This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

הערה: לקבלת הבידול של או hESCs או hiPSCs לתוך אבות trophoblast, hPSCs גדל על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) הם יועברו אל מזין ללא תנאים לשני קטעים לפני ביצוע בידול עם BMP4 / A / P. תהליך זה מבטל את זיהום MEF של תאים מובחנים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידול hESC, ואותו פרוטוקול ניתן ליישם hiPSCs. תרבות 1. ושחזור של hESCs על פיברובלסטים עכבר עובריים מוקרן (MEFs) (תכשירים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גמא-הקרנה של MEFs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של מדיום עבור culturing MEFs: DMEM עם 10% FBS, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 1x פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), ו -0.1 מ&quot;מ חומצות האמינו הלא-חיוניות (NEAA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון אחד MEFs העיקרי ולהשתמש בינוני MEF עבור culturing התאים. הרחב את MEFs הראשוני ל -30 צלחות באמצעות מדיום תרבות MEF. הערה: ריכוזי חמצן אינם קריטיים עבור שלב זה, כךאו פיזיולוגיים (4%) או הסביבה (20%) תנאים בתוך חממה ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר MEFs. השתמש 0.25% טריפסין להסיר את MEFs מהצלחות ולהעביר את תאי צינור חרוטים. מניחים את MEFs לתוך מכשיר הקרנה ולחשוף את התאים 3,500 אפורים. הערה: משך הזמן יהיה תלוי בפעילות של המקור בתוך יחידת irradiator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את MEFs מוקרן עם מדיום התרבות MEF ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת MEFs באמצעות צנטריפוגות ולהוסיף בינוני תרבות MEF 50% ו -50% תא הקפאה בינוני (FBS 80% ובינוני תרבות MEF 20%). Aliquot 1 x 10 6 תאים לכל בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את בקבוקוני MEF מוקרנים במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן להעביר אותם בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפשיר MEFs ו hESCs קפוא לתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של מדיום hESC: DMEM / F-12 עם 20% סרום Replacement, 0.1 מ&quot;מ NEAA, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 10 ng / ml bFGF, 0.1 מ&quot;מ SS-mercaptoethanol, ו 1x פן / סטרפטוקוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון אחד של יום MEFs אחד לפני להפשרת hESCs. מעיל 6-גם צלחת עם ג&#39;לטין 0.1%, באמצעות 1 מ&quot;ל לכל היטב. דגירה של 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסר את הג&#39;לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של MEFs מהאחסון בחנקן נוזלי לטבול את הבקבוקון בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. צפה הבקבוקון לסירוגין עד להישאר גבישי קרח קטנים בלבד. העבר במהירות את תכולת הבקבוקון 9 מ&quot;ל של מדיום MEF בתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום MEF. Aliquot MEFs שווה לצלחת 6 באר. מכניס את הצלחת לתוך לילה 37 ° C חממה דל בחמצן (4%). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות לשגרת hESCs על MEFs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון hESC מ חנקן נוזלי ובמהירות להפשיר את הבקבוקון באמצעות 3באמבט מים 7 מעלות צלזיוס. בעדינות פיפטה hESCs לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל 9 מ&quot;ל של מדיום hESC ומסובב ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר הבינוני resuspend התאים עם 1 מ&quot;ל של מדיום hESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום MEF מהצלחת מוכן בשלב 1.2.4 ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום hESC. הוספת רוק מעכב Y-27632 (10 מיקרומטר) למדיום hESC. מעבירים את hESCs על MEFs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את התאים לתוך 37 ° C חממה דל בחמצן (4%) לילה. החלף את המדיום hESC יומי. לגרד תאים מובחנים עם פיפטה פסטר, דמיינו תחת מיקרוסקופ זקוף על 4X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרון, hESCs כל 4-6 ימים, תלוי confluency התא ואת הגודל של מושבות hESC. הכינו צלחת של MEFs יום לפני passaging. כאשר