diferentes etapas del embarazo.

En lo que respecta a la paradigma de cría, en algunos casos podría no ser observable la detección de la clavija de esperma. En este punto, es importante para poner a prueba el frotis vaginal en un portaobjetos bajo observación microscópica, que puede proporcionar un posible espermatozoides detección positiva.

Se afirma en este estudio que la alimentación implica el libre acceso de dieta líquida que contiene el control de PF y el alcohol. Al menos el 30% de humedad y una temperatura no superior a 22-24 ° C se requieren para controlar la calidad de la dieta durante el acceso gratuito las 24 horas al ^1,2 dieta. También se requiere que eldieta prepararse fresca diariamente. Los tubos de alimentación deben ser limpiados después de cada uso.

Existen dificultades para microdisección de cerebros fetales. Estas dependen de la etapa embrionaria probado. Por ejemplo, los cerebros fetales disecados a la edad de E13 pueden ser difíciles de tratar en comparación con los cerebros fetales disecados en E18. Esto es debido en el hecho de que en el E18, el cerebro del feto están bien desarrollados y el cráneo se vuelve fácil de lograr en comparación con el E13, cuando el cráneo es todavía blando y difícil de lograr. En este punto, cuando la disección de los cerebros fetales E13, es importante sacar el cráneo pieza por pieza como se muestra en el vídeo suministrado con este manuscrito.

En lo que respecta a la incrustación cerebros fetales en gelatina, se encontró que esta es la mejor técnica para obtener secciones que están listos para ser utilizados para el análisis inmunohistoquímico. Con el fin de tener un mejor corte del cerebro fetal, es importante que la fijación en paraformaldehído al 4% de labloque de gelatina que contiene cerebros fetales es completa. Por lo tanto, esto puede llevar al menos dos días, y el bloque de gelatina podría estar listo para el corte por el tercer día. El grosor de las secciones es también un factor; 50 m de espesor por lo general se ensayó para la detección inmunoquímica, tales como ensayo de TUNEL ^1,2,4. Sin embargo, grosores de 25 micras y superior también puede ser probado.

No hay revelaciones que se hicieron.

Este proyecto de investigación fue apoyada por el premio número R21AA017735 (YS) de los Institutos Nacional de Abuso de Alcohol y Alcoholismo. El contenido es de exclusiva responsabilidad del autor y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo o los Institutos Nacionales de Salud. El autor también desea agradecer a Charisse Montgomery para la edición de este manuscrito.