זיהוי וניתוח אוטומטיים של תוכנת Exocytosis יאפשרו למשתמש לזהות באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים ורצפי תמונות TIRF של פלואורופורים רגישים ל- pH. זה גם באופן אוטומטי פלט תכונות של exocytosis כגון הפצה מרחבית או התדירות, כמו גם תכונות בודדות של אירועים אקסוציאטיים, כגון מחצית החיים או שינוי פלואורסצנטיות על הרקע. בנוסף, נכללת אפשרות לסווג אירועים אקסוציאטיים לארבעה מצבים של אקסוציטוזיס, שתוארו בעבר בספרות.
כדי להשתמש בתוכנת זיהוי וניתוח אוטומטיים של Exocytosis, תחילה תלחץ על לחצן חפש ערכת נתונים, ותנווט למקום שבו הנתונים שלך מופקדים, וברצונך להכניס לתיקיה הנקראת נתונים גולמיים. קבצי הנתונים שלך יאכלסו את הרשימה באופן אוטומטי כאן, ותוכל לתכלית מספר כלשהו של קבצי נתונים בתיקיה זו. לאחר מכן, תרצה לבחור ספריה שעבורה קבצי הניתוח שלך יופקדו.
הנה, בחרתי ספריה שנקראת מבחן. מומלץ גם למלא את קצב הפריימים של התמונות שלך, כמו גם את גודל הפיקסלים. כאן קצבי הפריימים שלי הם מאה אלפיות השנייה למסגרת, גודל הפיקסלים שלי הוא שמונה ננומטרים.
לבסוף, תצטרך קבצי מסכה על מנת להפעיל את זיהוי אוטומטי וניתוח של תוכנת Exocytosis. באפשרותך להשתמש בלחצן יוצר המסכות הכלול כדי ליצור באופן אוטומטי קבצי מסיכה מקבצי הנתונים שלך. מחוון הריצה יהפוך לצהוב ולאחר מכן יחזור לירוק כאשר יוצר המסכות יסיים לפעול.
המסיכה שלך תופקד בתיקיה חדשה הנקראת קבצי מסיכה בספריה שבחרת. ושימו לב, קבצי מסיכה יאכלסו את הרשימה באופן אוטומטי כאן. ברצונך לבדוק שקבצי המסכה שלך מיוצרים כראוי עבור קבצי הנתונים שלך, ובאפשרותך לעשות זאת על-ידי הדגשת כל אחד מקבצי הנתונים ברשימה, כמו גם את קובץ המסכה המתאים.
המסגרת הראשונה של קובץ הנתונים תופיע וקובץ המסיכה שנבחר יופיע גם כן. הנה. אנו יכולים לראות כי קבצי המסכה שלנו מתאימים לניתוח בהישג יד. ייתכן שהמשתמש יסופק גם קבצי מסיכה בנפרד.
כאשר ברצונך ליצור קובץ מסיכה מקובץ נתונים נוכחי אנו ממליצים להשתמש בתמונה J.In כדי לעשות זאת, פתח תחילה את התמונה בתמונה J שממנה ברצונך ליצור קובץ מסיכה. לאחר מכן ניתן להשתמש בכלי בחירת המצולעים כדי להתחיל ליצור קובץ מסיכה על-ידי לחיצה על קצה התא. לאחר השלמת המסיכה, לחץ פעמיים כדי להתחבר למצולע כולו.
לאחר השלמת פעולה זו, תערוך, תבחר ותיצור מסיכה. תיווצר מסיכה הפוכה. ברצונך לשמור קובץ מסיכה זה בשם זהה לשם קובץ הנתונים ואחריו _mask_file.
כעת, אם אתה מספק קבצי מסכה מותאמים אישית משלך, חשוב ליידע את תוכנת הזיהוי האוטומטית היכן ממוקמים קבצי המסכה הללו. כדי לעשות זאת, תלחץ על לחצן חפש קבצי מסיכה ותנווט לספריה עם קבצי המסיכה בתוכו. קבצי המסכות החדשים יאכלסו את הרשימה כאן.
חשוב שתהיה לך מסיכה עבור כל קובץ נתונים לפני שניתן יהיה להפעיל את הניתוח. עכשיו, ברגע שיש לך ערכת הנתונים שלך טעון, קבצי המסכה שלך, קצב הפריימים שלך ואת גודל הפיקסלים מותאם כראוי, ו בספריה שנבחרה, אתה יכול סוף סוף להחליט אם אתה רוצה לכלול סיווג כחלק מהניתוח שלך. אם תחליף את לחצן הסיווג, בנוסף לזיהוי אירועים אקסוציאטיים, כל אירוע אקסוציאטי יסווג לאחת מארבע מחלקות.