התאים מוכנים למעבר, להסיר את המדיום hESC ולשטוף היטב עם 1 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס), לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהסיר את collagenase. Wאפר את התאים עם PBS, להוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום hESC לכל היטב, באופן ידני לגרד את התאים לתוך גושים קטנים באמצעות קצה פיפטה 5 מ&quot;ל. מעביר את גושי תאים המושעים לתוך MEF מצופה חדש היטב (הים). </li></ol></li></ol> מעבר 2. של hESCs מ MEFs מזין ללא תנאי על תאי מטריקס מצופה צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן MEF אוויר הבינוני (CM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט MEFs מוקרן בבקבוק T75 בבית 90-100% confluency; חשוב כי MEFs הם מצופה בצפיפות. שים את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לקבוע אם יש להם מצורף בתחתית של הבקבוק (MEFs לצרף כ -6 שעות לאחר ציפוי או למחרת). הערה: תאים פנויים לצוף בטווח הבינוני כאשר נצפו באמצעות מיקרוסקופ. למחרת, להסיר בינוני MEF ולהוסיף 25 מ&quot;ל של מדיום hESC חסר B-FGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף המדיום מותנה לאחר 24 שעות של דגירה. חלף בינוני טרי מדי יום לכל היותר 12 ימים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את CM שנאסף באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני השימוש, להוסיף B-FGF טרי CM. הערה: CM אפשר להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס, לאחסן עד 1 שנה. לחלופין, לאחסן את CM על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכל להעביר את hESCs מתרבה על MEFs מזינה ללא צלחות מטריקס מצופית תאיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי מטריקס עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של מטריקס על הקרח (כ 3-4 שעות). בעזרת הטיפים קר כקרח, צינור חרוטי אחד קר, 50 מ&quot;ל, ובינוניים DMEM / F12, העברת 2 מ&quot;ג של מטריקס ל -24 מ&quot;ל של DMEM קר כקרח / F-12 (דילול תלויה בריכוז תאי מטריקס מהספק ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את 50 מ&quot;ל צינור חרוטי לקרח ולאחסן אותו ב 4 ° C. עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי, להוסיף את הכמות המתאימה של מטריקס בדילול אל הבאר (למשל, 1 מ&quot;ל לכל היטב צלחת 6-היטב). מערבולת כדי לצפות את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר למשך לפחות שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs קטע מתוך MEFs (כמו בשלב 1.3) באמצעות CM המכיל B-FGF (10 ng / ml). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב להסיר את תאי מטריקס מהצלחת חדשה ולהוסיף CM המכיל B-FGF. מעביר את הגושים הסלולר מגורדים מצלחת MEF בעזרת פיפטה ו aliquot אותו לתוך צלחת מטריקס מצופה התאית. דגירה בחממה 37 ° C נמוך חמצן למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את CM עם המדיום B-FGF יומי; בסך הבינוני יהיה תלוי בגודל של בקבוק התרבות. השתמש 2 מ&quot;ל של מדיום עבור 6-היטב היטב אחד. לגרד תאים מובחנים עם פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs מעבר כל 6-7 ימים, כאשר מושבות בהירות כאשר הוא מוצג תחת מיקרוסקופ. הערה: מושבות hESC גדלו על צלחות מצופות מטריקס לגדול מאשר תאי MEF-תרבותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים ללא מזין מוכנים למעבר, להסיר את המדיום, לשטוף ידי מודעותדינג 1 מ&quot;ל של PBS בעזרת פיפטה, לשאוב להסיר את PBS, להוסיף 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​dispase (מחומם מראש ל -37 ° C) עם טפטפת, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם PBS על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של PBS לכל היטב aspirating לאחר מכן. הוסף 1 מ&quot;ל של CM לכל היטב באופן ידני לגרד את התאים לתוך גושים קטנים באמצעות קצה פיפטה 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט גוש תאים מושעה לתוך צלחות מטריקס מצופית תאיות חדשות; התאים צריכים לדבוק לאחר 24 שעות. </li></ol></li></ol></li></ol> בידול 3. hESCs שימוש BMP4 / A / P <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום הבידול. השתמש CM (חסר B-FGF) ולהוסיף (טרי) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 מיקרומטר), ו PD173074 (0.1 מיקרומטר). להוסיף מעכבים אלה אל CM לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש hESCs מזין ללא גדל על צלחות מצופות תאי מטריקס עבור 1 מעבר, בתרבית בתוך להגדיר באינקובטור ב חמצן 4%. לאחר המעבר הראשון לצלחות מצופות תאי מטריקס,בואו התאים לצרף למשך 24 שעות. למחרת, ליזום בידול. הסר את CM (המכיל B-FGF) ולהחליפו CM המכיל BMP4 / A / P (2 מ&quot;ל לכל היטב צלחת 6-היטב). המשך culturing התאים באמצעות רמות חמצן 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את CM המכיל BMP4 / A / P (2 מיליליטר / גם צלחת 6-היטב) כל 2 ימים. לשאוב להסיר את המדיום הישן ולהוסיף CM חדש בעזרת פיפטה. ביום השני לאחר הוספת BMP4 והסרת B-FGF (יום בידול נחשב 2), מורפולוגיה התא תשתנה, המופיעה גדול יותר כאשר נצפה באמצעות מיקרוסקופ. הערה: מובחן תאים, אשר תערוכה וקצוות מעוגלים בהירים, לא יהיו נוכחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים בזמן נקודות רצויות. תאים מובחנים יפסיקו חלוקה לאחר כ -2 שבועות. תאי Transfect במהלך פרק זמן זה (עיין בסעיף הבא). </li></ol> 4. Transfection של תאים Trophoblastic עם siRNAs או DNA פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תאי trophoblastic עבור transfection </strong&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs תרבות עבור שתי פסקאות על תאי מטריקס לאחר העברתם מן MEFs (ראה שלב 2.2). השתמש בינוני hESC המכיל B-FGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול hESCs על יום אחד צלחת מטריקס חדש לפני בידול. confluency הסלולר הגבוה הוא חשוב, כל כך לפצל את התאים 1: 1 לצלחת חדשה / טוב, אשר יבטיח לפחות 50% confluency למחרת. דגירת תאי הלילה בחממה דל בחמצן. הערה: hESCs לא צריך לספור במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את מדיום עם בינוני בידול (CM המכיל BMP4 / A / P וחסרי B-FGF, באמצעות 2 מ&quot;ל / גם צלחת 6-היטב). הסר את המדיום הישן על ידי שאיפה ולהעביר את המדיום החדש (2 מ&quot;ל) בעזרת פיפטה. מניח את תאי חממה דל בחמצן (חמצן 4%) הלילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfections באמצעות siRNAs עבור שיבוש גנטי או באמצעות פלסמיד דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל בין התאים עד הזמן- הרצוילנקודה (בין בימים 1 ו -14). יום לפני transfection, trypsinize התאים באמצעות טריפסין 0.05% במשך 5 דקות. פלייט אותם confluency הרצוי (בהתאם לפרוטוקול מגיב transfection) לצלחת ג&#39;לטין מצופה (להוסיף ג&#39;לטין 0.1% לצלחת בתרבית רקמה למשך 20 דקות לשאוב להסיר). להוסיף CM המכיל BMP4 / A / P (חסר B-FGF) דגירה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף בינוני בידול טרי אל התאים. Transfect siRNAs באמצעות מגיב transfection siRNA. עבור DNA פלסמיד, השתמש מגיב lipofectamine מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל על פי פרוטוקול המוצר כמתואר לכל מגיב transfection. מעביר את מתחמי lipofectamine siRNA היטב כל / צלחת של תאים, ומערבבים בעדינות, ותרבות תאי לילה חממה דל בחמצן. הערה: חלק ריאגנטים transfection מעוכבים על ידי אנטיביוטיקה, אשר דורשת CM חסר פן / סטרפטוקוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף עם תקשורת בידול טריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על הרצוןבזמן נקודות ד (למשל, 24 שעות, 48 שעות, ו -72 שעות) כדי לבדוק את היעילות שיבוש גנטי באמצעות RT-PCR כמותי. עבור תאים קציר, השתמש טריפסין 0.05%, הוספת 1 מ&quot;ל לכל היטב דוגרים במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום MEF לכל היטב כדי לנטרל את טריפסין. ספין למטה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות ולהשתמש התא גלולה עבור בידוד RNA. </li></ol></li></ol> זיהום פתוגן 5. של תאים Trophoblastic: זיהום ויראלי סנדאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן hESCs לבידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs תרבות עבור שתי פסקאות על תאי מטריקס לאחר ההעברה מן MEFs (ראה שלב 2.2). השתמש בינוני hESC המכיל B-FGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול hESCs על יום אחד צלחת מטריקס חדש לפני בידול. confluency הסלולר הגבוה הוא חשובים, כך פיצול תאים 1: 1 לצלחת חדשה / טוב, אשר תבטיח לפחות 50% confluency למחרת. דגירת תאי לילה חממה דל בחמצן (חמצן 4%). &lt;br /&gt; הערה: hESCs לא צריך לספור במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את המדיום עם בינוני הבידול (CM המכיל BMP4 / A / P וחסר B-FGF) ותרבות לילה חממה דל בחמצן (4% חמצן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום ויראלי סנדאי של תאים trophoblastic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני יום בידול הרצוי, trypsinize התאים המבדילים (תאים בודדים) באמצעות 0.05% טריפסין במשך 5 דקות ולהעבירם צלחת ג&#39;לטין מצופה. הוסף בינוני בידול דגירת לילה חממה דל בחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף בינוני עבור זיהום (זה ישתנה בהתאם הנגיף). השתמש CM חסר פן / סטרפטוקוקוס המכיל BMP4 / A / P, באמצעות 0.5 מ&quot;ל עבור אחד טוב של צלחת 6 באר. להוסיף וירוס סנדאי עבור משרד פנים = 1. דגירה עבור 8 שעות בתוך חממה דל בחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם-מועד לפי שעון נוסף נחוצים, להסיר את המדיום המכיל וירוס לאחר 4 שעות ולהחליפה BMP4 / A / P CM. איסוף תאיםעבור בידוד RNA באמצעות מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את היעילות של זיהום ויראלי על ידי ביצוע qRT-PCR עבור גנים המעורבים בתגובה ויראלי 18. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast.">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-four+fertilized+human+ova,+good,+bad+and+indifferent,+recovered+from+210+women+of+known+fertility;+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy.">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li><li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blastocysts+grown+in+culture.">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li><li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections.">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes:+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma.">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li><li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast.">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li><li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4.">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li><li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion.">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li><li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model.">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li><li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages.">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li><li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events.">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li><li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li><li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li><li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells:+to+be+or+not+to+be?.">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?.</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li><li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin/nodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts.">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li><li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRHOXF1,+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta.">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li><li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRHOXF1,+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta.">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages.">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li><li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways.">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082 (2009).