הפרוטוקול המוצג מאפשר לכמת מגוון רחב של שומנים ברקמת בעלי חיים. זהו כלי קל לחקר מנגנוני שומנים וגם לזיהוי סמנים ביולוגיים המעידים על רעילות מוקדמת במודלים של בעלי חיים. השיטה מספקת פרופיל כמותי של יותר מ-400 ליפידים מולקולריים ב-14 סוגי שומנים שונים במגוון רחב של מטריצות מדגם עם זמן מגמה של 10 דקות לדגימה.
כדי להתחיל, לדלל צנטריפוגה aliquot 1 supernatant כפול ריכוז עם מאגר אמוניום ביקרבונט. לאחר הכנת העקומה הסטנדרטית של אלבומין בסרום בקר, מערבלים את הצינורות הסטנדרטיים וצנטריפוגות את הצינורות ב 18, 200 גרם למשך 15 שניות בטמפרטורת החדר. מהצינורות הסטנדרטיים שהוכנו קודם לכן, העבירו 6 מיקרוליטר כל אחד מהריק, התקנים והדגימות לצלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות.
לאחר מכן, להוסיף 250 מיקרוליטר של מגיב ברדפורד לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית לערבב. לאחר הדגירה במשך 5 דקות, מדדו את הבליעה באורך גל של 595 ננומטר באמצעות קורא לוחות. הכינו צינורות של 2 מיליליטר עם 100 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט לכל צינור של הריק הריק והפנימי הריק והפנימי ושמרו את כל הדגימות על קרח.
הכינו דגימות בקרת איכות, בהתחשב בכך שדגימת בקרת איכות אחת ממוקמת בין כל קבוצה של 10 דגימות. הוסף 10 מיקרוליטר של פלזמה אנושית מאוגמת לצינורות 2 מיליליטר, ולאחר מכן הקפיץ 10 מיקרוליטר של תמיסה סטנדרטית פנימית לכל דגימות התקן הפנימי הריק, בקרת האיכות והמחקר. מוסיפים 300 מיקרוליטר של תערובת מתנול בוטנול מינוס 20 מעלות צלזיוס לכל דגימה ומנערים ב-450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על תרמומיקסר.
לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרוליטר של תערובת הפטן אתיל אצטט ולנער ב 450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על thermomixer, ולאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של 1% תערובת חומצה סגפנית ולנער במשך 5 דקות ב 450 גרם בטמפרטורת החדר על thermomixer. צנטריפוגה ב 2, 800 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר 360 מיקרוליטר של השלב העליון לצינור נעילה עצמית חדש 2 מיליליטר מסומן כמו 2. לאחר הוספת 320 מיקרוליטר של הפטן אתיל אצטט לצינור פאזת המים המסומן כ -1, נער ב 450 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על התרמומיקסר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 2, 800 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כפי שהודגם קודם לכן.
מעבירים 320 מיקרוליטר של השלב העליון ומשלבים אותם עם החלק מהצעד הקודם בצינור 2. באופן דומה, הוסף 250 מיקרוליטר של הפטן אתיל אצטט לשלב המים בצינור 1 ונער ב 450 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על התרמיקוסר. שוב, צנטריפוגה ב 2, 800 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להעביר 200 מיקרוליטר של השלב העליון ולשלב אותו עם שברים מן השלבים הקודמים צינור 2.
התאדו ליובש ב-35 מעלות צלזיוס ברכז ואקום והתמוססו מחדש ב-300 מיקרוליטר של תמיסת תערובת טרשת נפוצה. מערבול כל צינור במשך 5 שניות כדי להבטיח שהכל מומס וצנטריפוגה ב 18, 200 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים אליציטוט של 50 מיקרוליטר לצלחת המיקרוליטר לניתוח מצב יינון חיובי ומדללים עם 50 מיקרוליטר של תמיסת תערובת טרשת נפוצה.
שוב, לדלל עם 80 מיקרוליטר של תערובת MS ולהעביר aliquot של 20 מיקרוליטר לתוך צלחת MTP עבור ניתוח מצב יינון שלילי. עוטפים את הצלחת בנייר כסף ושומרים על 4 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. כיול טרשת נפוצה הן במצב חיובי והן במצב שלילי בהתאם להוראות היצרן 5 ימים או פחות לפני הניתוח.
התקן את מקור ננו העירוי הישיר מראש, וודא שהוא מיושר כראוי כנגד נימי ההעברה של הטרשת הנפוצה ושבב פייה 4.1 מיקרומטר למחזיק השבב, ולאחר מכן בדוק את הפרמטרים לעירוי חיובי ושלילי המתאים ללחץ גז של 1.25 psi, מתח מקור של 1.1 קילו-וולט, 5 מיקרוליטר נפח הזרקת דגימה, סגירת מגע פלט Rel1 למשך 2.5 שניות, 5 דקות של זמן אספקה, קירור צלחת ב 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להגדיר את בקר הטמפרטורה וליצור צלחת חדשה. למצב חיובי, בדוק וכוונן את התוכנה ששיטת MS מוגדרת עם טמפרטורה נימית של 250 מעלות צלזיוס ורמת RF של עדשת S של 65.0. בתוכנת Xcalibur, פתח את השיטה החיובית ובדוק שרכישת MS בסריקה מלאה מוגדרת מאפס עד דקה אחת בטווח של 550 עד 1, 000 m/z ברזולוציה של 140, 000 עם בקרת רווח אוטומטית של מיליון וזמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות השנייה.
