The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.

כל העכברים נשמרו וטופלו על פי חוק צער בעלי החיים השוויצרי ובהתאם לתקנות של משרד הקנטון הווטרינרית, ציריך. 1. הכנת Dissection חומר, תרבות מדיה, המכשירים microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים החיטוי מיקרו לנתיחה ומספריים (121 מעלות צלזיוס, זמן עיקור: 20 דקות) ולאחסן אותם במכל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר coverslips זכוכית (24 מ&quot;מ x 24 מ&quot;מ) על ידי דוגריהם ב 1 M HCl למשך 24 שעות על שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף אותם שלוש פעמים עם סטרילי H, מזוקק 2 O ושלוש פעמים עם אתנול 99%. יבש ולאחר מכן את coverslips על 37 מעלות צלזיוס או מתחת למכסת מנוע לזרום סטרילי. לבסוף, החיטוי או לחשוף את coverslips לאור UV (30 דקות) כדי להשלים את העיקור. אז יכול להיות מאוחסן בcoverslips 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את התקני בידוד AXIS אקסון מהחבילה באמצעות מלקחיים סטרילית ומניח אותם בצלחת פטרי סטרילי. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אגרוף ביופסית סטרילי (o: 1 מ&quot;מ) ליצור חור אחד לדגימה ללהיות מתורבת (איור 1) בהתכתבות של תאי התרבות. הערה: אל אגרוף קרוב מדי לmicrogrooves, כפי שהם עלולים להיפגע על ידי הלחץ המופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכשירי בידוד AXIS אקסון ידי immerging באתנול 70%. יבשים אז התקני AXIS אקסון בידוד וcoverslips תחת מכסה המנוע זרימת סטרילי לגמרי. חכה מינימום של 3 שעות לפני שתמשיך. הערה: ייבוש חלקי תגרום הרכבה לקויה של מכשירי microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל coverslip לתוך צלחת פטרי 35 מ&quot;מ או לתוך באר בתוך צלחת 6 בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מכשיר בידוד AXIS אקסון על coverslip ולחץ בעדינות אך בתקיפות עם מלקחיים עם קצוות מקופלים על מנת לאפשר הדבקה מלאה בין מכשיר הבידוד וcoverslip הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל חדר תרבות, פיפטה 150 μl של פולי-D ליזין (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל בסטריליים, מזוקקת H 2O). הנח את מכשירי microfluidic תחת ואקום במשך 5 דקות, כדי להסיר את כל האוויר מתאי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אוויר עדיין ניתן לראות בתוך התאים, מחדש פיפטה פתרון poly-D- ליזין לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המכשירים עם O פולי-D ליזין / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלושה זמן עם סטרילי H, מזוקק 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא תאים עם 150 פתרון μl laminin עובד (סיגמא אולדריץ, 5 מיקרוגרם / מיליליטר, ב PBS או בינוני סרום ללא), ודגירת O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של מדיום לתרבויות גרעיני trigeminal 37, מורכב כדלקמן: 48 מיליליטר Neurobasal בינוני, 1 מיליליטר B-27, 100 U / פניצילין / סטרפטומיצין, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 5 ng / גורם גדילה עצבית מיליליטר מיליליטר (NGF) , Arabinoside ציטוזין 12:25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של מדיום לתרבויות נבט שן 37, מורכב כדלקמן: 40 מיליליטר DMEM-F12, בסרום שור עוברי 10 מיליליטר (FBS ריכוז, סופי: 20%), 100 U / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 150 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית. </li></ol> דור העובר 2. עכבר וDissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע גיל עוברי על פי התוספת נרתיק (תוסף נרתיק: יום עוברי של התפתחות 0.5, E0.5) ולאשר אותה באמצעות קריטריונים מורפולוגיים. לפרוטוקול זה, אנחנו בדרך כלל להשתמש בעוברי עכברי E14.5-E17.