המחברים מבקשים להודות אן Daron ופייר לואי Loyher עבור עריכה סיוע, Plateforme Imagerie Pitié-סלפטרייר (PICPS) לקבלת סיוע במיקרוסקופ שני הפוטונים ומתקן בעלי החיים &quot;NAC&quot; וקמיל Baudesson לעכברי רביית סיוע. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7 / 2007-2013) תחת הסכם מענק n ° 304,810 - פשיטות, וn ° 241,440-Endostem, מINSERM, מהאוניברסיטה לפירית et מארי קירי &quot;צמיחה &quot;, מla&quot; ליגת העל contre le סרטן &quot;, מתוך&quot; אגודת pour la משוכלל ונדיר sur le סרטן &quot;ומ-&quot; סוכנות הידיעות הלאומית דה לה משוכלל ונדיר &quot;צמיחת תכנית 2012 (ANR-אמה-050). PH נתמכה על ידי la &quot;ליגת העל contre le סרטן&quot;.

הערה: כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לניסויים בבע&quot;ח והאתיקה הצרפתית ומאומתים על ידי &quot;הגנת שירות et סנטה Animales, Environnement&quot; עם מספר-75-2065. גודל מדגם נבחרים כדי להבטיח שחזור של הניסויים, ובהתאם ל3R של רגולציה אתיקה של בעלי החיים. 1. הכנת העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלחוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקופה קצרה של הדמיה (שעות פחות מ 1), לטשטש את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 200 μl של תמיסת מלח המכילה קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) וXylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לתקופה ארוכה יותר של הדמיה (עד 4 שעות), לטשטש את העכבר עם שאיפה של 2.5% isoflurane מתאדה בתערובת 70/30 של O 2 / N 2 O, דרך מסכה מותאמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: בדרך זו מספקת לחוסר הכרה יציבה יותר ותמנע זריקת intraperitoneal סדרתי של תרופות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים, לבדוק חוסר הכרה באמצעות גירוי של כרית כף הרגל עם מצבטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת כלי דם / כתמים נוספים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים כלי דם: להזריק לוריד בוריד הזנב, 200 μl של Rhodamin-Dextran (2 מד&quot;א, 10 מ&quot;ג / מיליליטר במאגר מלוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים נויטרופילים: להזריק 2 מיקרוגרם של Ly6G-PE (שיבוט 1A8) בתמיסת מלח לוריד בוריד הזנב 100 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבוע, השתמש בעל stereotactic מותאמת אישית המותאם למיקרוסקופ ולמכשיר אינהלציה גז ההרדמה. הערה: בעל sterotactic היא תמיכת מתכת עם שני סוגריים לוחית מתכת, אחד להיות קבוע ונשלפים וישימה אחרים, להדק את ראשו של בעל החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הראש של העכבר בין לוחות התמך כדי להבטיח בידוד מתנועות נשימה. הדק את האוזניים בין צלחות וראש למתוח את sk שמירהב. בדקו יציבות ורווחה נשימה של בעלי החיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרקפת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בזהירות אתנול 70% להרטיב את השיער של הקרקפת עם המוליך סטרילי, הימנעות ממגע עם העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור עם מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר באופן מלא את הקרקפת מאחורה של העצם הקודקודית לעצם הקדמי. הרחק עד 3 מ&quot;מ מעיניים ואוזניים למניעת דימום נרחב. הסר את רקמת חיבור הרופפת המכסה את הגולגולת (קרום עצם). לשטוף את השיער שנשאר עם מגבת נייר ספוג-PBS חם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת טבילה להגדיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבק טבעת גומי בקוטר 18 מ&quot;מ עם דבק כירורגים ישירות על הגולגולת באמצעות מחט מד קטנה לשלוט הפצה. מדביק את כל הפריפריה של טבעת הגומי כדי למנוע דליפה (30 μl צריך להיות מספיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הגולגולת מתחת לזירה בפעם האחרונה עם מגבת נייר ספוג-PBS ולאחר מכן להוסיף 37 ° C PBS לטבילה של שלמהגולגולת. הוסף ירידה של 0.9% NaCl פתרון או משחת עיניים ספציפי בכל עין של העכבר, כדי למנוע יובש בעיניים. גרור את בעל stereotactic תחת המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ למקם את השדה באמצעות עינית המיקרוסקופ באמצעות העברת ישירה. </li></ol></li></ol> 2. רכישת הדמיה שני פוטונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ multiphoton יחד עם Ti: לייזר גביש ספיר, המספק פולסים 140fs של אור NIR, באופן סלקטיבי מתכונן מ -680, ל- 1,080 ננומטר, ומאפנן acousto אופטי לבקרת כוח הלייזר. השתמש בתצורה כולל 3 גלאים חיצוניים-descanned שאינו (NDD) (המאפשרים הקלטה בו זמנית של 3 ערוצי ניאון) עם שילוב של 2 מראות dichroic (565 ננומטר ו690 ננומטר), 565/610 500/550 ומסנני bandpass, ו 485 מסנן קצר לעבור, עם Apochromat תכנית × 20 (NA = 1) מטרת טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תא החימום כדי לאפשר homeothermy הטוב של anaesעכבר thetized., הערה: טמפרטורה עשויה להיות מוגדרת 1 שעה לפני פגישת ההדמיה ליציבות טובה יותר. במקרה שלנו, 32 ° C נבחר כדי לקבל את טמפרטורת גוף אופטימלית של העכבר המורדם (36-37 ° C) ומתוחזק עד 4 שעות. טמפרטורה זו עשויה להיות מותאמת למערכת בשימוש (בדיקה דיגיטלית יכולה לשמש כדי לבדוק נקודה זו). בנוסף, תא החימום משמש הוא כהה / שחור ומכסה חלק מהמערכת (היעדים וצלחת ממונעת), כדי למנוע זיהום אור חיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את טי: ספיר הלייזר, ולאחר מכן מערכת מיקרוסקופ כולה. הפעל את תוכנת הרכישה. הגדר את טווח אורך גל לייזר 870 ננומטר. בחר NDD המתאים להקלטה. הערה: במקרה שלנו, דור שני הרמוני (SHG) 19 וחלבון ציאן ניאון (ECFP) מזוהים על ידי NDD לאחר לעבור סינון קצר 485. ECFP גם זוהה על ידי NDD לאחר מסנן 500/550 bandpass וrhodamin-dextran הוא זוהה על ידי tהוא NDD לאחר מסנן 565/610 bandpass. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקודת ההדמיה &quot;רכישה חי&quot; של התוכנה והשימוש בשליטה כיוונית מיקרוסקופ, לשנות את הפוקוס על אזור עם אות ECFP וRhodamine. הגדר את כוח הלייזר עד למינימום כדי להשיג יחס אות לרעש הטוב ביותר עם תמונה-נזק מינימאלי. הערה: הגדרת ההספק משמשת משתנה בהתאם לעומק של האזור של עניין. בדרך כלל הגדרות AOM מוגדרות כ -20%, המייצג את כוח לייזר מעבר למטרה כ -15 מילי-ואט. עדיף להגדיל את הכח הרווח על PMTs לכל NDD להפחית צילום הלבנה וצילום נזק. הגדרות רכישה אופייניות הן סריקה יחידה עם פיקסל להתעכב זמן של 1.58 מייקרו-שני, ורזולוציה של 512 x 512 פיקסלים עם הגדלה של 1.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורים נבחרים של ריבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פרמטרים הקלטה נקבעים, להשתמש בו שוב את פקודת הרכישה &quot;חי&quot;,ותסקור את הרקמה לבחור (x, y, z) שדה רצוי להיות במעקב בזמן אמת. הערה: בדרך כלל, בחרנו שדה כולל שני כלי דם ובאזורי parenchymal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשם השדה עם פקודת התוכנה &quot;עמדה&quot;. הערה: פקודה זו משננת x, y, z קואורדינטות של שדות רחוקים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהירשם תחומים נוספים של ריבית (עד 3) באותו האופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר Z- מחסנית 3D עם פקודת התוכנה &quot;Z- המחסנית&quot; על העמדה שיננה הראשונה בהתאם להיקף הנדרש עם הגדלה בחרה. לשנן עמדה עמוקה ראשונה, ולאחר מכן המיקום הגבוה ביותר. לנרמל כוח לייזר עם העומק. הערה: להדמית שדה הנלווה מרובה, אנו רוכשים 5 פרוסות מופרדות על ידי z-שלבי 3 מיקרומטר עבור כל שדה לרכישה בהיקף של 12 מיקרומטר עובי. הגדרות אלה עשויות להיות מותאמות לסוג של תא למד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת השקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר220; זמן סדרה &quot;פקודת התוכנה ולבחור את משך הזמן של מרווח זמן ומספר המחזורים. בגין הזמן לשגות הדמיה לפי הזמן לשגות ומשך הזמן הנדרש על ידי בחירת &quot;להתחיל ניסוי&quot; פקודת התוכנה. הערה: במקרה שלנו, אנו רוכשים כרך אחד כל שנייה 30 במהלך 60 מחזורים מייצגים בזמן אמת 30 דקות. זמן לשגות קטן יותר ניתן לבצע כדי לעקוב אחר גלגול תא מהיר בכלי הדם. במקרה זה-ערימת z דקה יותר ולא יותר מ -2 תחומים שונים ניתן להקליט באותו הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב שוטף אחר להגדיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לפקח על בעלי החיים כדי לוודא שהוא מחוסר הכרה. הערה: טלטול של שפם או רגליו של בעל החיים הן אינדיקטורים של תחייה. במקרה הנשימה של בעלי החיים היא קופצנית, כמות isoflurane יכולה להיות מופחתת במקצת. להיסחף רקמה חזקה במהלך הרכישה הוא אינדיקטור של תחיית עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא המטרה הוא שקוע כראוי. לחדש 37 ° C betwee PBSn שתי רכישות (30 דקות). הערה: היעלמות מתקדמת של אות במהלך הרכישה היא אינדיקטור של דליפת PBS. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיומו של הליך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שקטעי הווידאו הנדרש נרשמים, להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם במהירות לפני ההחייאה. הערה: ריפוי פצעים מוביל להיווצרות של גלד ב -24 עד 48 שעות המגבילה את האפשרות לבצע הדמיה אורך. </li></ol></li></ol> ניתוח 3. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון דריפט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת Imaris Bitplane למעקב אוטומטי 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה ברצף 3D על Imaris. בחר &quot;נקודה&quot; הפקודה, וליצור מעקב ידני (לחיצת עכבר + shift) לכל נקודות הזמן למינימום של 4 נקודות עיגון שונות, במידת האפשר מופץ בצורה הומוגנית בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל התיקון להיסחף באמצעות הפקודה &quot;להיסחף נכון&quot; בכרטיסייה &quot;מסלול עריכה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק עבור tהוא האיכות של התיקון בx, y ובמיוחד בz כדי למנוע התלבטויות artefactual. הערה: אם התיקון אינו משביע רצון, לנסות נקודות עיגון אחרות או להוציא וידאו מהניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;להוסיף כתמים חדשים&quot; הפקודה ובחר &quot;כתמי מסלול לאורך הזמן&quot; הגדרת אלגוריתם. עבור לצעד הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הליך מעקב תא אוטומטי או על כל הערוץ של עניין באמצעות פקודת &quot;ערוץ המקור&quot;. קוטר אובייקטי סט (כלומר, תאים) עד 10 מיקרומטר. עבור לצעד הבא. הערה: הבחירה תהיה תלויה בהבחנה בין אובייקטים וספציפיות של האות הנמדדת. בקיצור, מעקב אוטומטי על כל הערוץ אפשרי רק אם האות זוהתה היא ספציפית לאובייקט של עניין. מכיוון שגם SHG וECFP מזוהים על ידי NDD לאחר מסנן 485 לעבור קצר, מעקב יהיה יותר ספציפי ויעיל באמצעות אות ECFP נרשמה על ידי NDD לאחר 500/550 מסנני bandpass. אשכול או אובייקטים צפופים, ידרשו בחירה ידנית של אובייקטים בודדים דומים לצעד 3.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג מסנן &quot;איכות&quot;, לקבוע את הסף להוציא מעקב של אובייקטים נוקבים. עבור לצעד הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;בראונית האלגוריתם Motion&quot; עם פרמטרים מדויקים של &quot;מרחק מקס&quot; ו- &quot;גודל פער&quot; בין שתי נקודות. לאמת דור מסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמסלולים מחושבים באופן אוטומטי, בחר סוג המסנן &quot;משך מסלול&quot;, לקבוע את הסף לחסל מסלולים קצרים יותר מ -120 שניות (המייצגות את 4 נקודות זמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חובה: אחרי מעקב אוטומטי, לבדוק את האיכות של השירים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוש על סרגל הזמן כדי לבדוק שחפצי מעקב נתיבי המסלול. אם לא, השתמש באפשרויות של תיקון נקודת מסלול הזמינות בכרטיסייה &quot;ערוך&quot;: מחיקת שירים כוזבים או לא תקינים עם &quot;למחוק&quot; הפקודה (למחוק את כל p מסלולoint בנפרד באמצעות פקודת &quot;ניתוק&quot;). אם נתיב מסלול הוא רציף, להוסיף נקודות חסרות זמן (לחיצת עכבר + shift), לבחור את כל הנקודות במסלול מסוים, ולהשתמש &quot;להתחבר&quot; הפקודה בכרטיסייה &quot;מסלול עריכה&quot;. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;הסטטיסטיקה&quot; בפקודה &quot;העדפות&quot;, לבחור את הפרמטרים הדינמיים של עניין ברשימה. בחר &quot;לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים לקובץ&quot; הפקודה ולשמור את קובץ Excel שנוצר. הערה: פרמטרים דינמיים כמה ישירות מתקבלים מהתוכנה כגון אורכי מסלול, מהירות רגעית, מהירות ממוצעת, ולעקוב אחר יושר. מקדם תנועתיות 6, 20 ניתן לקבוע אך אינו מסופקים ישירות על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תא, לחשב את הממוצע של ההתקות לכל תקופת זמן (אורך יממה) (לסרט הזמן לשגות 30 שניות, אורך היממה תהיה 30, 60, 90 שניות, וכו &#39;).