L’objectif global de cette procédure est d’observer l’ultrastructure des mégacaryocytes situés dans la moelle osseuse de la souris et de quantifier les différentes étapes de maturation à l’aide de la microscopie électronique à transmission à haute résolution. Le principal avantage est l’examen direct des mégacaryocytes dans l’environnement natif, qui diffère des mégacaryocytes cultivés in vitro qui, comme nous le savons, n’atteignent pas le niveau complet de maturation. Après avoir récolté le tibia et les fémurs de souris C57BL/6 âgées de 12 à 18 semaines selon les protocoles standard, utilisez une lame de rasoir tranchante pour enlever les épiphyses de chaque os.
En tenant chaque os avec une pince à épiler, insérez une aiguille de calibre 21 attachée à une seringue de cinq millilitres remplie de tampon cacodylate dans une extrémité de l’os et rincez la moelle osseuse dans un tube de collecte de 15 millilitres contenant deux millilitres de tampon cacodylate frais. Immédiatement après le rinçage, utilisez une pipette en plastique pour transférer les cylindres de moelle osseuse dans un millilitre de solution fixatrice de glutaraldéhyde frais pour une incubation de 60 minutes à température ambiante. Pour l’incorporation de la moelle osseuse dans l’agarose, lavez les échantillons fixés dans un tampon cacodylate frais et utilisez une pipette en plastique pour transférer soigneusement la moelle osseuse sur une lame de verre.
À l’aide d’une pipette chaude, appliquez rapidement une goutte de gélose liquide à 2 % sur les cylindres de moelle osseuse et placez immédiatement la lame sur de la glace pendant une à deux minutes. Lorsque la gélose s’est solidifiée, utilisez un stéréomicroscope et une lame de rasoir tranchante pour éliminer les extrémités de chaque cylindre de moelle osseuse et transférer les blocs de moelle coupés dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant un millilitre de tampon cacodylate. Pour l’incorporation de résine, fixez les blocs avec du tétroxyde d’osmium à 1% dans un tampon cacodylate dans une hotte chimique pendant une heure à quatre degrés Celsius avant de laver les blocs une fois avec un tampon cacodylate et une fois avec de l’eau distillée.
Après le lavage à l’eau, tacher les blocs avec de l’acétate d’uranyle à 4% dans de l’eau distillée pendant une heure, suivi de deux lavages à l’eau distillée, comme démontré. Après le dernier lavage, déshydratez les blocs par une série ascendante d’immersions à l’éthanol et d’eau distillée comme indiqué. Pour obtenir une infiltration et une polymérisation uniformes de la résine époxy à l’intérieur de la moelle, incuber les blocs dans deux bains successifs d’oxyde de propylène pendant 15 minutes avant d’incuber les échantillons dans un mélange un-à-un d’oxyde de propylène à 100% et de résine époxy pendant une heure sur un agitateur rotatif lent à température ambiante.
À la fin de l’incubation, ajoutez de la résine époxy à 100% aux blocs de moelle pour une incubation de nuit dans les mêmes conditions, puis ajoutez de la résine époxy à 100% pour une autre incubation de deux heures. À la fin de l’incubation, utilisez un microscope pour orienter les blocs de moelle dans des moules plats en silicone afin de permettre leur section transversale ultérieure et remplissez les moules de résine époxy avant de les placer à 60 degrés Celsius pendant 48 heures. Pour une section ultra fine, montez le bloc d’échantillon sur un support ultra microtome et montez le support sur le porte-échantillon.
Utilisez une fraise diamantée pour couper les échantillons à un angle de 45 degrés afin d’éliminer l’excès de résine autour du tissu avant d’utiliser une lame de couteau en diamant équipée d’un réservoir d’eau pour couper des sections transversales de 500 et 100 nanomètres d’épaisseur pour l’analyse histologique et TEM respectivement, puis utilisez une boucle pour transférer les sections de 500 nanomètres d’épaisseur flottant sur la surface de l’eau sur une lame de verre et pour déposer les 100 nanomètres d’épaisseur sections sur des grilles de cuivre à barres minces de 200 mailles avec un filtre en papier en dessous. Pour la coloration au bleu de toluidine, après avoir dessiné les sections de 500 nanomètres d’épaisseur sur une plaque chauffante à 60 degrés, ajoutez du bleu de toluidine filtré à 1% dans de l’eau distillée aux sections pour une incubation d’une à deux minutes. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec de l’eau distillée.
Lorsque les lames ont séché, utilisez un support de montage pour monter les échantillons avec un couvercle et visualisez les échantillons par microscopie optique. Pour la coloration de contraste, étiqueter les sections de 100 nanomètres avec de l’acétate d’uranyle à 4% pendant cinq minutes, suivies de trois lavages de cinq minutes à l’eau distillée. Après le dernier lavage, tacher les sections avec du citrate de plomb pendant trois minutes, suivies de trois lavages de cinq minutes à l’eau distillée comme démontré.
Après le dernier lavage, placez d’abord le côté inférieur de chaque grille en contact avec un morceau de papier filtre pour permettre aux grilles d’être placées sur le papier filtre pour sécher. Pour examiner les sections par TEM, lorsque les grilles ont séché, sélectionnez un faible grossissement pour évaluer la qualité générale des préparations. Pour déterminer le nombre de mégacaryocytes de chaque stade de maturation dans chaque section transversale, sélectionnez un grossissement plus élevé et quantifiez le nombre de mégacaryocytes de stade I, II ou III uniquement dans des carrés entièrement recouverts de tissu.
Dans cette analyse histologique représentative, la continuité des micro-vaisseaux de compacité ainsi que la taille et la forme des mégacaryocytes peuvent être clairement observées. Les mégacaryocytes murins sont divisés en quatre étapes de maturation. Les mégacaryocytes de stade I ont un gros noyau.
La présence de l’étape détectable la plus précoce du système de membrane de démarcation est également un critère clé de cette étape. Au stade II, la formation de granules commence et le développement du système de membrane de démarcation est lancé. Les mégacaryocytes de stade III sont des cellules géantes avec des systèmes membranaires de démarcation bien développés, des territoires cytoplasmiques clairement définis et des zones périphériques dépourvues d’organites, et des noyaux excentriques.
Le stade pyrénocytaire de la maturation des mégacaryocytes est caractérisé par un noyau nu. Comme illustré, les mégacaryocytes sont fréquemment observés au contact des cellules endothéliales. À l’occasion, les mégacaryocytes forment de courtes protubérances invasives qui pénètrent dans l’endothélium ou étendent les proplaquettaires dans la lumière sinusoïdale.
La TEM permet également la visualisation de détails ultra structurels, ainsi que la présence de cellules hématopoïétiques qui ont été englouties par les mégacaryocytes. Le rinçage de la moelle osseuse doit être effectué avec soin et immédiatement après la dissection osseuse. Pour maximiser l’intégrité des tissus, la moelle est entourée d’un gel de gélose avant la déshydratation.
Après cette procédure, les blocs de moelle osseuse peuvent être imagés à différents grossissements ou peuvent être utilisés pour d’autres analyses de microscopie électronique 3D, telles que la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisé.