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את האזור לנתיחה וstereoscope עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את האמא בהריון באמצעות נקע בצוואר הרחם. לחסום את הצוואר של העכבר עם האצבע הראשונה ושנייה על גבי רשת, ולמשוך עם החלטת הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העור סביב הבטן התחתונה, ולפתוח את הבטן באמצעות מספריים. אתר את הרחם: בשלבים מאוחר כל כך של הריון, הרחם למלא את חלל הבטן בשפע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הרחם ומקום בצינור מלא PBS על קרח. כאשר על קרח, הרקמות ניתן להשאיר לכמה שעות. מחק את הגופה של האם על פי הנחיות מוסדיות </li> &lt;li&gt; לנתח את העוברים מהרחם ולשחרר אותם מרקמות extraembryonic. מניחים את העוברים בPBS על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העוברים באמצעות מספריים, ולהפריד את הלסת התחתונה משאר הראש באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה (איור 2 א). הסר בדיוק הלסת התחתונה, מבלי לפגוע בגרעינים המשולש; כהאחרונים מקומיים בסמיכות ללסת התחתונה, הנזק המקרי שלהם הוא אפשרי. לשמר את הלסת תחתונה ושאר הראש בקור PBS, על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח TG, לקחת את הראש ומניח אותו על גבי צלחת פטרי זכוכית לנתיחה, מילאה בעבר עם PBS הקר. שימוש במלקחיים, להסיר את העור ואת הגולגולת. הסר אז telencephalon והמוח הקטן על ידי הצבת מלקחיים מתחת לtelencephalon והמעלית; telencephalon והמוח הקטן תהיה להעיף ביחד, משאירים את החלק התחתון של הגולגולת החשופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את הגרעינים המשולש (שמוצגים באיור 2 ב). השתמש במלקחייםלהפריד את TG מהעצבים המשולש. לחסל את השאריות של תחזיות trigeminal באמצעות המחטים לנתיחה כסכינים. מניחים את TG גזור בצלחת פטרי מלאה PBS הקר ולשמור אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שיניים עובריות, למקם את הלסת התחתונה, נפרדה בעבר מהגולגולת, על צלחת פטרי זכוכית לנתיחה, מלאה PBS הקר. שימוש במחטים לנתיחה כסכינים, להסיר את הלשון והעור שמסביב הלסת. הפרד את השמאל וחם-לסתות תקין על ידי חיתוך לאורך קו האמצע של הלסת. חיידקי השן בקלות לעין, כפי שמוצגים באיור 1 ג. לבודד את חיידקי השן באמצעות מחטים לנתיחה ולהסיר את העודפים של רקמות שאינן שיניים. מניחים את חיידקי שן גזור בצלחת פטרי מלאה PBS הקר ולשמור אותם על קרח. </li></ol> 3. Microfluidic שיתוף תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נתיחה, להסיר laminin ממכשירי microfluidic. מלא את התאים עם 200 μl של respectiיש תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, להעביר בעדינות את חיידקי TG ושן גזורים לתוך החורים שנוצרו על ידי ניקוב (1D איור). ודא שחיידקי השן לא יצופו ושהם שוקעים עד שקשר עם coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות דגימות חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מדיום התרבות כל שעה 48. לא לרוקן את התאים לחלוטין, ולא פיפטה ישירות לתאי התרבות. התרוקנות מלאה של תאים יגרמו להיווצרות של בועות אוויר בתוך התאים; pipetting הישיר לתוך התא יגרום לניזק axonal. כדי למנוע בעיות אלה, להסיר את המדיום מצביע פיפטה לכיוון הצד החיצוני של הבארות; באופן דומה, פיפטה בינונית הטרי בצד של הבארות ממוקמות מול לתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת התרבות, ניתן הדמיה שיתוף תרבויות בקלות על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות. שיתוף תרבויות יכולות להישמר במשך 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר Perio התרבותד, לשטוף את התאים על ידי pipetting 150 μl של PBS לתוך היטב אחד לכל תא, ומאפשר לי PBS לזרום דרך התאים שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ולתקן את הדגימות על ידי pipetting 150 μl של paraformaldehyde 4% (PBS) ובאחד לתא; לדגור על RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם PBS כמתואר ב3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בניתוח נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells.">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).</li><li>Katayama, Y., Battista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+sympathetic+nervous+system+regulate+hematopoietic+stem+cell+egress+from+bone+marrow.">Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow.</a> Cell. 124 (2), 407-421 (2006).