שיטת מעבדה אובייקטיבית המוצגת כאן עשויה לסייע בחקר תגובת רגישות יתר במגע בעכברים, המחקה דרמטיטיס מגע אלרגי בבני אדם. תגובת רגישות היתר במגע יכולה להימדד לא רק על ידי בצקת אוזניים, אלא גם על ידי בדיקות מעבדה שונות המאפשרות לחקור מנגנונים תאיים המעורבים בתגובה זו. מודל רגישות היתר במגע יכול לבדוק גורמים שונים וסביבתיים וחומרים חדשים כדי להראות אם גורמים שנבדקו מווסתים תגובות חיסוניות תלויות תאי T, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ליישם טיפולים חדשים.
התחל בגילוח עור העכבר עם סכין גילוח ותיוג הכפה. שש שעות לפני השראת רגישות יתר למגע, או CHS, יש למרוח סבון אפור עם מים ולגלח שטח של שני סנטימטרים רבועים על החזה והבטן של העכבר. באותו יום, רגיש את העכברים על ידי מריחת 150 מיקרוליטר של 5% hapten מוכן טרי על המקום שגולח בעבר.
בעכבר הבקרה, החל רק את הרכב. יבשו את נקודת ההפטן למשך 30 שניות לפני שתחזירו את בעל החיים לכלוב. ביום הרביעי, מדדו את עובי האוזן של עכבר מורדם באמצעות מיקרומטר בשעה אפס על ידי צופה שאינו מודע לקבוצות הניסוי.
לאחר מכן, יש למרוח 10 מיקרוליטר של 04% הפטן טרי משני צידי האוזניים בקבוצות בדיקה וביקורת ולאפשר לו להתייבש במשך 30 שניות. ביום החמישי, 24 שעות לאחר היישום הקודם של 0.4% hapten, חזור על מדידת עובי האוזן עבור המדידה של 24 שעות. 24 שעות לאחר מדידת עובי האוזן, כאשר העכבר עדיין בהרדמה עמוקה, חתכו את האוזניים קרוב ככל האפשר לגולגולת באמצעות מספריים.
בצד הדיסטלי של האוזניים, בצע ניקוב בקוטר שישה מילימטר באמצעות ניקוב ביופסיה. למדוד את המשקל של כל ביופסיית אוזן על האיזון האנליטי, ולבטא אותו במיליגרם. עבור myeloperoxidase, או MPO, assay, לשים את ביופסיות האוזן בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר עם חרוזי נירוסטה ולהוסיף 500 מיקרוליטר של חיץ מוכן.
הומוגניזציה של הביופסיות במשך 10 דקות בהומוגנייזר ולאחר מכן קירור הדגימה למשך 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס לפני הומוגניזציה שלה שוב למשך 10 דקות. מוציאים את החרוזים ברגע שהביופסיות הומוגניות. מקפיאים את ההומוגנטים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
מפשירים ומערבלים את הדגימות, וחוזרים על הליך ההומוגניזציה וההקפאה שלוש פעמים. לאחר שנעשה, צנטריפוגה הומוגנט ב 3, 000 G במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. קצרו את הסופרנאטנט עם פיפטה כדי למדוד את פעילות ה-MPO, ובטאו אותה ביחידות לחלבון של מיליגרם אחד.
כדי לבצע בדיקת חדירות כלי דם, יש לחוש עכברים ביום האפס, וביום הרביעי, לאתגר ישירות על ידי מריחת הפטן על האוזניים באמצעות ההליך שהוזכר לעיל. 23 שעות לאחר מכן, הזריקו תוך ורידי 8.3 מיקרוליטר לגרם משקל גוף של 1% צבע כחול אוונס במי מלח חוצצים פוספט של דולבקו, או DPBS, לעכבר המורדם. לאחר שעה, שוב להרדים את העכבר כדי לאסוף את ביופסיות האוזן, כפי שתואר קודם לכן.
כדי לחלץ את הצבע מהרקמה, יש לדגור על הביופסיות בצינורות המכילים מיליליטר אחד של פורממיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני למשך 18 שעות. לאחר איסוף ביופסיות אוזניים, כאשר העכבר עדיין תחת הרדמה עמוקה, להסיר את גלגל העין עם פינצטה. הפעילו לחץ עדין על העכבר ואספו דם מהסינוס הרטרו-אורביטלי לתוך הצינור לאיסוף הסרום.
הפוך את הצינור שש פעמים והמתן 30 דקות עד שהדם יקרש. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב 1, 300 ל 2, 000 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. רגיש את העכברים התורמים עם TNCB hapten ביום אפס באמצעות ההליך שהוזכר לעיל ביום הרביעי, לאחר חיטוי העור, בודד את בלוטות הלימפה בבית השחי ובמפשעה, או ALNs, מהעכבר המרדים באמצעות מלקחיים, ולאחר מכן בודד את הטחול.
מועכים את הרקמה בין הקצוות החלביים של שתי שקופיות מיקרוסקופ ומעבירים את תרחיף התא דרך מסננת תאים בגודל נקבוביות של 70 מיקרומטר. לאחר מכן, שטפו את התאים עם DPBS בתוספת סרום בקר עוברי 1% וצנטריפוגו אותם ב 300 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. דקנו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא הנותרת באחד עד חמישה מיליליטר של DPBS.
הכינו תערובת של 1:1 של ALN וטחול כדי להשיג ריכוז של עד 7.0 כפול 10 לתאים השביעיים ב -200 מיקרוליטר של DBPS לפני הזרקה תוך ורידית של תערובת של תאי אפקט CHS בעכבר מורדם. מדדו את עובי האוזן בשעה אפס ולאחר 24 שעות של האתגר. הנתונים הראו כי עכברים שהיו רגישים ל-TNCB ואותגרו באוזניים ארבעה ימים לאחר מכן פיתחו נפיחות מוגברת משמעותית באוזניים, בהשוואה לעכברי ביקורת שסבלו מרגישות דמה ולאחר מכן אותגרו באופן דומה.
העלייה בבצקת אוזניים בקבוצת הבדיקה הביאה לעלייה במשקל האוזן, פעילות MPO, ריכוז אינטרפרון גמא בתמציות האוזן, שינויים בדרמיס בצקתי בבדיקה ההיסטולוגית וחדירות כלי הדם באוזן נוגדני IgG1 ספציפיים ל-TNP היו גבוהים בסרה של עכברי הבדיקה בהשוואה לחיות הביקורת. בעלי החיים שקיבלו את תאי אפקט CHS מתורמים שהיו רגישים בעבר ל- TNCB הראו נפיחות אוזניים מוגברת באופן משמעותי, בהשוואה לבעלי חיים שלא קיבלו את התאים. הרגע הקריטי ביותר הוא לעורר רגישות יתר למגע.
פתרון Hapten הוא נדיף מאוד ורגיש לאור, ולכן זה חייב להיות מיושם במהירות על העור של בעלי החיים. ניתן לבצע בדיקות נוספות על תאי האפקט המבודדים. לדוגמה, תרביות תאים ניתן להקים כדי להעריך את היכולת להתרבות בנוכחות אנטיגנים.
