يسمح البروتوكول المقدم بتحديد مجموعة واسعة من الدهون في الأنسجة الحيوانية. إنها أداة سهلة لدراسة آليات الدهون وأيضا لتحديد العلامات الحيوية التي تشير إلى السمية المبكرة في النماذج الحيوانية. تقدم الطريقة لمحة كمية لأكثر من 400 دهون جزيئية في 14 فئة دهون مختلفة في مجموعة متنوعة من مصفوفات العينات مع وقت اتجاه مدته 10 دقائق لكل عينة.
للبدء ، تمييع الطرد المركزي القسمة 1 طاف ضعف التركيز مع عازلة بيكربونات الأمونيوم. بعد تحضير منحنى الألبومين المصلي البقري القياسي ، دوامة الأنابيب القياسية وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 18،200 غرام لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة. من الأنابيب القياسية المعدة مسبقا ، انقل 6 ميكرولتر لكل من الفراغ والمعايير والعينات إلى لوحة مسطحة القاع 96 بئرا.
بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من كاشف برادفورد إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات ومزيج. بعد الحضانة لمدة 5 دقائق ، قم بقياس الامتصاص بطول موجي 595 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. تحضير أنابيب 2 ملليلتر مع 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم في كل أنبوب من إجمالي الفراغ والمعيار الداخلي فارغة والاحتفاظ بجميع العينات على الجليد.
إعداد عينات مراقبة الجودة ، مع الأخذ في الاعتبار وضع عينة واحدة لمراقبة الجودة بين كل مجموعة من 10 عينات. أضف 10 ميكرولتر من البلازما البشرية المجمعة إلى أنابيب 2 ملليلتر ، ثم قم برفع 10 ميكرولتر من المحلول القياسي الداخلي في جميع عينات الفراغ ومراقبة الجودة والدراسة القياسية الداخلية. أضف 300 ميكرولتر من خليط البيوتانول ميثانول 20 درجة مئوية تحت الصفر إلى كل عينة ورجها عند 450 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على خلاط حراري.
بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من خليط أسيتات إيثيل الهبتان ورج عند 450 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري ، ثم أضف 300 ميكرولتر من خليط حمض الزهد 1٪ ورجه لمدة 5 دقائق عند 450 جم في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري. أجهزة الطرد المركزي عند 2،800 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونقل 360 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى أنبوب قفل ذاتي جديد سعة 2 ملليلتر يسمى 2. بعد إضافة 320 ميكرولتر من أسيتات إيثيل الهبتان إلى أنبوب طور الماء المسمى 1 ، رج عند 450 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري ، ثم الطرد المركزي عند 2،800 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة كما هو موضح سابقا.
انقل 320 ميكرولترا من المرحلة العليا وادمجها مع الكسر من الخطوة السابقة في الأنبوب 2. وبالمثل ، أضف 250 ميكرولترا من أسيتات إيثيل الهبتان إلى مرحلة الماء في الأنبوب 1 ورجها عند 450 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الحراري. مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي عند 2،800 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم نقل 200 ميكرولتر من المرحلة العليا ودمجها مع الكسور من الخطوات السابقة في الأنبوب 2.
يتبخر حتى يجف عند 35 درجة مئوية في مكثف فراغ ويعاد إذابته في 300 ميكرولتر من محلول مزيج MS. دوامة كل أنبوب لمدة 5 ثوان لضمان إذابة كل شيء وأجهزة الطرد المركزي في 18،200 غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل حصة 50 ميكرولترا إلى لوحة الميكرولتر لتحليل وضع التأين الإيجابي وقم بتخفيفها باستخدام 50 ميكرولتر من محلول مزيج MS.
مرة أخرى ، قم بتخفيف 80 ميكرولترا من مزيج MS ونقل حصة 20 ميكرولتر إلى لوحة MTP لتحليل وضع التأين السلبي. لف اللوحة بورق القصدير واحفظها عند 4 درجات مئوية قبل التحليل. قم بمعايرة مرض التصلب العصبي المتعدد في كل من الأوضاع الإيجابية والسلبية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة قبل 5 أيام أو أقل من التحليل.
قم بتثبيت مصدر نانو التسريب المباشر مقدما ، مع التأكد من محاذاته بشكل صحيح مع الشعيرات الدموية للنقل ل MS وشريحة فوهة 4.1 ميكرومتر في حامل الرقاقة ، ثم تحقق من معلمات التسريب الإيجابي والسلبي المقابل لضغط غاز يبلغ 1.25 رطل / بوصة مربعة ، جهد المصدر 1.1 كيلو فولت ، 5 ميكرولتر من حجم حقن العينة ، إغلاق ملامسة الإخراج Rel1 لمدة 2.5 ثانية ، 5 دقائق من وقت التسليم ، تبريد اللوحة عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بإعداد وحدة التحكم في درجة الحرارة وإنشاء لوحة جديدة. بالنسبة للوضع الإيجابي ، تحقق من البرنامج واضبطه بحيث تم إعداد طريقة MS بدرجة حرارة شعرية تبلغ 250 درجة مئوية ومستوى S Lens RF عند 65.0. في برنامج Xcalibur ، افتح الطريقة الإيجابية وتحقق من إعداد اكتساب MS للمسح الكامل من صفر إلى دقيقة واحدة في نطاق 550 إلى 1،000 m / z بدقة 140،000 مع التحكم الآلي في الكسب من 1 مليون والحد الأقصى لوقت الحقن من 50 مللي ثانية.