</li><li>Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis.">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).</li><li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. a., Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).</li><li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li><li>Oakley, B., Witt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+sensory+receptors+on+the+tongue.">Building sensory receptors on the tongue.</a> Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).</li><li>Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+mouse+vallate+gustatory+epithelium+and+taste+buds+requires+BDNF-dependent+taste+neurons.+Brain+research.">The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research.</a> Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).</li><li>Sun, H., Oakley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anterior+gustatory+epithelia+in+the+palate+and+tongue+requires+epidermal+growth+factor+receptor.">Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor.</a> Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).</li><li>Mistretta, C. M., Goosens, K. a., Farinas, I., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+size,+number,+and+morphology+of+gustatory+papillae+and+taste+buds+in+BDNF+null+mutant+mice+demonstrate+neural+dependence+of+developing+taste+organs.">Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs.</a> The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).</li><li>Mitsiadis, T. a., Graf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+during+tooth+development+and+regeneration.">Cell fate determination during tooth development and regeneration.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).</li><li>Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histological+study+of+the+innervation+of+developing+mouse+teeth.">A histological study of the innervation of developing mouse teeth.</a> Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).</li><li>Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+nerve+fibres+during+development+of+embryonic+rat+molar+using+peripherin+and+protein+gene+product+9.5+antibodies.">Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies.</a> Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).</li><li>Johnsen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+teeth:+qualitative,+quantitative,+and+developmental+assessment.">Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment.</a> Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).</li><li>Mitsiadis, T. a., Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+nerve+growth+factor+(NGF)+and+NGF+receptor+(NGF-R)+in+the+developing+first+molar+tooth+of+the+rat.">Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat.</a> Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).</li><li>Mitsiadis, T. a., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+in+odontogenesis.">Neurotrophins in odontogenesis.</a> The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).</li><li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kettunen, P., L&#248;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+trigeminal+axon+navigation+and+patterning+with+tooth+organ+formation:+epithelial-mesenchymal+interactions+and+epithelial+Wnt4+and+Tgfbeta1+regulate+semaphorin+3a+expression+in+the+dental+mesenchyme.">Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme.</a> Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).</li><li>Tuisku, F., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+neural+influence+on+tooth+germ+generation+in+a+polyphyodont+species.">Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species.