פרוטוקול מודולרי זה מאפשר לחקור אירועים מולקולריים מרובים שניתנו על ידי שומנים מבניים ומאותתים, ו/או RNAs, באזורי רקמות דיסקרטיים ובדם עם תפוקת נתונים כמותית ואיכותית משופרת לכל דגימה מדגם. השיטה חלה על כל מודל ניסיוני, והיא יכולה להיות מיושמת גם על דגימות רקמות אנושיות ודם. מי שידגימו את ההליך יהיו קלאודיה שוויטר, טכנאית, ג'וליה פוסט, סטודנטית לתואר שני, וראיסה לרנר, פוסט-דוקטורנטית בקבוצה שלי.
כדי להתחיל, לקחת בעבר מבודד, שלם, מוחות קפואים של עכברים עם אפילפסיה חריפה ומטופלת באופן מניעתי חומצה קיינית הנגרמת. הר את המוחות על מערכת ההרכבה של הקריוסטט. הגדר את העובי ל-50 מיקרומטר וחתוך את המוח במצב חיתוך קרוב לאזור העניין.
כאשר מתקרבים לאזור העניין, להגדיר את העובי ל 18 עד 20 מיקרומטרים. כדי להתאים את תת-הערך של עניין, להכתים את פרוסות המוח באמצעות טולואידין כחול. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את הפרוסות המוכתמות כדי לזהות את אזורי העניין שיש להכות, ולהשתמש אטלס עכבר כהפניה כדי למצוא את האזורים האנטומיים המתאימים במוח.
השתמש corers מדגם לקחת אגרופים בקוטר 0.8 עד 1.0 מילימטר. העבר את האגרופים עבור אנדוקנבינואידים ו eicosanoids coextractions לתוך צינורות ענבר 2 מיליליטר מקורר מראש עם שבעה כדורי פלדה מקורר מראש לכל צינור. עבור פוספוליפידים אנדוקנבינואידים דו-קוטביים, חילוץ משותף של שומנים כפולים ו-RNA, מעבירים את האגרופים ל-2 מיליליטר צינורות חילוץ ללא RNase עם חרוזי קרמיקה.
לשקול אגרופים קפואים בחדר הקר ומיד להמשיך עם החילוץ או להקפיא ב 80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע דו-שיח שומני נוזלי נוזלי של אנדוקנבינואידים ואיקוסנואידים מחתיכות מוח, אגרופים, או דגימות אבקת רקמות, למקם את צינורות החילוץ המכילים את דגימות הרקמות ושבעה כדורי פלדה על קרח. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של MTBE קר כקרח ו-50 מיקרוליטרים של מי אצטוניטריל המכילים את הסטנדרטים הפנימיים.
לאחר הוספת 400 מיקרוליטרים של חומצה פורמית טוחנת 0.1, השתמש בליזר רקמות להומוגניזציה למשך 30 שניות עד דקה אחת. צנטריפוגה הומוגנית זה במשך 15 דקות ב 5, 000 פעמים g ב 4 מעלות צלזיוס. מניחים אותו במקפיא במשך 10 דקות ב 80 מעלות צלזיוס כדי להקפיא את השלב התחתון מימית, אשר יקל על העברת השלב האורגני העליון.
מעבירים את השלב האורגני העליון לצינורות ענבר חדשים של 1.5 מיליליטר, מתאדים תחת זרם עדין של חנקן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן משחזרים ב-50 מיקרוליטרים של מי אצטוניטר לניתוח נוסף. יש לאחסן את השלב המימי בטמפרטורה של 20 או 80 מעלות צלזיוס לניתוח נוסף של תכולת החלבון. כדי להקדים אנדוקנבינואידים ואיקוסנואידים מדגימות פלזמה, הניחו את דגימות הפלזמה הקפואות על הקרח ותנו להם להפשיר לחלוטין.
הוסף 800 מיקרוליטרים של MTBE ו -50 מיקרוליטרים של מי אצטוניטריל המכילים את הסטנדרטים הפנימיים הממוטבים לעלייה באמצעות דגימות פלזמה ייחוס. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של 0.1 חומצה פורמית טוחנת ומערבולת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות. צנטריפוגה הדגימות ב 4, 000 פעמים g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
מעבירים את השלב האורגני לצינורות חדשים. התאדו אותו תחת זרם עדין של חנקן ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשפץ אותו עם 50 מיקרוליטרים של מי אצטוניטריל לניתוח ניטור תגובה מרובה כרומטוגרפיה נוזלית. כדי לבצע דו-שיח של פוספוליפידים ואנדוקנאבינואידים מאזורי המוח, אגרופים או דגימות אבקת רקמות אחרות, הנח את צינורות החילוץ המכילים את דגימות הרקמות וחרוזי הקרמיקה על הקרח.
