התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מפרט שיטה ליצירת אוכלוסייה מאופיינת היטב של תאי אנדותל המוגניים אנושיים. ניתן להשתמש בתאים אלה כדי לחקור את הוויסות המולקולרי ואת המעבר האנדותל-להמטופויאטי. התחילו בהתרבות תאי גזע עובריים אנושיים במשך ארבעה ימים כדי להבדיל אותם לתאי אנדותל קדמוניים.

ביום החמישי, שאפו את המדיום שמעל התאים. לאחר מכן שטפו בעדינות את התאים עם מיליליטר אחד של DMEM/F-12 לכל באר. הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום התמיינות תאי אנדותל המוגני טרי לכל באר ודגרו על התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.

ביום השישי וביום השביעי, החליפו את המדיום שמעל התאים במיליליטר אחד של מדיום התמיינות של תאי אנדותל הומוגני טרי לכל באר, ודגרו על התאים למשך 24 שעות נוספות. ביום השמיני. לאחר ניתוק ושטיפת התאים, מחלקים אותם באופן שווה לצינורות מיקרוצנטריפוגה על קרח, שכל אחד מהם מכיל מינימום של 600 מיקרוליטר של תאים בצפיפות של 1 כפול 10 עד התאים החמישיים למיליליטר.

מוסיפים נוגדנים לצינורות המכילים תאים לפי הצורך ודוגרים על קרח מוגן מפני אור במשך 30 דקות. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1000 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את supernatant ולהשהות את הכדורים ב 600 microliters של חיץ מיון קר כקרח.

מסננים את הדגימות דרך מכסה מסנן הרשת של צינורות FACS של חמישה מיליליטר ומאחסנים את התאים על קרח המוגנים מפני אור למיון תאים מיידי. כדי לבודד תאי אנדותל המונוגניים על ידי FACS, יש לשער תחילה את אוכלוסיית התאים השליליים CD45. לאחר מכן, בתוך האוכלוסייה השלילית של CD45, יש לשער את התאים החיוביים ל-CD31.

הבא באוכלוסייה החיובית ל-CD31, שער לאוכלוסיית התאים השליליים ל-VE-cadherin. ואז בתוך האוכלוסייה השלילית של VE-cadherin, שער לתאים חיוביים ל-c-Kit. מתוך האוכלוסייה החיובית ל-c-Kit, יש לשער את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD34.

ולבסוף מאוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD34, לזהות ולאסוף את התאים החיוביים ל-KDR. לאחר זריעת תאי אנדותל המוגני במדיום מבוסס מתילצלולוז שפותח לצמיחה של תאי אב המטופויאטיים, מושבות יוצרות מושבה-אריתרואיד, ומושבות אריתרואיד יוצרות פיצוץ נספרות ביום השמיני. יחידה יוצרת מושבה-גרנולוציט-מקרופאג' ויחידה יוצרת מושבה-גרנולוציט, אריתרואיד, מקרופאג' ומגה-קריוציטים.

מושבות אב המטופויאטיות רב-פוטנטיות נספרות ביום 14. לכל 1000 תאי אנדותל המוגני מצופה, נוצרות כ -20 יחידות יוצרות מושבה. תאים עם מורפולוגיה של תאי אנדותל נראים גם בתרביות.

אלה הם תאי האנדותל ההמוגניים המולידים אבות המטופויאטיים מרובי תאים ברמה של תא יחיד. פרוטוקול זה הוא מערכת תרבית דו-ממדית ללא מזין מורין שיכולה לייצר תאי אנדותל המוגוגניים אנושיים תוך כשבוע.