מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להעריך את הכמות ואת ההתפלגות של שקיעת ברזל במוח של מודל עכבר אלצהיימר. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בעכברים טרנסגניים בני שמונה חודשים 5xFAD כמודל עכבר AD והשווינו אותם לעכברים מסוג בר באותו גיל. אנו כוללים פרטים על נהלים להכנת המגיב הכימי, חתך המוח, ביצוע צביעת Perls/DAB וניתוח התמונות המתקבלות.
הרדמו את העכבר כראוי ובדקו את עומק ההרדמה ומשככי הכאבים. חשפו את ליבו, ואז חתכו את האטריום הימני. הזריק 20 מיליליטר PBS ו-4% PFA מהחדר השמאלי ברצף.
שימו לב שיש להקפיד על רעידות קיבוע. ערפו את ראשו של העכבר וחלצו את מוחו. לאחר מכן, קבעו את המוח ב-4% PFA למשך 12 עד 24 שעות.
טבלו את המוח בסוכרוז של 15% ו-30% למשך 12 עד 24 שעות. חותכים את המוח באופן סגיטלי מהאמצע ומשתמשים באחד מהחצאים לחיתוך. הרכיבו את המוח על הכפתור, שימו טבעת נייר כסף סביב המוח, והוסיפו לתוכה OCT כדי להטמיע את המוח.
הגדר את עובי החלקים והטמפרטורה של קריוסטט. לאחר מכן, חתכו את המוח. אם החלקים מתקפלים, השתמש במברשות רכות כדי לפרוש את החלקים.
אוספים כל קטע לשקופיות בעזרת PBS, ואז מסירים את הבועות בקטע. בחר שקופית עם רקמת מוח שלמה והנח אותה בקופסת צביעה מפלסטיק מלאה ב-PBS. מקם את הקופסה על שייקר סיבובי המוגדר למהירות איטית למשך חמש דקות כדי לשטוף היטב את שאריות תרכובת ה-OCT.
הכינו 20 מיליליטר של 2% אשלגן פרוציאניד ונפח שווה של 2% חומצה הידרוכלורית. לאחר מכן, מערבבים אותם בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. אבטח את השקופית בצינור באמצעות מלקחיים ודגרה את התערובת באמבט מים שחומם מראש ל -60 צלזיוס למשך 30 דקות.
שטפו את השקופית עם PBS ונגבו עודפי נוזלים באמצעות נייר טישו. הנח את המגלשה שטוחה על ספסל המעבדה ואפילו מרח תמיסת DAB על הרקמה באמצעות פיפטה. יש לדגור למשך 10 דקות כדי לשפר את צביעת Perls.
הסר את תמיסת ה-DAB המוגזמת ושטוף את הטישו על ידי שטיפה שלוש פעמים עם PBS. יש לייבש את החלק ברצף בתמיסות אלכוהול מדורגות וקסילן למשך שלוש דקות כל אחת. מכסים את החלקים במסטיק ניטרלי ובהחלקת כיסוי.
לאחר מכן, הניחו להם להתייבש במכסה אדים. הפעל את המיקרוסקופ. כוונן את הבהירות של מקור האור.
התמקדו בחלק המוח תחת יעד הגדלה פי 4. העבר את שלב המיקרוסקופ כדי להתמקד באזורים עם אותות צביעה גבוהים של Perls/DAB, במיוחד ההיפוקמפוס וקליפת המוח. וללכוד תמונות.
פתח את תמונת המטרה בהגדלה של 10 ולאחר מכן המר את פורמט התמונה לגווני אפור של 8 סיביות. הערכים האפורים של התמונה הומרו לערכי OD, ולאחר מכן נעשה שימוש בפונקציית הסף כדי לכסות את האזורים החיוביים לצביעה של Perls/DAB. בחר את אפשרויות ההגדרה הבאות והכי חשוב, בחר הגבל לסף כדי לא לכלול רעשי רקע.
לבסוף, בחר מדידות כדי לקבל תוצאות לניתוח סטטיסטי. כדי לחקור את ההתפלגות וההצטברות של ברזל במודל של עכבר AD, ביצענו צביעת Perls/DAB של מקטעי מוח סגיטליים. אותות Perls/DAB גבוהים נצפו בהיפוקמפוס ובקליפת המוח, במיוחד בתת-ההיפוקמפוס של עכברי 5xFAD, בעוד שמוחות של עכברים מסוג בר של חודשיים ושמונה חודשים הראו אות חלש יותר.
מתחת להגדלה של 40 פלוס, האות בעכברי 5xFAD מופיע במבנים דמויי רובד A-beta, בהתאם למחקרים קודמים. תוצאות אלו מדגימות את היעילות של עמידת Perls/DAB כטכניקה היסטוכימית לזיהוי ברזל. אנו מראים גם שני מקרים של צביעה כושלת.
כיסוי מוגזם או התייבשות לא מתאימה יגרמו למקרים אלה. צביעת Perls/DAB מספקת אות חזק יותר וניגודיות רקע טובה יותר מאשר צביעת Perls קונבנציונלית, מה שהופך את זיהוי הברזל לרגיש ומדויק יותר. בנוסף, הוא מזהה את הברזל הברזלי בקומפלקסים של חלבונים הקשורים באופן רופף.
ברזל שקשור חזק, כמו בהמוגלובין, לא יגיב. זה מפחית מאוד אותות לא רצויים הנגרמים על ידי ברזל בתאי הדם האדומים ובהמוגלובין. בסך הכל, צביעת Perls/DAB מתאימה לניסויים בבעלי חיים ולחקירות פתולוגיות הדורשות ספציפיות ורגישות מדיאלית.
הוא מספק לחוקרים שיטה לדמיין ולכמת הצטברות ברזל על חשבון פחות זמן ועלות.