הוסיפו 800 מיקרוליטרים של מתיל טרט-בוטיל אתר ותערובת מתנול ו-10 מיקרוליטרים של מתנול המכילים את הסטנדרטים הפנימיים. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של 0.1% חומצה פורמית המכילה 25 טטרהידרפוליפסטטין מיקרומולרי / URB597 ו 50 מיקרוגרם למיליליטר של BHT. לאחר הומוגניזציה עם homogenizer רקמה, צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
להעביר את השלב האורגני העליון לתוך צינורות חדשים, להתאדות תחת זרם עדין של חנקן ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשחזר את תמצית השומנים עם 90 מיקרוליטרים של מתנול. אם תמשיך מיד, להוסיף 10% מים aliquot של תמצית השומנים ולהזריק 10 microliters ב LC / MS לניתוח פוספוליפידים. לניתוח אנדוקנבינואידים נוספים, המשיכו בשלב הבא.
קח aliquot של תמצית השומנים, להתאדות ליובש, ו reconsacteute במים אצטוניטרילים. כדי לבצע מיצוי כפול של RNA ושומנים ודו-שיח של פוספוליפידים ואנדוקנאבינואידים מדגימות רקמות, להפשיר aliquots אבקת רקמה או צרורות המוח ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף את הרקמה לצינורות מיצוי עם חרוזי קרמיקה.
לאחר מכן הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מאגר RLT יחד עם 200 מיקרוליטרים של כלורופורם. עבור פוספוליפיד ו אנדוקנבינואיד דו-שיח, דגימות ספייק עם 10 מיקרוליטרים של תערובת סטנדרטית פנימית הומוגניזציה במהירות גבוהה במשך 20 שניות. העבר דגימות הומוגניות לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות חדשות במשך חמש דקות במלוא המהירות ו -4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר את הפרדת הפאזה.
העבר את השלב העליון לצינור טרי להפקת RNA באמצעות ערכה סטנדרטית. Elute חילץ RNA בנפח כולל של 50 מיקרוליטרים של מים ללא RNase ולאחסן אותו ב 80 מעלות צלזיוס. עבור מיצוי שומנים בדם, להוסיף 800 מיקרוליטרים של MTBE / מתנול ו 200 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה פורמית לשלב המכיל כלורופורם התחתון.
מערבולת במשך 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את השלב האורגני העליון לצינור חדש. להתאדות אותו תחת זרם עדין של חנקן ב 37 מעלות צלזיוס.
לניתוח נוסף של LC/MS, שחזרו את המדגם ב-90 מיקרוליטרים של מתנול ואחסנו אותה ב-20 או 80 מעלות צלזיוס, או המשיכו מיד לניתוח. לניתוח אנדוקנבינואידים נוספים, המשיכו בשלב הבא. קח aliquot של תמצית השומנים, להתאדות ליובש, ו reconsacteute במים אצטוניטרילים.
לאחר מכן, להזריק 20 microliters ב LC / MS לניתוח אנדוקנבינואידים. אינדוקציה חומצה קיינית של התקפים אפילפטיים חריפים הובילה לעוצמת התקף מקסימלית שעה אחת לאחר ההזרקה. פרופיל ליפידומי של אנדוקנבינואידים ואיקוסנואידים, כמו גם פוספוליפידים ואנדוקנאבינואידים, מראה שינויים ברמת השומנים על פני קליפת המוח, סטריאטום, אזור תלמי, היפוקמפוס, היפותלמוס, מוח קטן, כמו גם רקמת לב וריאה בעכברים ובקרות אפילפטיים הנגרמים על ידי חומצה קיינית.
לאחר מיצוי כפול של פוספוליפידים ואנדוקנאבינואידים ורנ"א עבור פרופיל כמותי של אגרופי מוח עכבר, ההתפלגות הכמותית של שומנים בהיפותלמוס, אמיגדלה בזולטרית, וההיפוקמפוס הגחוני והגב נותח. רמות ביטוי יחסיות של אנזימים אנדוגניים וקולטנים המעורבים איתות שומנים בדם, כמו גם סמנים לפעילות המוח נחקר ברמת mRNA באזורים שונים במוח subregions מעכברים נתון התקף אפילפטי הנגרמת חומצה קיינית ובקרות. אפילפסיה הנגרמת על ידי חומצה קיינית גרמה לאובדן מסיבי של אות NeuN, בעיקר באזור CA1, CA3 והילוס של ההיפוקמפוס, מלווה באירועים אפופטוטיים המצוינים על ידי אות כספית-3 בהשוואה לעכברים המוזרקים מלוחים לבקרה.
לאחר טיפול עם palmitoylethanolamide subchronic, אות חלבון גרעינים עצביים נשמר באופן ניכר אות CASP3 בקושי ניתן היה לגילוי. ניקוב מוחי וחיתוך של אזורי מוח דיסקרטיים הם מאתגרים למדי ודורשים מיומנויות עדינות כדי להשיג דגימה עקבית על פני קבוצות מרובות. לכן, תרגול על איברי בדיקה וידע טוב של מורפולוגיה במוח מומלץ מאוד.