עלילה המרושעת של העקירה רבועה כפונקציה של מרווח הזמן. להשיג מקדם תנועתיות ידי חישוב השיפוע של חלק הליניארי של העקומה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP+double-transgenic+mice.">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).</li><li>Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+and+macrophages+regulate+immunity+through+dynamic+networks+of+survival+and+cell+death.">Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death.</a> J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19, 71-82 (2003).</li><li>Robbins, C. S., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+monocyte+subsets+in+steady+state+and+inflammation.">The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+and+progenitor+cells+induce+monocyte+emigration+in+response+to+circulating+toll-like+receptor+ligands.">Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands.</a> Immunity. 34, 590-601 (2011).</li><li>Jacquelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+reduces+Ly6Chigh-monocyte+motility+within+and+release+from+the+bone+marrow+after+chemotherapy+in+mice.">CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice.</a> Blood. 122, 674-683 (2013).</li><li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites.">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).</li><li>Milo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+reveals+promiscuous+crosspresentation+of+blood-borne+antigens+to+naive+CD8++T+cells+in+the+bone+marrow.">Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow.</a> 122, 193-208 (2013).</li><li>Cavanagh, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+bone+marrow-resident+memory+T+cells+by+circulating,+antigen-bearing+dendritic+cells.">Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells.</a> Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8++T+cells.">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li><li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+structure,+function,+and+histology+of+the+bone+marrow.">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J Exp Med. 188, 465-474 (1998).</li><li>Rashidi, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+mouse+bone+marrow+reveals+differential+niche+engagement+by+quiescent+and+naturally+activated+hematopoietic+stem+cells.">In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells.</a> Blood. , (2014).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li><li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes.">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li><li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence.">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs.">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).</li><li>Yost, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+neutrophil+extracellular+trap+(NET)+formation:+a+novel+innate+immune+deficiency+of+human+neonates.">Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates.</a> Blood. 113, 6419-6427 (2009).</li><li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus.">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nat Med. 19, 107-112 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

נקודות הקריטיות של in vivo מתודולוגיה ההדמיה הן להבטיח את היציבות של המיקוד במטרה למקסם את משך הזמן של הדמיה וכדי למזער את סיכון לזיהום חיידקים ודלקות, אשר עשוי להשפיע על הדינמיקה של תאי הדלקת. הדמיה של מוח עצם גולגולת כדלקמן מטרות אלה כניתוח שבוצע כדי לקבל גישה למח העצם הוא מינימאלי. השימוש בחומר החיטוי וסטרילי הוא חיוני כדי להגביל את הסיכון לזיהום שעלול לגרום להפרעות בהומאוסטזיס תא. פיתוחו של בעל stereotactic עשוי להיות מאתגר ודורש התאמה אישית ספציפית לכל מערכת (מרחק בין במה אובייקטיבית וממונעת של המיקרוסקופ, שימוש במכשיר אינהלציה גז להרדמה). חשוב לקבל את הראש של העכבר כאופקי ככל האפשר לגישת משטח הדמיה רחבה יותר. ברגע שבעלי החיים