הפרוטוקול שלנו סיפק שיטה אפשרית לתצפית על קטע הסינכרון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, שיכול היה להבטיח דיוק בתצפית על סיבי העצב. פרוטוקול ניקוי רקמות פשוט וקל הוא יתרון עיקרי של טכניקה זו. תהליך ניקוי הרקמות יעיל ולוקח כ-30 דקות עד שעה.
ביצוע זלזול בחולדה המתת חסדת כפי שצוין בכתב היד של הטקסט. השתמשו באזמל כדי להסיר את עור הגב והסוליה מהכף האחורית. עבור דגימות הדורשות חתך קפוא, לאחר לתקן את הרקמות ב 4% מ aldehyde ב 0.1 טוחנת PB במשך שעתיים.
לאחר הכביסה, הטמיעו את רקמות העור ב-2% אגרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והניחו אותן בתוך קופסת הקרח לקירור. קבעו את הרקמה המותקנת על המיקרוטון הרוטט במי קרח ופורסים אותם בעובי של 500 מיקרומטר בכיוון הרוחבי. לאחר החיתוך, הסר את האגרוז מהקטעים ואחסן אותם בצלחת שש באר עם 1x PBS.
הדגירה של חלקי הרקמה בתמיסה של 2% טריטון X-100 ב-1x PBS למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. מכניסים את חלקי הרקמה למאגר החוסם ומסובבים ב-72 סיבובים לדקה על השייקר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. העבר את חלקי הרקמה לתוך התמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של נוגדן אנטי-CGRP חד-שבטי של עכברים ונוגדן רב-שבטי נגד LYVE-1 של כבשים במאגר דילול בצינור המיקרו צנטריפוגה.
לאחר מכן סובבו על השייקר במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את חלקי הרקמות פעמיים עם חיץ כביסה בטמפרטורת החדר, ואז השאירו אותם על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במאגר הכביסה. למחרת, מעבירים את חלקי הרקמה לתמיסה המעורבת המכילה את הנוגדנים המשניים בצינור מיקרו צנטריפוגה ומסובבים ב-72 סיבובים לדקה על השייקר במשך חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס.
שטפו את חלקי הרקמות בצלחת של שש בארות עם חיץ כביסה פעמיים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שמור את חלקי הרקמות במאגר שטיפה על השייקר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את חלקי הרקמה לריאגנט ניקוי הרקמה ומסובבים ב-60 סיבובים בדקה על השייקר בעדינות למשך שעה בטמפרטורת החדר.
להרכיב את הרקמות השקופות על המגלשה ואז להקיף את הרקמות עם ספייסר ולהדביק את הפער עם מגיב ניקוי רקמות טריות והחלקת כיסוי. התבנית התלת-ממדית הראתה כי סיבי העצב החיוביים של CGRP עברו דרך הרקמה התת עורית והדרמיס לאפידרמיס. סיבי עצב אלה רצו בצרורות ברקמה התת עורית שהסתעפו בתוך הדרמיס והסתיימו באפידרמיס.
לעומת זאת, פאלואידין בכלי דם חיוביים וכלי הלימפה החיוביים של LYVE-1 מופצים ברקמה התת עורית ובדרמיס. בדרך כלל סיבי העצב החיוביים של CGRP פעלו במקביל או הקיפו את כלי הדם וכלי הלימפה ויצרו רשת תלת-ממדית בעור השעיר והזוהר. עם הגישה הקונבנציונלית, למרות שכלי הדם של סיבי העצב וכלי הלימפה סומנו בבירור עם CGRP phalloidin ו- LYVE-1 בחלקים הדקים, התצפית על מבנים אלה הייתה מוגבלת על ידי עובי הפרוסה ולא ניתן לצפות בה לחלוטין.
בקטע בעובי של 30 מיקרומטרים, לא היה הבדל בין עור שעיר לעור גלברוס באזור הפנים של סיבי עצב חיוביים של CGRP. בקטעי הרקמות העבים של 300 מיקרומטר, בהשוואה לעור שעיר, שטח הפנים של סיבי עצב חיוביים CGRP של עור גלברוס הוגדל באופן משמעותי. חשוב להשתמש במאגר הניקוי בלחץ אוסמוטי גבוה לאחר דגירה של נוגדנים.
מספר פעמים, יש צורך בזמן הניקוי הנדרש לצביעת אימונואורסצנציה. בעקבות הליך זה, אנו מאמינים שקיימת גם אפשרות של צביעה ותצפית של רקמות ואיברים אחרים בשישה חלקים. טכניקה זו עשויה לסייע לחוקרי מדעי המוח לפגוש את שטח הפנים ואת מצב הסיבים העצביים.
זה גם עוזר לנו להתבונן בחדשנות של רקמות ואיברים.