تطبيق كتلة القفل 680.48022. تحقق من إعداد طريقة اكتساب MS / MS المستقلة عن البيانات بين النطاق الزمني 1 و 5 دقائق بدقة 17،500 مع كتلة أولى ثابتة تبلغ 250 م / ض. تحقق من إعداد التحكم الآلي في الكسب ل MS2 عند 100،000 والحد الأقصى لوقت الحقن عند 64 مللي ثانية ، وطاقة تصادم تبلغ 20 NCE ، ونافذة العزل عند 1 m / z وأن قائمة كتلة التضمين من 398 إلى 1،100 m / z تستخدم مع خطوة كتلة 1 دالتون.
للحصول على في الوضع السلبي ، تحقق من برنامج الضبط الذي تم إعداد طريقة MS مع درجة حرارة الشعيرات الدموية عند 250 درجة مئوية في مستوى RF S-lens عند 65.0 في ملف MS tune. بعد ذلك ، في برنامج Xcalibur ، تحقق من إعداد وضع اكتساب المسح الكامل من صفر إلى 1 دقيقة بدقة 140،000 تغطي نطاق 400 إلى 940 م / ض ، والتحكم الآلي في الكسب من 1 مليون ، والحد الأقصى لوقت الحقن من 200 مللي ثانية ، وكتلة قفل من 526.46262. تحقق من أن اكتساب MS2 في وضع DIA تم إعداده بين 1 و 5 دقائق من التشغيل بدقة 17 ، 500 مع كتلة أولى ثابتة تبلغ 150 م / ض ، والتحكم الآلي في الكسب يبلغ 100،000 ، و 64 مللي ثانية من الحد الأقصى لوقت الحقن و 35 NCE من طاقة الاصطدام باستخدام قائمة كتلة التضمين من 400 إلى 940 مع خطوة كتلة 1 دالتون.
قم بإنشاء قائمة انتظار تسلسل التحليل في برنامج Xcalibur في الوضع الإيجابي وقم بتشغيله ، ثم قم بإنشاء التسلسل في برنامج ChipSoft وابدأ التحليل أثناء انتظار الحصول على العينة ليتم تشغيله بواسطة إشارة إغلاق اتصال قادمة من روبوت التسريب المباشر لكل عينة. عند اكتمال تحليل الوضع الإيجابي ، قم بإنشاء قائمة انتظار تسلسل التحليل في برنامج Xcalibur في الوضع السلبي وقم بتشغيله ، ثم قم بإنشاء التسلسل في برنامج ChipSoft وابدأ التحليل أثناء انتظار الحصول على العينة ليتم تشغيله بواسطة إشارة إغلاق الاتصال القادمة من روبوت التسريب المباشر لكل عينة. تم تحديد إجمالي تركيز الدهون الطبيعي وقياسه كميا من فئات الدهون ال 14 الأكثر وفرة ، والتي كانت مرتفعة قليلا لفئات الدهون PE و PEO و PC و PCO و PI و PG ولوحظ بعض التنظيم السفلي للدهون SM و LPE و PA.
بينما لا يمكن رؤية أي فرق بين TAGs و PS. تظهر هذه النتائج أيضا أنه من بين الميزات الجزيئية القائمة على الصيغة الجزيئية الكلية ، تأثر 100 إلى 120 مركبا بشكل كبير بالتعرض لدخان السجائر. سمح فك التفاف تجزئة MS2 وتطبيع شدة إشارة الشظية بالتعريف التقريبي للكمية الإجمالية لكل حمض دهني مقترن ممثل في كل زجاج دهني ومقارنة هذه البيانات بين المجموعات المكشوفة والمجموعة الضابطة. لوحظ انخفاض في الأحماض الدهنية المشبعة بالكامل وعدد قليل من الأحماض الدهنية غير المشبعة ، في حين أن الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة في تكوين فئات الفوسفوليبيد PC و PE و PG كانت مرتفعة في مجموعة دخان السجائر لجميع النقاط الزمنية.
تم الكشف عن الحالات القصوى من PC و PG المترافقة مع حمض eicosapentaenoic و docosahexaenoic حصريا في مجموعة التعرض 3R4F CS. يجب أن يتم سحب عينة العينة وعينة مراقبة الجودة بأطراف منخفضة النطاق وأن تكون دقيقة ، مما يعني أنه يجب فحص النصائح بين كل عينة. يعد سحب الحل القياسي الداخلي أمرا بالغ الأهمية ويجب أن يكون دقيقا.
يجب التعامل مع محلول الميثانول ثنائي كلورو الميثان 1 إلى 1 بعناية ويجب استخدام أطراف غير ملدنة تحتوي على تجنب وجود بوليمرات بلاستيكية في العينات. يجب تغيير النصائح بين كل عينة.