נמצאים בעמדה, סביר להניח שכמה דקות יכולות להיות required להשיג יציבות טובה של מטוס המוקד. לכן, מומלץ לבדוק להיסחף רקמה לפני השקת הקלטת הרכישה. בגלל תהליך זה ביחד עם מבחר של אזורים של עניין יכול להימשך זמן מה, זה מומלץ גם לבדוק באופן קבוע כי בעלי החיים הוא לא מודע אם Ketamin / Xylazin היה בשימוש, וכדי לבדוק אם טבילה נכונה של המטרה כדליפה ואידוי יכול להתרחש. מיקום הטוב של טבעת הגומי בגולגולת מייצג עוד צעד קריטי בתהליך. דבק cyanoacrylate מספק תוצאות טובות במונחים של יציבות ואיטום, אבל צריך למנוע העמסת יתר של דבק, שיכול לכסות את גישת הגולגולת ובלוק לאזור של עניין של הרקמה. היתרון של טבילה ישירה של הגולגולת ללא coverslip זכוכית הוא להשיג גישה לאזורים עמוקים יותר של העצם. בנוסף, מאז הגולגולת היא לא משטח רגיל, זה לא יגביל את אזור ההדמיה לconמשטח טקט בין הגולגולת וcoverslip, המאפשר תחום הדמיה רחב, כפי שמוצג באיור 1. לכל טכנולוגיות ההדמיה, הבחירה בין מהירות רכישה ואיכות רזולוציה היא פשרה. לכן, המספר והאיכות של תמונות ליחידת זמן מוגבל, והבחירה תלויה בשאלה המדעית התייחסה. בדרך כלל, מונוציטים כלי דמם מהר מתגלגלים תאים, ואילו מונוציטים parenchymal הם ניע או נייחים איטיים. מעקב מדויק של תאים מתגלגלים דורש רזולוציה גבוהה יותר עת רכישה, כפי שמוצג באיור 2. שיעור הדמיה גבוהה לתאים נייחים הוא x חסר תועלת וגבוה, y, z רזולוציה יכולה להיות מועדפת לניתוח פעילות מִזדַקֵר של דנדריטים למשל. תאים מהיר ידרשו נפח עבה כדי לקבל מעקב ארוך יותר של עקירתם בz. העקירה מרובעת הממוצעת כפונקציה של הזמן אינה מסופקת על ידי Imaris התוכנה. פרינציפle של ייצוג זה מבוסס על העובדה ש, לאובייקט שנסע בליסטי ללא כל מפגש או התכווצות מבנית, המרחק זה נסע יהיה פרופורציונאלי למרווח הזמן (איור 2 ד). כך הליניאריות של המדרון מציינת הליכה אקראית בסביבה שאינה מוגבלת. בניגוד לכך, צורה אסימפטוטית של העקומה תשקף עקירה מוגבלת לאורך הזמן של אוכלוסיית התא. היתרון השני של חישוב זה הוא שמהירות לעתים בהערכת על ידי עקירת artefactual של מרכז המסה. הדבר חשוב במיוחד לתא ניעתי איטי עם פעילות מִזדַקֵר. לפיכך, חישוב של מקדם תנועתיות על ידי שיפוע העקום מחושב על ידי רגרסיה ליניארית מצביע על תזוזה אמיתית של זמן cellover 21. צביעת Ly6G in vivo ממחישה את האפשרות להוסיף פרמטר חדש של ניתוח במהלך תהליך ההדמיה (איור 3 </strong&gt;). יש לנו להשתמש בטכניקה זו כדי להכתים חדירת נויטרופילים כלי דם לפצע בעור, ולא הבחנו בפגם בניידות שלהם מצביע על שום שינוי תפקודי (אל Rodero et in press). למרות שיותר מ 98% של נויטרופילים כלי דם מסומנים כראוי, ההכתמה של נויטרופילים מח עצם היא פחות יעילה, ואת עוצמת הקרינה הממוצעת בחום מופחתת, המצביעה על גישה מופחתת של הנוגדנים כלפי parenchyma מח עצם (מידע לא מוצג). dextran Rhodamin, נקודות קוונטיות, או צבעים ספציפיים אחרים של תאים אפופטוטיים או נימקי כגון DAPI, יודיד Propidium, Sytox 22, או כתב ניאון עבור פונקציות תא כגון ייצור של מיני חמצן מגיבים 23, ניתן להוסיף לוריד דרך וריד הזנב במהלך הדמיה תהליך ומציע הזדמנות טובה לכמת תכונות פונקציונליות כגון מוות של תאים, phagocytosis ומלכודת תאית נויטרופילים. Mazo et al 12 יפה השתמש בשני צבעים שונים של כלי דםעם משקל מולקולרי נמוך וגבוה לparenchyma ניגוד טוב יותר וכלי דם. הבחירה של צבע הניאון היא קריטית כדי לאפשר רכישה קשורה של כתבי ניאון השונים. ואכן, גל העירור ייבחר בהתאם כדי לקבל את הפשרה הטובה ביותר בין כל צבעי הניאון משמשים. הפרוטוקול המשמש במסמך זה מאפשר לנתח in vivo הפעילות הביולוגית של תא תא, מחקר שבם היה כל כך קשה בהרבה. ניתוח היסטולוגית של רקמת מוח עצם בדרך כלל דורש הכנת decalcification העצם ארוכה כדי לאפשר דק סעיף, וזה רק מספק תצוגה סטטית של הרקמה. התצוגה דינאמית מדגישה את שער חליפין בין תא parenchyma וsinusoids מח עצם. תהליך מהיר זה הוא צעד חיוני כדי לפענח כדי לקבל הבנה טובה יותר של מנגנון גיוס תא על אות דלקתית 5 או נפשית מראש כימותרפיה myeloaplasiveמשטר 6. יש לנו דיווח אירוע של תא intravasation 6 אך תהליך זה הוא בקושי לזיהוי בשל התדירות הנמוכה במצב יציב. עם זאת, סביר להניח שיהיה משופר על איתות דלקתית. קולטנים chemokine כגון CCR2, CX3CR1 או CXCR4 הם מעורבים מאוד בתהליך של intravasation, ומכאן השימוש בפסילה גנטית של קולטנים אלה אמורים לספק תובנות יסוד רומן במסלולים של נדידת תאים