לאחר שהחלטת על אופן הפעלת הניתוח שלך, תוכל להתחיל בניתוח על-ידי לחיצה על לחצן הניתוח. מחוון הריצה יהפוך לצהוב כדי לציין שהניתוח מתבצע ויחזור לירוק עם סיום הניתוח. לאחר השלמת הניתוח, כפי שצוין על-ידי מחוון ההפעלה המשתנה מצהוב לירוק, תבחין שתיקיית קבצי נתונים חדשה הופיעה בספריה שבחרת.
בתוך תיקיית קבצי הנתונים, תמצא קבצי ניתוח המתאימים לכל ערכת תמונה בניתוח שלך. בנוסף, קובץ סטטיסטיקת תאים המכיל מידע סיכום כגון תדירות האקסוציאטוזיס עבור כל אחת מערכות התמונה נמצא כאן. עבור כל ערכת תמונות, יש לך קובץ מעקב פלואורסצנטי, המכיל מידע על מיקום X, מיקום Y ומספר מסגרת עבור המקום שבו הם מתרחשים אירועים אקסוציאטיים.
בנוסף, הפלואורסצנטיות הממוצעת באזור מעניין סביב כל אירוע אקסוציאטי מוצגת הן לפני, במהלך ואחרי אקסוציאטוזיס. בנוסף, יש גם קובץ מעקב, המכיל מידע דומה של מיקומי X, Y וטמפורלי. עם זאת, אם תיבת הסימון של הסיווג מסומנת, בנוסף, יהיו ארבע עמודות נוספות, המציינות את ההסתברות לאירוע האקסוציאטי השייך לאחת מארבע מחלקות.
היתוך ארסיה מלא מיידי, היתוך ארסיה מלא מתעכב, נשיקה והפעלה מיידית, או נשיקה וריצה מתעכב. אירוע אקסוציאטי שייך לאחת מארבע הכיתות אם הוא גדול מ- 0.5 והוא ההסתברות הגבוהה ביותר בארבע הכיתות הנשלטות. במקרה זה, האירוע האקסוציאטי הראשון כאן שייך למעמד היתוך ארסיה מלא מיידי, שכן הוא המספר הגבוה ביותר מעל ארבע הכיתות והוא גדול מ - 0.5.
בנוסף, ישנם מספר קבצי תכונה אחרים עבור כל ערכת תמונה, אשר משמשים במהלך הסיווג של exocytosis ועשויים לעניין לניתוח נוסף. לבסוף, אם אנחנו רוצים להשתמש בניתוח K של ריפלי על מנת לזהות את הארגון המרחבי-זמני של אקסוציאטוזיס, נתחיל תחילה על ידי פיצול קובץ המסכה שלנו לקובץ מסכת נויריט וקובץ מסכת סומה. נעשה זאת על ידי פתיחת המסכה שלנו ב- Image J.We נרצה להשתמש בדוגם הצבע כדי לבחור פיקסל רקע.
וכך, כאשר אנו ממלאים את קובץ המסכה, זה הערך הנכון. לאחר מכן נשתמש בכלי בחירת המצולעים וחלוק לרמות את האזור הסומטי. עכשיו זה דורש קצת קבלת החלטות סובייקטיבית, ידנית.
אנחנו מציעים אליפסואיד מחוספס. לאחר שתסיים, לאחר מכן תלך לעריכה, בחירה ויצירה של מסיכה. לבסוף, אתה תחזור לקובץ המסכה המקורי שלנו ותשתמש בעריכה ומלא כדי למלא את הסומה, ועכשיו יש לנו קובץ מסכת נויריט וסומה נפרד, אותו תשמרו לאחר מכן.
לאחר ששמרתם את קובץ מסכת הנויריט והסומה הנפרד שלכם, כאן, יש לי את זה כקובץ מסכה להדגיש נויריט ומדגיש סומה, נבוא ל- MATLAB ונפתח את קובץ רשת הנויריט 2D MATLAB. כאן, אנו ננווט את התיקייה הנוכחית לספריה שלנו שבה הפקדנו את כל נתוני הניתוח שלנו. לאחר שנעשה זאת, נשנה את נתיב שם המסכה לקובץ המסכה החדש שלנו שהוא הנויריט.
אז במקרה הזה, יש לי את קובץ מסכת הנויריט שלי מתחת לתיקיית קבצי המסכה. לאחר מכן נשנה את שם קובץ CSV למקום שבו ממוקם קובץ המעקבים הפלואורסצנטיים שלנו. במקרה זה, הוא עדיין נמצא בתיקיה קבצי נתונים, ולכן קבצי הנתונים חותכים ואת השם של פלואורסצנטי עוקב אחר קובץ CSV.
לאחר השלמת זה, אתה יכול להתחיל לרוץ. לאחר מכן זה ייצור גרסה שלד של קובץ מסכת neurite ולהפקיד אותו כקובץ CSV תחת תיקיית קבצי המסכה, אשר אנו יכולים לראות כאן. הבא ניצור קובץ CSV עבור סומה גם כן.