החל מסת מנעול של 680.48022. בדוק ששיטת הרכישה של MS/MS שאינה תלויה בנתונים מוגדרת בין טווח הזמן של 1 ו- 5 דקות ברזולוציה של 17, 500 עם מסה ראשונה קבועה של 250 m/z. בדוק כי בקרת ההגברה האוטומטית עבור MS2 מוגדרת ב- 100, 000 וזמן הזרקה מרבי ב- 64 אלפיות השנייה, אנרגיית התנגשות של 20 NCE, חלון הבידוד ב- 1 m/z וכי רשימת מסת הכללה מ- 398 ל- 1, 100 m/z משמשת עם צעד מסה של 1 דלתון.
עבור הרכישה במצב שלילי, בדוק את תוכנת הכוונון ששיטת MS מוגדרת עם הטמפרטורה הנימית ב 250 מעלות צלזיוס ברמת RF עדשת S ב 65.0 בקובץ המנגינה של MS. לאחר מכן, בתוכנת Xcalibur, בדוק שמצב רכישת הסריקה המלאה מוגדר מאפס לדקה אחת ברזולוציה של 140, 000 המכסה את טווח 400 עד 940 m/z, בקרת רווח אוטומטית של 1 מיליון, זמן הזרקה מרבי של 200 אלפיות השנייה, ומסת נעילה של 526.46262. בדוק כי רכישת MS2 במצב DIA מוגדרת בין 1 ל 5 דקות של ריצה ברזולוציה של 17, 500 עם מסה ראשונה קבועה של 150 m/z, בקרת הגברה אוטומטית של 100, 000, 64 אלפיות השנייה של זמן הזרקה מרבי ו 35 NCE של אנרגיית התנגשות באמצעות רשימת מסת הכללה מ 400 ל 940 עם צעד מסה של 1 דלתון.
צור את תור רצף הניתוח בתוכנת Xcalibur במצב חיובי והפעל אותו, ולאחר מכן צור את הרצף בתוכנת ChipSoft והתחל את הניתוח תוך המתנה להפעלת רכישת הדגימה על ידי אות סגירת מגע המגיע מרובוט העירוי הישיר עבור כל דגימה. כאשר ניתוח המצב החיובי הושלם, צור את תור רצף הניתוח בתוכנת Xcalibur במצב שלילי והפעל אותו, ולאחר מכן צור את הרצף בתוכנת ChipSoft והתחל את הניתוח תוך המתנה לרכישת הדגימה שיופעל על ידי אות סגירת מגע המגיע מרובוט העירוי הישיר עבור כל דגימה. ריכוז השומנים המנורמל הכולל זוהה וכומת מתוך 14 קבוצות השומנים הנפוצות ביותר, אשר היה מעט גבוה עבור מחלקות השומנים PE, PEO, PC, PCO, PI ו- PG ונצפתה ויסות נמוך מסוים עבור שומנים SM, LPE ו- PA.
אמנם לא ניתן היה לראות הבדל עבור TAGs ו- PS. תוצאות אלה מראות גם כי בין התכונות המולקולריות המבוססות על הנוסחה המולקולרית הכוללת, 100 עד 120 תרכובות הושפעו באופן משמעותי מחשיפה לעשן סיגריות. הדה-קונבולוציה של פיצול MS2 והנורמליזציה של עוצמות אות השבר אפשרה הגדרה משוערת של הכמות הכוללת של כל חומצת שומן מצומדת המיוצגת בכל שומנים והשוואה של נתונים אלה בין קבוצות חשופות וקבוצת ביקורת. נצפתה ירידה בחומצות שומן רוויות במלואן ומעט בלתי רוויות, בעוד שחומצות השומן הרב בלתי רוויות בהרכב מחלקות PC, PE ו-PG פוספוליפידים היו גבוהות יותר בקבוצת עשן הסיגריות בכל נקודות הזמן.
המקרים הקיצוניים של PC ו-PG מצומדים לחומצה איקוסאפנטאנואית וחומצה דוקוסהקסנואית זוהו באופן בלעדי בקבוצת החשיפה ל-3R4F CS. פיפטינג של הדגימה ודגימת QC צריך להיעשות עם קצוות פס נמוך ולהיות מדויקים, כלומר יש לבדוק את הטיפים בין כל דגימה. הצנרת של הפתרון הסטנדרטי הפנימי היא קריטית וחייבת להיות מדויקת.
התמיסה של 1 עד 1 dichloromethane מתנול צריך להיות מטופל בזהירות ולא plasticizer המכיל טיפים יש להשתמש כדי למנוע פולימרים פלסטיק בדגימות. יש לשנות את הטיפים בין כל דגימה.