</a> Developmental biology. 165, 1-9 (1994).</li><li>Zhao, H., Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+rudimentary+diastema+tooth+primordia+are+devoid+of+peripheral+nerve+fibers.">Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers.</a> Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).</li><li>Lumsend, A., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+timing+and+topography+of+early+tooth+development+in+the+mouse+embryo.">An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo.</a> Archives of oral biology. , 301-311 (1986).</li><li>Kollar, E., Lumsend, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+tooth+morphogenesis+and+neuronal+development+through+tissue+interactions:+lessons+from+mouse+models.">Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models.</a> Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Lumsend, A., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323 (9), 538-539 (1986).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).</li><li>Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Nogo-A+regulates+neurite+fasciculation,+branching+and+extension+in+the+developing+nervous+system.">Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system.</a> Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).</li><li>Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odontogenesis.">Odontogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 887, (2012).</li><li>Mitsiadis, T. a., Drouin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Pitx1+genomic+locus+affects+mandibular+tooth+morphogenesis+and+expression+of+the+Barx1+and+Tbx1+genes.">Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes.</a> Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll/interleukin-1+receptor+domain-containing+adapter+inducing+interferon-&#946;+mediates+microglial+phagocytosis+of+degenerating+axons.">Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-&#946; mediates microglial phagocytosis of degenerating axons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).</li><li>Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+on+microfluidics:+multimodal+analysis+for+studying+celll-cell+interaction.">Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction.</a> Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).</li><li>Neto, E., Alves, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+neurons+and+osteoblasts:+close+partners+in+a+microfluidic+environment.">Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment.</a> Integrative Biology. , (2014).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#233;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li><li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maxillary+factor,+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons.">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

קודם בניסויים במבחנה של עצבוב שן היו מבוסס על שיתוף תרבויות קונבנציונליות של הגרעינים המשולש ורקמות או תאים 26,28,29 שיניים. מחקרים אלה נערכו לחקור בעיקר את ההשפעות אטרקטיביות של תאים או רקמות אלה באקסונים חושיים 38. למרות שמביא התקדמות משמעותית בתחום, כמה בעיות טכניות הועלו. חיידקי שן מתחילים להידרדר לאחר כמה ימים של תרבות 37. בהתבסס על תצפיות אלה, תאי עצב ושיניים גדלו באותם תנאי התרבות לפגוע בכל ניתוח סופי של מולקולות מעורבות בשיחת ההכלאה בין שתי רקמות אלה. יש צורך בתנאים אופטימליים תרבות לשמר את הפרופיל המולקולרי הפיזיולוגי של הגרעינים המשולש ורקמות שיניים. מערכות מיקרופלואידיקה שימשו עד כה לשיתוף תרבות תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת מותאמת 34,36. מערכת מיקרופלואידיקה זה יכול לייצג יותר אמונהבאופן מלא את מצב in vivo, שבו גופי תא עצביים, מסופי axonal ורקמות יעד בדרך כלל חשופים למייקרו-סביבות תאיות והמולקולריים שונים. לאחרונה, מכשירי מיקרופלואידיקה שימשו לשיתוף תרבות גרעיני שורש הגבי כל וosteoblasts 36. