שיטת הניתוח שלנו מאפשרת בידוד מדויק של הנישה הנוירוגנית בחדר, ולכן מתאימה היטב לחקר המיקרו-סביבה המולקולרית של נישה זו. היתרון העיקרי של שיטת ניתוח זו הוא שהיא מדויקת, יעילה וגורמת להפרעה מינימלית של רקמות תוך שהיא עדיין תואמת לספקטרומטריית מסה לניתוח פרוטאום. בפרוטוקול זה, אנו מחלצים את הנישה הנוירוגנית של החדר ממוח עכבר, אך שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על מינים אחרים ובמצבים שונים של בריאות ומחלות.
הטכניקה עשויה לדרוש הכשרה מסוימת. במיוחד עם חתכי האזמל בעת חשיפה וחילוץ נישה נוירוגנית חדרית. לאחר המתת חסד של עכבר זכר C57 שחור/6 בן 8 עד 10 שבועות, לחלץ את המוח על ידי ביתור ידני ולהניח אותו בכלי תרבות המכיל מדיום ניתוח קר כקרח.
באמצעות אזמל, להסיר את הנורה חוש הריח על ידי ביצוע חתך קורונל ישר בין הנורה חוש הריח ואת הקוטב הפנימי של קליפת המוח. לאחר מכן, להסיר את הקוטב הקדמי של קליפת המוח על ידי ביצוע חתך coronal, להבטיח כי החדרים לרוחב גלויים במישור coronal. לאחר מכן, באמצעות מספריים, לפתוח את שני החדרים לרוחב מלמעלה, החל החלק קשתי מפני השטח קליפת המוח אל לומן החדר.
להאריך את החתך הזה בצורה בצורת C בעקבות כיפוף החדר. לאחר מכן, חבר את הקצוות הקואודליים של החתך הקשת השמאלי והימני, תוך שימוש בחתך קורונלי נוסף. לאחר מכן, להסיר את קליפת המוח ואת corpus callosum המכסה את קירות החדר המדיאלי.
אם הרקמה מחוברת לדפנות החדר המדיאלי, לבצע חתכים נוספים או להרים את קליפת המוח ואת corpus callosum עם מספריים כדי לחלץ את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, להסיר את קליפת המוח ו corpus callosum המכסה את החדרים לרוחב. באמצעות מלקחיים, בזהירות להפיץ את קירות החדר ולהסיר את מקלעת choroid.
לאחר מכן, לשים את המוח על שקופית זכוכית ולהניח את השקופית על גבי קרח יבש כדי להקפיא את המוח עם קירות החדר בתצורה הפתוחה. לפני החיתוך, ודאו שהמוח מחובר ללוחית ההצמדה של הקריוסטט במוח האחורי עם מדיום מוטבע לרקמות קפואות. בנוסף, ודא כי אין מדיום מוטבע בא במגע עם המוח הקדמי, במיוחד בחדרים.
לאחר מכן, לחתוך 50-100 מיקרומטר עבה חלקים של המוח עד סוף החדר לרוחב, ולהרכיב את החלקים על שקופיות הזכוכית. מניחים את מגלשות הזכוכית על קרח יבש תחת מיקרוסקופ ביתור. הרימו את הפרוסות מהקרח היבש למשך 15 עד 30 שניות כדי להשיג הפשרה קצרה ולא שלמה, מה שהופך את המיאלין הקומפקטי של הסטריאטום לנצפות כנקודות לבנות צפופות.
לאחר מכן, באמצעות אזמל מקורר מראש, להפריד את האזור subependymal מן הסטריאטום הסמוך, ולהעביר אותו כמו חתיכה שלמה או מחולק לשניים עד ארבעה חלקים לתוך צינור microcentrifuge באמצעות הקצה קהה של אזמל מקורר. לאחר מכן לעשות את אותו הדבר עבור אזור החדר המדיאלי. כמוסות פנימיות הקשורות למיאלין, גליקופרוטאין חיוביות של הסטריאטום זוהו בדגימות המלאות, אך לעתים רחוקות בדגימות ההקפאה-סעיף-ניתוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
זיהום סטריאטלי בדגימות כולן אושר על ידי העשרה של חלבוני מיאלין באזור התת-כספי, בהשוואה לדגימות קליפת המוח הסומטו-חושית. לעומת זאת, השוואות של חלבוני סמן מיאלין אלה בדגימות ההקפאה-סעיף-ניתוח לא הראו הבדלים משמעותיים באזור התת-ת-פדנדימלי ובדגימות קליפת המוח הסומאטו-חושית. כאשר משווים את תוצאות הספקטרומטריה של המסה בין ניתוח החלק ההקפאה למיקרודיסקציה של לכידת לייזר, מיקרודיסקציה לכידת לייזר הניבה כמחצית ממספר החלבונים המכונמים, אם כי זמן איסוף הרקמות היה בערך פי שניים.
ניתוח רכיבים עקרוני מגלה כי יש שונות גדולה יותר בין דגימות שנאספו עם microdissection לכידת לייזר, המתואר ריבועים, מאשר בין אלה שנאספו עם קריו-קטע-כריתה, המתוארים כעיגולים. בדיקת העשרת ביאורים דו-ממדית בין ניתוח קריו-קטע ללכידת לייזר למיקרודיסקציה לאזורים התת-אפינדימליים והמדיאליים חשפה העשרה דומה בשתי השיטות והאזורים לחלבונים הקשורים למרחב החוץ-תאי. ניתוח החלק של Cryo מספק זיהוי וכימות חזקים יותר של נוירוגנזה בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים הקשורים לאזור תת-אופן.
במקרה של טנסין-C, רק קריו-סעיף-ניתוח הציג העשרה באזור תת-ependymal בהשוואה לאזור ependymal המדיאלי. ודא כי קטעי המוח על השקופיות לא להיות מופשר לחלוטין. בסך הכל, זה טוב לתרגל את השלבים בהליך הניתוח לקבלת תוצאה עקבית.
שיטת הניתוח יכולה לשמש גם עם שיטות ניתוח חלבונים אחרות שיכולות לזהות בקלות חלבונים בשפע נמוך מאוד, כגון גורמי גדילה וציטוקינים. שיטת מיקרודיסקציה זו אפשרה לנו לזהות רגולטור נוירוגנזה חדש, ואנו מאמינים שהיא תאפשר לאחרים לזהות רגולטורים אחרים של נוירוגנזה בהקשרים שונים.