The bone marrow plays a central role in hematopoiesis and represents the main reservoir of monocytes that constitutively recirculate between the blood and the medullar parenchyma, renew the pool of circulating monocytes with a short life span 2,3 and participate in the reconstitution of the steady state tissue-macrophages and dendritic cells 4. During inflammation or after transient aplasia, monocytes are actively mobilized from either the bone marrow or the spleen 5, 6, 7 and colonize inflamed organs. Several chemoattractant axis have been involved in the process of myeloid cell mobilization from the bone marrow 8, 5, 6,9. Beyond the myeloid compartment the bone marrow is also an important site of T lymphocyte priming 10 and a niche of immunological memory 11,12. Thus, this tissue is central for numerous investigations in the field of hematology and immunology. Our knowledge on the structural organization of medullar myeloid cells mainly arises from the analysis of histological section of fixed tissues 13. This static view does not allow for a study of the cellular exchange dynamic between the different compartments of the bone marrow, which is the basis of its functional activity.
Intravital imaging constitutes an important biological input in the study of cell mobility, cell adherence and cell-to-cell interactions, which were previously described only from in vitro systems. Technical challenges for proper intravital imaging include the ability to reach the tissue of interest in an optical point of view, and to maximize its isolation from physiological (breath, muscle or peristaltic contractions) or mechanical drifts (tissue disruption and extension following surgery, and exposure to microscope objective as well as temperature and vascular/oxygenation perturbations). Microscopic drifts may limit the ability to keep the focus a long time and could introduce artifacts in the quantification of cell motility. One alternative, validated for several tissues to reduce these technical difficulties, is to work on explanted tissue incubated in a thermostated and oxygenated medium; however, complete disruption of the lymphatic and vascular circulation may be problematic. Intravital imaging of skull bone marrow has several advantages concerning these issues. Firstly, it requires minimal surgical action. Secondly, thickness of the bone in this region allows direct visualization of bone marrow niches without abrasion, thus reducing physiological perturbations. The medullar network can be imaged in the parasagittal region of the bone; however the sinusoids are more visible in the fronto-parietal area where the bone matrix is thinner12,14. 
Intravital imaging relies on the availability of the most accurate fluorescent reporter tagging the population of interest. In vitro labelling of purified cell population before adoptive transfer led to important characterization of hematopoietic stem cell niches 15 or bone marrow endothelial microdomains favouring tumor engraftment 16, and provided several fundamental inputs on key concepts in immunology 17 . However, this approach usually requires hundreds of thousands of cells to get a chance to detect them afterwards in vivo. This could be explained by the high mortality rate following staining, the dilution in the whole body and the change in the activation state, which might lead to biased homing. Endogenous tagging from transgenic mouse system greatly overcomes these limitations and has allowed to image the behaviour of endogenous osteoblast 8, megakaryocytes 18 or myeloid-lineage subsets 6 . Nevertheless, one has to be cautious when considering the specificity of the fluorescent reporter among the studied subset. 
The Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, called MacBlue mouse 1, is a valuable transgenic system to study medullar monocytes with real time imaging 6. Intravenous injection of high molecular weight rhodamin-dextran distinguishes the medullar parenchyma from the vascular sinusoid network of the bone marrow. Using this approach, it is possible to track the monocyte behaviour in the different medullar compartments in a specific physiopathological context of interest. Furthermore, we propose an additional strategy to compare monocyte dynamics with that of neutrophils through in vivo labelling using a specific antibody.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:237px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ketamin</td>
			<td style="width:171px;">Merial</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100mg/mL, anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Xylazin</td>
			<td style="width:171px;">Bayer HealthCare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10mg/mL, anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isofluran</td>
			<td style="width:171px;">Baxter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2.5%, anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">O2/NO2</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>70/30 mixture, anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">Rhodamin-Dextran</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2MDa, 10mg/mL, Vascular staining</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:297px;">Ly6G-PE</td>
			<td style="width:171px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>clone 1A8, neutrophils staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Stereotactic holder</td>
			<td style="width:171px;">Home made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ethanol 70%</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sterile scissors and nippers</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rubber ring</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>18mm diameter, surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glubran 2</td>
			<td style="width:171px;">Queryo Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Surgical Glue, rubber ring fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Small gauge needles</td>
			<td style="width:171px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire crystal laser&#160;</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>140fs pulses of NIR light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zen 2010</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Acquistion Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris Bitplane&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis Software, 3D automatic tracking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:171px;">D. Dutscher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thermostated chamber</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>intravital imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking mouse bone marrow monocytes in vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

מבנה גולגולת עכבר מציע הזדמנות טובה ללמוד את הפיסיולוגיה מח עצם על ידי ההדמיה intravital. להיות רזה באזור הקדמי הקודקודית העצם, ניתן לקבל גישה לנישות medullar ללא שחיקה של העצם. איור 1 מייצג שדה 2D רחב של הגולגולת של עכבר מהונדס MacBlue. מטריצת העצם מורכבת בעיקר של קולגן אני בקלות לזיהוי על ידי SHG 19. הזרקה של rhodamin-dextran מכתימה את רשת כלי הדם של מח העצם ומאפשרת לזיהוי נישות מח עצם parenchymal בין מטריצת העצם וכלי 14. תאי ECFP מופצים בשני התאים של מח העצם, אך נעדרים ממטריצת העצם. מונוציטים מסווגים באופן ידני בהתאם למיקומם בתוך הרקמה. מונוציטים כלי דם מוגדר כאשר כל התא הוא בתוך כלי הדם, תוך התעלמות מהגודל של כלי השיט. רק venules איסוף הגדולה אינן נכללתnalysis. מונוציטים parenchymal מוגדר כאשר התא נמצא בין כלי הדם ומטריצת העצם. זמן לשגות הדמיה של אזור מסוים של עניין (וידאו משלים 1 ו -2) מאפשרת לחישוב מסלול תא הבודד לאורך זמן לאו כלי דם (איור 2 א) או parenchymal מונוציטים (איור 2). אורך המסלול מראה כי תצוגת מונוציטים parenchymal מופחתת עקירה לעומת מונוציטים כלי דם. ניתוח של העקירה לאורך הזמן משווה את המהירות הממוצעת של מונוציטים בשני התאים (איור 2 ג). העקירה מרובעת הממוצעת כפונקציה של הזמן היא מדד של המידה המרחבי של תנועה