כדי לעשות זאת, פתח את קובץ יוצר מסיכות CSV. תרצו לשים בנתיב את מסיכת הסומה ושם ליצירת קובץ ה- CSV. כאן אני פשוט הלכתי קדימה והשתמשתי באותו שם קובץ בדיוק, רק עם CSV נקודה מצורף.
הפעל הפעל, ותראה שקובץ CSV סומה חדש נוצר לצד הנויריט. ברגע שיצרנו את קבצי CSV הן עבור מסכת הנויריט והן עבור מסכת סומה, נוכל להריץ את ניתוח K של ריפלי. כדי לעשות זאת, נווט אל R Studio ונפתח את קובץ R ניתוח K של ריפלי.
ישנם שני משתנים עיקריים כאן לשים לב, מסכת נוירון ונקודות נתונים נוירון. מסיכת נוירון תצביע על קבצי המסכה שברצונך להפעיל. במקרה זה, אני מפעיל לראשונה את קבצי מסכת סומה.
תרצו להפעיל את כל קבצי מסכת הסומה שלכם בנפרד מכל קבצי מסכת הנוריט שלכם. כאן, יש לי שני נוירונים, אשר אני אשתמש לניתוח זה. עם זאת, אתה יכול להשתמש כמה שאתה רוצה עבור ניתוח K של ריפלי, אתה רק רוצה להעתיק ולהדביק קוד זה עבור מסכת נוירון ולשנות את המשתנה לשלוש, ואילך.
המשתנה השני הוא נקודות נתוני נוירונים. כאן ברצונך להצביע עליו לקובץ שנוצר על-ידי כל התכונות שלך, כל קובץ R שחולץ. עכשיו שלי נקרא סטטיסטיקות היתוך, וכך זה מה שהוא קורא כאן.
כאמור, יש לי קובץ מסכת סומה שני ונוירונים, אשר מנותח לצד כדי שנוכל לצבור את K של ריפלי יחד. לאחר ששינית נתיבים אלה לנתיב הנכון, תשתמש בקוד, תריץ אזור ותפעיל את הכל. לאחר השלמת הריצה, ייווצרו מספר חלקות, כולל ערכי K המקובצים של ריפלי, כמו גם את חלקות הצפיפות.
ניתן לשמור אותם על-ידי ייצוא, שמירת תמונה בשם ובחירת תבנית התמונה המתאימה, הספריה, שם הקובץ ולבסוף הקשה על שמור. כאן אנו רואים תוצאות מייצגות מ -12 נוירונים קליפת המוח מורין מבטאים פורקן פלואור בתמונה של יומיים במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה TIRF. ב- A, אנו רואים את התדירות של אקסוציטוזיס מחולקת לפי מעמד.
כאן אנו יכולים לראות כי היתוך טוסיק מלא מיידי מתרחש בתדירות גבוהה יותר מאשר הכיתות האחרות. ב- B, אנו יכולים לראות את התפלגות המצב, המאשרת כי היתוך טוסקל מלא מיידי מהווה יותר ממחצית מכל האירועים. ב- C אנו קובעים את ההתפלגות המרחבית של אקסוציאטוזיס כמפת חום.
אנו יכולים לראות כי רוב האירועים האקסוציאטיים מקובצים בנקודה חמה ליד הסומה, כמו גם בקצוות הדיסטליים של הנוריטים. ב- D אנו יכולים לקבוע כי אירועים אקסוציאטיים מקובצים באופן סטטיסטי באופן משמעותי, וכי גודלם של אשכולות אלה נע בין חצי מיקרון למיקרון אחד בגודלו. השימוש בתוכנית ניתוח אוטומטית לזיהוי וניתוח נכון של אירועים אקסוציאטיים באופן לא משוחד מגביר את יעילות הניתוח ומשפר את יכולת הרבייה והקפדה.
כדי להבטיח דיוק בזיהוי, חשוב לשמור על אות גבוה לרעש במהלך ההדמיה. לכידת אירועים אקסוציאטיים או אירועים ארעיים אחרים הרגישים ל- pH דורשת תדירות הדמיה מהירה מספיק כדי ללכוד את כל האירועים ולשפר הערכות כגון מחצית החיים או שינוי שיא בפלואורסצנטיות. הוכחנו כי לא רק תוכנית זו פועלת ללכידת פלואורסצנטיות רגישה ל- pH בפיתוח נוירונים, אלא גם סוגי תאים אחרים.
עם זאת, אם אתה משתמש בסוג תא אחר, חשוב לבדוק אם קיימים הבדלים בדיוק, בשל אופני הפעולה הייחודיים של אירועים ארעיים בסוגי תאים אחרים. סיווג זה שימש רק בפיתוח נוירונים עד כה. ואכן איננו יודעים שתהליכים אלה קיימים בסוגי תאים אחרים או בנקודות זמן התפתחותיות מאוחרות יותר בתאי עצב.