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים ושיני trigeminal מסוגלים לשרוד במשך תקופות ארוכות של זמן שבו שיתוף תרבותית במכשירי microfluidic 37. יתר על כן, הראינו כי שיניים משלבי התפתחות שונים לשמור במבחנה בתנאים אלה את אותו האפקט דוחה או מושך על עצבוב המשולש שהם הציגו בvivo 37. הפרוטוקול המתואר דורש תרגול ומיומנות ידנית, בפרט לmicrodissection של חיידקי הגרעינים ושן המשולש. גרעיני trigeminal נקרעים בקלות במהלך הנתיחה. לכן, אנו ממליצים על השימוש במחטים לנתיחה במקום כוח לנתיחהנ.ב., על מנת להסיר את הרקמה המקיפה את הגרעינים. כמו כן, יש לנקוט משנה זהירה בזמן לנתח חיידקי שן, כדי למנוע נזק לאפיתל השן תוך הפרדתו מרקמות mesenchymal שמסביב. יתר על כן, ביום הראשון של התרבות המשותפת, טיפול בפרט יש לנקוט בטיפול בחממה, כמו רטט מוגזם יכול לפגוע בהידבקות גנגליון trigeminal לcoverslip התרבות. במהלך תקופת שיתוף התרבות, תקשורת יש להסיר והוסיפה על ידי pipetting לתוך הבארות, בצד הנגדי לתאי התרבות. תקשורת שאפתן או pipetting בקרבתם של תאי התרבות תגרום נזק axonal. הפרוטוקול המתואר יכול להיות שונה כדי ללמוד את העצבוב של כמה איברים עובריים ורקמות עובריות או לאחר לידה וסוגי תאים. מערכות מיקרופלואידיקה יכולות לייצג פלטפורמה מתאימה כדי לאפשר תקופות ארוכות יותר תרבות לחקר יחסי גומלין בין תאי עצב וטי גדלה. יתר על כן, הפרדה העצבית מתא השיניים מאפשרת ניתוח של ההשפעות של לוקליזציה חלבון ספציפית וכימות 33,37. נוגדני חסימה או חלבונים רקומביננטי גם ניתן להוסיף לתאים נפרדים של מכשירי מיקרופלואידיקה לניתוח ההשפעות שלהם על רקמות עצביות ובשיניים. לדוגמא, טיפול בגרעינים המשולש עם NGF תומכים ההישרדות שלהם ומאפשר לי תולדה עצבית. עם זאת, באקסוגניים עבודה זו NGF נעדר מהתא נבט שן, שבו אותות שמקורם בשן הם אחראים רק למשיכה או דחייה עצבית. כמו כן, ניתן להשתמש במולקולות, נוגדני רקומביננטי אחרים או תרופות כדי לתפעל את המערכת בתנאים מבוקרים. המגבלות העיקריות של הפרוטוקול מוצג מתגוררות בעלות היחסית הגבוהה של מכשירים מסחריים microfluidic ו- 2D להגדיר בעצם את מערכת שיתוף התרבות. למעשה, למרות שתרבות כל איברים יכולים להיותד, שני איברים והאקסונים לגדול בתנאי תרבות 2D-חסיד על coverslip זכוכית; התאמה אישית של המערכת תהיה צורך על מנת לקבל ייצוג tridimensional, מציאותי של עצבוב. לסיכום, מכשירי microfluidic הם אופטימליים לחקירת תפקידו של העצבוב בפיתוח או התחדשות איברים ולאפשר המחקר של אינטראקציות בין רקמות עצביות והיעד בתנאים אופטימליים תרבות.

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות 1,2. יתר על כן, עצבוב מעורב בוויסות של התפשטות תאי גזע, גיוס ובידול 3-5. ואכן, מחקרים שנעשה לאחרונה הבינו ברקמות של המתחם orofacial הראו כי עצבים הפאראסימפתטית נחוצים לתפקוד תאי אפיתל בפיתוח וההתחדשות של בלוטות הרוק 6,7. באופן דומה, זה כבר הוכיח כי העצבוב הוא הכרחי לפיתוח והתחזוקה של בלוטות טעם 8-11. לפיכך, חשוב לנתח את התפקידים עדיין המוזנחים של עצבוב בפיתוח איברים אחרים חשובים orofacial ורקמות כגון שיניים. למרות העצבוב העשיר של שיניים למבוגרים, וזאת בניגוד לכל איברים ורקמות האחרים בגוף, develoשיני פינג מתחילות להיות מעוצבבים בשלבי הלידה המוקדמים. שיניים להתפתח כתוצאה מאינטראקציות רציפות והדדית בין האאקטודרם האוראלי וmesenchyme נגזר רכס העצבי גולגולתי. אינטראקציות אלה להצמיח ameloblasts נגזר אפיתל וodontoblasts נגזר mesenchyme שאחראי להיווצרות של אמייל והדנטין, בהתאמה 12. עצבים תחושתיים מהגרעינים המשולש ועצבים סימפטיים מגרעיני צוואר רחם מעולים מעצבבים את השיניים למבוגרים 13-15. במהלך עובר, סיבי עצב הנובעים מפרויקט הגרעינים המשולש כלפי חיידקי שן פיתוח ומקיפים אותם בהדרגה, אבל הם לא לחדור לתוך mesenchyme papilla השיניים 13. סיבי עצב להיכנס mesenchyme עיסת השיניים בשלבי התפתחות מתקדמים