אקראית. מקדם תנועתיות נקבע על ידי השיפוע של חלק הליניארי של העקומה ומספק מושג טוב יותר של עקירת התא (ראה סעיף דיון). מקדם תנועתיות של מונוציטים כלי דם (MC = 71μm² / s) הוא גבוה יותר מאשר coefficie תנועתיותNT של מונוציטים parenchymal (MC = 4.4μm² / s). הרזולוציה של רכישת הזמן צריכה להיות מותאמת למהירות הממוצעת של התאים. מונוציטים כלי דם רולינג יכולים לעשות עקירה חשובה בתוך עיכוב זמן קצר. למעקב תא מדויק יותר, הפחתת המרווח של רכישת הזמן עדיף. איור 3 מציג איור של מעקב מונוציטים עם שני בזמן רזולוציות שונות. זמן מרווח של 30 שניות מפחית את הדיוק, כמו גם את אורכו של המסלולים (בקו מקווקו ירוק) בהשוואה לזמן מרווח 10 שניות. לבסוף, תרשים 4 מתאר את האפשרות לנתח משנה תא אחר במקביל למונוציטים. Ly6G הוא סמן ספציפי של נויטרופילים עכבר הבוגרים. ההזרקה של אנטי-Ly6G בשילוב עם fluorochrome (במקרה Phyco-erythrin זה) 5 דקות לפני נויטרופילים כתם רצף הדמיה ישירות in vivo. גישה זו מספקת עמומה נוספת<html> ension של ניתוח ואת האפשרות להשוות את ההתנהגות של תת תא השונים. גישה כזו יכולה לשמש להגדרה תת בתאי מונוציטים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig1highres.jpg" /> איור 1. שדה רחב של ארגון מח עצם גולגולת. בתמונת vivo שני פוטונים סריקת לייזר מיקרוסקופי של מוח עצם מצב יציב גולגולת מעכבר MacBlue. כלי דם (באדום) מוכתמים על ידי הזרקה לשווא זנב של דקות 2MDa Rhodamin-Dextran 5 לפני פגישת הדמיה. העצם דמיין ידי דור השני הרמוני (כחולה). ECFP + מונוציטים (ציאן) ממוקמים בתוך נישות parenchymal (אזורים כהים בין כלי דם ועצם) ובתוך כלי הדם. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52476/52476fig1large.jpg" target="_blank">לוחצים כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig2highres.jpg" /> מעקב בזמן אמת איור 2. תא. שבילי מסלול נציג לאורך הזמן של מונוציטים בתוך () בכלי הדם ו( B) parenchyma. מסלולים (קו ירוק) עבור כל תא נוצרים באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כתמים אדומים מייצגים את מרכז מסה של תאי מעקב. (C) Mean השוואת מהירות בין מונוציטים כלי דם וparenchymal. ניתוח סטטיסטי מאן-ויטני בוצע, *** מייצג p &lt;0001. (ד) Mean עקירה בריבוע (MSD) כפונקציה של הזמן מיוצג על מונוציטים כלי דם וparenchymal. עקומת Asymptotic מציינת את העקירה המאולצת של התאים לאורך זמן, ואילו עקומה ליניארית מצביעה על הליכה אקראית בסביבה שאינה מוגבלת. מקדם תנועתיות מצביעה על מידת תזוזת תא והוא נקבע על ידי השיפוע של ג<html> urve מחושב על ידי רגרסיה ליניארית. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52476/52476fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig3highres.jpg" /> איור 3. ברזולוציה זמן מרווח במחקר של מונוציטים מתגלגלים. רצפי תמונת נציג מראה כי רזולוציה זמן מוגברת משפרת את הדיוק של מסלול התא מתגלגל. (עד) רצף תמונות במרווחי זמן של 10 שניות. (Down) רצף תמונות במרווחי זמן של 30 שניות. האיכות של נתיב המסלול משופר ואת הסיכון לשוקל שני תאים שונים לאותו או ההפך מצטמצם. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52476/52476fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> s &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig4highres.jpg" /> איור 4. בשיתוף לוקליזציה vivo של נויטרופילים ומונוציטים medullar. נתון זה ממחיש את האפשרות לזיהוי תת תא אחר בגוף חי במקביל עם מונוציטים, על ידי הזרקת נוגדנים חד שבטיים מסוימים בשילוב עם fluorochrome. 2 מיקרוגרם של נוגדן Ly6G-PE כבר הזריק לוריד 5 דקות לפני ההדמיה מח עצם הגולגולת של עכבר MacBlue. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52476/52476fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> וידאו משלים 1. התנהגות נדידה של מונוציטים parenchymal. בvivo 3D הדמיה של פעילות נדידת המצב היציב של מונוציטים בparenchyma מח עצם גולגולת של עכבר MacBlue. אות ECFP + היא בצבע תכלת. נתיבי נדידה עבור כל תא (נקודה אדומה) מופיעים בירוק. = &quot;Jove_content&quot;&gt; התנהגות נדידת וידאו 2. משלימה של מונוציטים כלי דם. בvivo 3D הדמיה של פעילות נדידת המצב היציב של מונוציטים בכלי הדם במח עצם גולגולת של עכבר MacBlue. אות ECFP + היא בצבע תכלת. (2M &#160; Da) rhodamine-dextran הוזרק לפני פגישת ההדמיה להבחין בכלי הדם במח העצם (אדום). נתיבי נדידה עבור כל תא (נקודה אדומה) מופיעים בירוק.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo at JoVE.com

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

tracking-mouse-bone-marrow-monocytes-in-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

9.5K Views.  Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7. Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism. 

Video: Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...