המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן במבנה האולטרה של מגהקריוציטים הממוקמים בתוך מח העצם של העכבר, ולכומת את שלבי ההתבגרות השונים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור ברזולוציה גבוהה. היתרון העיקרי הוא בחינה ישירה של megakaryocytes בסביבה המקומית, אשר שונה מ מותחקריוציטים מתורבתים במבחנה כי כפי שאנו יודעים לא להגיע לרמה המלאה של ההתבגרות. לאחר קצירת השוקה ועצם הירך מ 12 עד 18 שבועות C57BL/ 6 עכברים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, להשתמש בסכין גילוח חד כדי להסיר את epiphyses מכל עצם.
מחזיקים כל עצם עם פינצטה, מכניסים מחט 21 מד מחובר מזרק חמישה מיליליטר מלא חוצץ קקודילאט לקצה אחד של העצם לשטוף את מח העצם לתוך צינור אוסף 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של חוצץ קקודילאט טרי. מיד לאחר השטיפה, השתמש פיפטה פלסטיק להעביר את גלילי מח העצם לתוך מיליליטר אחד של פתרון קיבוע גלוטרלדהיד טרי עבור דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר. להטמעת מח העצם באגרוז, יש לשטוף את הדגימות הקבועות במאגר קקודילט טרי ולהשתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר בזהירות את מח העצם למגלשת זכוכית.
באמצעות פיפטה חמה, להחיל במהירות טיפה של 2% אגר נוזלי על גלילי מח העצם, ומיד למקם את השקופית על קרח במשך 1 עד 2 דקות. כאשר האגר התגבש, השתמש במיקרוסקופ סטריאו ובסכין גילוח חד כדי להשליך את הגפיים של כל גליל מח עצם ולהעביר את גושי מח העצם הקצוצים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חוצץ קקודילאט. עבור הטבעת שרף, לתקן את הבלוקים עם 1% osmium tetroxide במאגר קקודילאט במכסה המנוע הכימי במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס לפני שטיפת הבלוקים פעם אחת עם חוצץ קקודילאט ופעם אחת עם מים מזוקקים.
לאחר שטיפת המים, מכתימים את הבלוקים עם 4% אורניל אצטט במים מזוקקים במשך שעה ואחריו שתי שטיפות במים מזוקקים כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, ייבשו את הבלוקים דרך סדרה עולה של טבילות אתנול ומים מזוקקים כפי שצוין. כדי להשיג חדירה אחידה פילמור של שרף אפוקסי בתוך מח העצם, לדגור על בלוקים בשתי אמבטיות רצופות של תחמוצת פרופילן במשך 15 דקות לפני הדגירה של הדגימות בתערובת של אחד לאחד של תחמוצת פרופילן 100% תחמוצת פרופילן ושרף אפוקסי במשך שעה אחת על שייקר סיבובי איטי בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, להוסיף 100%שרף אפוקסי לחסימות מח העצם עבור דגירה לילה באותם תנאים, ולאחר מכן להוסיף 100%שרף אפוקסי עבור דגירה נוספת של שעתיים. בסוף הדגירה, השתמש במיקרוסקופ כדי לכוון את גושי מח העצם בתבניות סיליקון שטוחות כדי לאפשר את החלקה הרוחבת הבאה שלהם ולמלא את התבניות עם שרף אפוקסי לפני הצבתם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לחיתוך דק במיוחד, הוערס על בלוק הדגימה על תמיכה במיקרוטומיה אולטרה והעלה את התמיכה על מחזיק הדגימה.
השתמש בחותך כרסום יהלום כדי לקצץ את הדגימות בזווית של 45 מעלות כדי להסיר את השרף העודף סביב הרקמה לפני השימוש בסכין יהלום המצויד במיכל מים כדי לחתוך קטעים עבים רוחביים 500 ו -100 ננומטר לניתוח היסתולוגי ו- TEM בהתאמה, ואז השתמש בלולאה כדי להעביר את החלקים העבים של 500 ננומטר הצפים על פני המים על משטח המים על מגלשת זכוכית ולהפקיד את עובי 100 ננומטר מקטעים על רשת נחושת דקה של 200 רשת עם מסנן נייר מתחת. עבור תכתמים כחולים טולואידין, לאחר ציור החלקים בעובי 500 ננומטר על צלחת חמה של 60 מעלות, הוסיפו 1% טולואידין כחול במים מזוקקים למקטעים לדגירה של דקה עד שתי דקות. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם מים מזוקקים.
כאשר השקופיות התייבשו, השתמש באמצעי הרכבה כדי להרכיב את הדגימות עם כיסוי ולהציג את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה קלה. עבור כתמי ניגודיות, סמן את מקטעי 100 ננומטר עם 4% אצטט אורניל במשך חמש דקות ואחריו שלוש שטיפות של חמש דקות עם מים מזוקקים. לאחר הכביסה האחרונה, מכתימים את החלקים עם ציטוט עופרת במשך שלוש דקות, ואחריו שלוש שטיפות של חמש דקות במים מזוקקים כפי שהודגם.
לאחר הכביסה האחרונה, מניחים את הצד התחתון של כל רשת במגע עם פיסת נייר סינון תחילה כדי לאפשר את הצבת הרשתות על נייר המסנן להתייבש. כדי לבחון את המקטעים על ידי TEM, כאשר הרשתות התייבשו, בחר הגדלה נמוכה כדי להעריך את האיכות הכללית של ההכנות. כדי לקבוע את מספר המגקריוציטים מכל שלב של התבגרות בכל מקטע רוחבי, בחר הגדלה גבוהה יותר וכמת את מספר המגקריוציטים של שלב I, II או III רק בריבועים המכוסים במלואם ברקמה.
בניתוח היסתולוגי מייצג זה, ניתן לראות בבירור את המשכיות המיקרו-כלי הקומפקטיות ואת הגודל והצורה של המגקריוציטים. מקרוציטים מורינים מחולקים לארבעה שלבים של התבגרות. בשלב הראשון למגקריוציטים יש גרעין גדול.
נוכחותו של השלב המוקדם ביותר לגילוי של מערכת קרום התיחום היא גם קריטריון מרכזי של שלב זה. בשלב II, היווצרות גרגר מתחילה ופיתוח מערכת קרום התיחום הוא יזם. מגקריוציטים בשלב III הם תאים ענקיים עם מערכות קרום תיחום מפותחות, שטחים ציטופלסמיים מוגדרים בבירור ואזורים היקפיים נטולי אברונים, ונגרעינים הממוקמים באופן אקסצנטרי.
שלב הפינוציטים של התבגרות מגה-קריוצייט מאופיין בגרעין עירום. כפי שמודגם, megakaryocytes נצפים לעתים קרובות במגע עם תאי אנדותל. לעתים, megakaryocytes ליצור בליטות פולשניות קצרות לחדור את אנדותל או שהם להרחיב את הנפיחות לתוך לומן הסינוסואידי.
TEM מאפשר גם הדמיה של פרטים מבניים אולטרה, כמו גם את נוכחותם של תאים hematopoietic כי כבר בלע על ידי megakaryocytes. שטיפה מח עצם צריך להתבצע בזהירות ומיד לאחר ניתוח העצם. כדי למקסם את שלמות הרקמה, מח העצם מוקף בג'ל אגר לפני התייבשות.
בעקבות הליך זה, ניתן לדמיין את בלוקי מח העצם בהגדלות שונות או לשמש לניתוח מיקרוסקופיה תלת-ממדית אחרת של אלקטרונים, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים ממוקדת של קרן יונים.
