כדי לקבל תובנה טובה יותר בהרכב ובמבנה של מקלעת הכורואידים, שיטה יעילה לבודד את מקלעת הכורואיד מחוץ לחדרי המוח היא צעד ראשון שלא יסולא בפז. בעזרת טכניקת מיקרודיסקציה זו ניתן לנתח את מקלעת הכורואיד מתוך חדרי המוח תוך הכלת תפקודו, כדאיותו ומבנהו מבלי לזהם את מקלעת הכורואיד ברקמה שמסביב. מכשול משמעותי בבידוד מקלעת כורואיד הוא זיהוי המבנה כפי שהוא עדיין צף בחדרי המוח.
צביעת מקלעת הכורואיד בכחול ברומופנול מקלה על הבידוד. מי שידגים את ההליך יהיה אליין ואן וונטרגהם, מנהל המעבדה שלנו. התחילו בהכנת חומר הרדמה סופני, תמיסת זילוח טרנסקרדיאלית, ותמיסה הנדרשת לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, או SEM, ופתרונות נוספים כאמור בטקסט.
כדי לבודד את מוח העכבר, הניחו את בעל החיים המורדם הסופנית במצב הדקוביטוס הגבי, וקבעו את העכבר על ידי הצמדת הגפיים לצלחת. יש לחטא את החזה על ידי ריסוס 70% אתנול לפני ביצוע חתך של כארבעה סנטימטרים ממש מתחת לסרעפת באמצעות להב כירורגי מפלדת פחמן. לפתוח את העור ולחשוף את החזה באמצעות מספריים כירורגיים.
חותכים את הסרעפת פתוחה לחלוטין ומפרידים את בית החזה כדי לחשוף את הריאות ואת הלב הפועם. באמצעות משאבת זילוח לנקב את העכבר עם 10 מיליליטר של פתרון זילוח בקצב של 4.5 מיליליטר לדקה. הכנס מחט של 26 מד לחדר השמאלי כדי לשאוב את התמיסה לתוך המעגל המערכתי.
באמצעות מספריים כירורגיים, לחתוך את אטריום הנכון עבור הדם כדי לצאת ממחזור הדם. לאחר עריפת ראשו של העכבר חתכו את הקרקפת על ידי ביצוע חתך המתחיל בין האוזניים לעליון על העיניים. משוך את העור לרוחב כדי לחשוף את הגולגולת.
לאחר מכן פתח את הגולגולת על ידי ביצוע התפרים הקשקשים לכיוון חלק האף. לאחר שתסיים, הניחו את המוח בצלחת פטרי קרה כקרח, והוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לרקמת המוח. כדי לבודד את מקלעת הכורואיד הצף בחדר הרביעי, חתכו בעדינות את המוח הקטן מהמוח באמצעות אזמל.
הסר את חלקי רקמת גזע המוח הנותרים מהמוח הקטן. סובבו את המוח כך שקו החיתוך פונה כלפי מעלה, וודאו שחלל החדר הרביעי נראה באמצע הקטע עם מקלעת הכורואיד השוכבת באתר הגב. במידת הצורך, פתח את החדר על ידי משיכת רקמת החיבור במלקחיים חדים.
קורעים בעדינות את מקלעת הכורואיד מדופן החדר באמצעות מלקחיים זעירים וחדים. כדי לבודד את מקלעת הכורואיד מהחדר הצידי, חתכו את המוח לשתי המיספרות באמצעות מלקחיים חדים זעירים. סובבו חצי כדור מוח אחד כך שקו החיתוך יהיה כלפי מעלה.
כדי לחשוף את החדר הצידי, למשוך בעדינות את קליפת המוח מן התלמוס. משכו את ההיפוקמפוס לקו החיתוך האמצעי. החדר הצידי נראה כעת כאשר מקלעת הכורואיד מונחת בתחתית החדר.
במידת הצורך, לפתוח את החדר קצת על ידי משיכת רקמת החיבור עם מלקחיים חדים. השתמשו במלקחיים זעירות וחדות כדי לקרוע בעדינות את מקלעת הכורואיד מדופן החדר. כדי לבצע את הכנת הדגימה עבור SEM להעביר את מקלעת כורואיד מבודד טרי לתוך פתרון קיבוע טרי לדגור במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר שתסיים, שטוף את הדגימה שלוש פעמים באמצעות שלושה עד חמישה מיליליטר של חיץ נתרן cacodylate מולארי 0.1 במשך חמש דקות כל אחד. לאחר תיקון הדגימות בשלושה עד חמישה מיליליטר של 2%osmium tetroxide ב 0.1 טוחן נתרן cacodylate חיץ במשך 30 דקות. לאחר מכן שטפו את הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת באמצעות שלושה עד חמישה מיליליטר מים טהורים במיוחד.
לאחר מכן, יש לייבש את הדגימות בסדרה הולכת וגדלה של ריכוזי אלכוהול אתילי קר כקרח עם 15 דקות לכל תמיסת אתיל אלכוהול. השתמשו במייבש נקודתי קריטי כדי לייבש את הדגימה כראוי. מקם את הדגימה בזהירות על תושבת דגימה עם מדבקת פחמן ודמיין את דגימות מקלעת הכורואיד באמצעות SEM.
הפרוטוקול הנוכחי אפשר בידוד יעיל של מקלעת הכורואיד מהמוח של העכבר מהחדר הצידי והחדר הרביעי. זילוח עם ברומופנול כחול הביא להדמיה של מקלעת הכורואידים. כאשר ברומופנול כחול לא הורשה בשלבי עיבוד נוספים, זילוח עם PBS-הפרין או לא בוצע זילוח לעיבוד.
ניתוח מורפולוגי SEM של פני השטח של אפיתל מקלעת כורואידים, או CPE, תאים מראה בבירור את מבנה שתי הזרועות של החדר הרביעי ואת הצורה האופיינית בצורת C של מקלעת כורואיד לרוחב מבודד מהחדר הצידי. הגדלה גבוהה יותר של SEM חשפה מבנים דמויי שלפוחית בצד האפי של תאי CPE ומיקרוווילי, דבר המצביע על כך שניתן לחקור שינויים מורפולוגיים של תאי CPE בתנאי מחלה באמצעות SEM. חשוב רק לגעת ולהוציא את רקמת מקלעת הכורואיד על מנת לא לזהם את הדגימה ברקמה שמסביב.
השתמש בזהירות הנדרשת כדי לשמר את המבנה של מקלעת כורואידים. ניתן ליישם מגוון טכניקות במורד הזרם על מקלעת הכורואיד המבודדת כדי לחקור את המבנה והתפקוד שלה, החל מניתוח מיקרוסקופ על ניתוח שעתוק ועד ציטומטריית זרימה. ניתוח מיקרו-כירורגי של מקלעת הכורואיד מחוץ למוח מאפשר לנו לקבל תובנה טובה יותר לגבי המבנה והתפקוד של רקמת המוח הזעירה הזו.
ידע זה חיוני כדי להבין טוב יותר את תפקידו במחלות נוירולוגיות.