יותר המתואמים עם בידול odontoblast ומטריצת דנטין תצהיר 16. עצבוב עיסת שיניים הוא completed זמן קצר לאחר בקיעת השן בחלל הפה 13. מחקרים קודמים גילו כי semaphorins וneurotrophins השונים מעורבים בוויסות של עצבוב בodontogenesis 16-19. המחקרים קודמים הראו כי באופן ברור עצבוב הוא תנאי הכרחי להיווצרות שן בדגים 20. מחקרים מאוחרים יותר הראו שהומאוסטזיס של תאי גזע mesenchyme שיניים בשיניים חותכות עכבר מוסדר על ידי עצבים תחושתיים באמצעות הפרשה של קיפוד הקולי (ששש) 21. עם זאת, התפקיד של עצבוב בשן ייזום, פיתוח והתחדשות הוא עדיין שנוי במחלוקת ביונקים 22-24. שפע של מחקרי in vivo סיפק מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים 13,25,26. עם זאת, רוב אלה approכאבים אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות. שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת 26-29. במקביל, שיתוף culturing כפוף להתאמות טכניות שונות. לדוגמא, עצבים ורקמות ספציפיות שיניים (לדוגמא, עיסת שיניים, זקיק שיניים, השיניים אפיתל) לעתים קרובות דורש תקשורת ותרבות שונה על מנת להבטיח את הישרדות רקמה לפרקי זמן ארוך 30 - 32. בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים) כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתי 27-29.עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation, וללמוד את הדינמיקה של סיבי עצב הסתעפות בתוך אברי מטרה. לכן, שיתוף תרבויות בלתי רציפה תהיה יותר מתאימות לביצוע מחקרים על אינטראקציות רקמות עצביות-שיניים. מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. במכשירים אלה, רקמות ותאי עצב שיניים מופרדות בתאים שונים, תוך מתן אפשרות לצמיחה של אקסונים מהגופים התא העצביים דרך microchannels כלפי התא המכיל רקמות היעד שלהם 33. מכשירי microfluidic כבר נעשו שימוש כדי ללמוד את יחסי הגומלין בין תאי עצב והמיקרוגלים 34,35, כמו גם תא לתא אינטראקציות בסרטן וneovascularization 35. יתר על כן, מערכות אלה היו בשימוש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין Dorsגרעיני אל שורש וosteoblasts 36. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופות זמן ארוכות כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic 37. יתר על כן, יש לנו הראינו ששיניים משלבי התפתחות שונים לשמור במבחנה בתנאים אלה את אותו האפקט דוחה או מושך על עצבוב המשולש שהם מראים בvivo 37. פרוטוקול זה מספק מידע על דרך פשוטה, חזקה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על כגון אינטראקציות בסביבה מבוקרת ומבודדת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AXIS Axon Isolation Devices</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AX15010-TC</td>
			<td>Microchannels of different lenght are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse beta-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1156-NG-100</td>
			<td>Human and Rat beta-NGF (R&#38;D Systems) are equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות. עם זאת, מנגנוני תופעות אלה אינם מובנים היטב עדיין. בפרט, התפקיד של עצבוב בהתפתחות שן והתחדשות מוזנח. כמה מחקרים בvivo סיפקו מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים. עם זאת, רוב הגישות אלה אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות. שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת. בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים)כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתיים. עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation. מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופה ארוכה של זמן, כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic, וכי הם שומרים בתנאים אלה את אותו דפוס העצבוב שהם מראים בvivo. על בסיס זה, אנו מתארים כיצד לבודד ושיתוף התרבות מתפתחת חיידקי הגרעינים ושן המשולש בפרוטוקול system.This שיתוף תרבות microfluidic מתארת ​​בצורה פשוטה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על אינטראקציות כאלה בcontrolled וסביבה מבודדת.

תוצאות אלו מראות כי הגרעינים המשולש מבודדים יכולים לגדול בתא אחד של מכשיר microfluidic ו, בנוסף, כי הפיתוח של חיידקי שן הבודדים מתמשך לתקופה ארוכה של זמן בתא האחר של מכשיר microfluidic. תקשורת והתרבות שונה משמשות בשני תאים, וmicrogrooves בין שני התאים לאפשר הרחבה של האקסון מגנגליון trigeminal כלפי חיידקי שן המתפתחות. איור 3 מייצגת הדמיה של neurofilament באמצעות immunofluorescence 37, בשיתוף תרבות של עכבר הגנגליון עוברי המשולש וחותך עכבר עוברי במערכת שיתוף התרבות microfluidic שתוארה. חותכות עכבר אינן מעוצבבים במהלך פיתוח in vivo;. באופן עקבי, האקסונים מגנגליון trigeminal בטלים על ידי חיידק השן מתפתח בתרבות לככל 10 ימי איור 3 א מציג סקירה של חדר axonal בזה<html> מערכת שיתוף תרבות. איור 3 ומופע 3C הגדלה הדרגתית של neurites בתוך התאים axonal ומייקרו-המטעים. חיידקי שן (או כל שיתוף תרבויות איברים או רקמות) ניתן להסיר בקלות ממכשירי microfluidic ונותחו בנפרד למשל, מעובד לstainings היסטולוגית או לניתוח ביטוי גנים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig1.jpg" /> איור 1. צפיות של מכשיר שיתוף התרבות microfluidic רכוב () מלמעלה; . (ב) לרוחב באופן חלקי תאי התרבות (סמ&quot;ק) מודגשים באדום (eosin) וכחול (toluidine כחול); microgrooves (מ&quot;ג) ניתן לראות כקו לבן בין תאי התרבות. הגרעינים ושיתוף תרבותי איברים / רקמות ממוקמים לתוך תא התרבות המתאים באמצעות החורים המנוקבים (pH) במכשיר. מדיה מתווספות והוציאה דרך הבארות (MW).<html> יעד &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig2.jpg" /> איור 2. תצוגה לרוחב של ראש עובר עכבר (יום עוברי של E14.5 פיתוח) (). הקו השחור מציין היכן הלסת התחתונה יש לחתוך כדי לשמור על שלמות של שני חיידקי הגרעינים ושן המשולש. ראש (ב) עכבר עובר (E14.5) לאחר הסרת נמוכה לסת, גולגולת וtelencephalon. חיצים שחורים מצביעים הגרעינים המשולש (TG). (ג) לסת תחתונה של עובר עכבר (E14.5) לאחר ההסרה של הלשון. חיצים שחורים מצביעים על הלוקליזציה של חיידקי השן השונים (Inc: חותכת; FM: טוחנות הראשונות). ייצוג סכמטי של מכשיר שיתוף התרבות microfluidic (ד &#39;).p_upload / 53,114 53114fig3large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig3.jpg" /> איור 3. משותף תרבות של גנגליון trigeminal ונבט שן חותכת מעוברי עכברי E15.5 wild-type. סקירה (א) לתא axonal (neurofilament, DAPI). בר סולם: 300 מיקרומטר. (ב) הגדלה גבוהה של microgrooves וneurites גדל לתוך תא axonal (neurofilament, DAPI; סופרפוזיציה של תמונות ניאון וbrightfield). בר סולם: 150 מיקרומטר. (ג) הגדלה גבוהה המציגה את הצמיחה של האקסונים בmicrogrooves (neurofilament). בר סולם:. 75 מיקרומטר <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53114/53114fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices at JoVE.com

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Views.  University of Zurich. Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Video: Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

הערכה תפקודית ומורפולוגי של סרעפת עצבוב על ידי סרעפת מנוע נוירונים

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

ברזולוציה גבוהה אמצעי הדמיה של נוירונים על ידי שימוש של זריחה החרגה שיטה והתקנים Microfluidic ייעודי

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

רכישת נתונים וניתוח בברטומטריה תגובה מעורר בעכברים

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.