</li><li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+(FGF)+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development.">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li><li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li><li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast.">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li><li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cytotrophoblastic+cell,+a+mononuclear+chameleon.">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li><li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycosylated+hCG,+a+review.">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li><li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leucocyte+antigen+(HLA)+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines,+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies.">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הצגנו את הצעדים הבסיסיים המבדילים hESCs לתוך אבות trophoblast. פרוטוקול זה ממוטב לאחרונה להבדיל hESCs במהירות בתוספת Activin / קטרי איתות מעכבים, הגדלת הבידול לתאי trophoblastic והימנעות ההדורה של אבות mesoderm, אשר הם נצפו בדרך כלל עם טיפול BMP4 לבד. מערכת מודל BMP4 מאפשרת לבחינה בשלבים המוקדמים ביותר של מפרט שושלת trophoblast אדם והתרחבות. בנוסף, מערכת מודל BMP4 זו שימושית גם על חקירת התמיינות של תאים trophoblastic אל שושלות משנה ספציפיות, דבר שאינו אפשרי באמצעות שורות תאים choriocarcinoma שורות תאים trophoblast extravillous. בתאים trophoblastic נגזר במבחנה יכול לשמש גם למטרות ניסויים הפסד של פונקציה באמצעות siRNAs 19. בנוסף, hESCs או hiPSCs ניתן מהונדס גנטי על מנת לתת ביטוי המושרה של transgen<html> es 19 או עבור החדרת גני כתב ב לוקוסים אנדוגניים 20, ו תאים אלה יכולים להיות מובחנים לתוך תאי trophoblastic באמצעות בתנאים המתוארים כאן. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול זה הכרחי כדי להשמיט B-FGF (FGF2) ממדיום בידול CM להשיג ובתאי trophoblastic מן hESCs. הנוכחות של B-FGF יחד עם BMP4 במדיום התרבות משפרת את הביטוי של אבות mesoderm ו endoderm 16. הכללת B-FGF במדיום בידול trophoblast הוא האמין להסביר מדוע מחקר שנערך לאחרונה מצא כי בידול בתיווך BMP4 מייצר תאי המזודרם ו endoderm במקום trophoblasts 21. הוא ומבוסס כי B-FGF יחד עם Activin A ו- BMP4 מקדם endoderm והבחנת mesoderm באופן תלוי במינון 22,s = &quot;Xref&quot;&gt; 23. בשנת העכבר, התפתחות epiblast, trophectoderm, שושלות endoderm פרימיטיביות תלויות מסלולי איתות FGF 24. להבדיל hESCs, B-FGF-induced איתות נדרש להיווצרות המזודרם כאשר BMP4 משמש להשרות התמיינות 21, 25. לעומת זאת, עיכוב של שתי FGF ואת מסלולי איתות Activin / קטרי, יחד עם BMP4, טובות היווצרות SYN ב אבות trophoblast hESC הנגזרות ומונע היווצרות של אבות mesoderm ו endoderm פרימיטיבי 26. מגבלות של הטכניקה הבעיה הכי האופיינית עם פרוטוקול זה של בידול hPSC כדי אבות trophoblast קשורה החל עם אוכלוסייה מובחנת בעיקר של hESCs או hiPSCs על MEFs. בגלל hPSCs לצבור תאים מובחנים בשני הקצוות הפנימיים והחיצונייםשל המושבות, חשוב לפקח על כמות בידול יומית וכדי להסיר מושבות בדיל (או חלקים של מושבות). הנוכחות של תאים מובחנים יכול לסבך את תהליך הבידול, במיוחד כאשר תאים מועברים הבין-תאי. תאי הבדיל יתרבו במהירות על תאי מטריקס בנוכחות CM, ותאים אלה יהפכו מהר להשתלט על התרבות מחוץ להתחרות hPSCs. לכן, הוא אידיאלי להתחיל עם מושבות בריאות, מובחנות של hPSCs גדלו על MEFs לפני העברת התאים לחומר הבין-התאי. משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות בעת שימוש בפרוטוקול הבחנה זו, אבות trophoblast וכתוצאה מכך הם תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. Trophoblasts מורכבות cytotrophoblasts villous, syncytiotrophoblasts (SYNs), ו cytotrophoblasts extravillous(ד ^) 27. cytotrophoblasts Villous הם אבות שיוצרים ד ^ ו SYNs. HPSCs BMP4 הבדיל יפיק תערובת של cytotrophoblasts villous, SYNs, ו ד ^ 9, 15, אשר הוגדרו על ידי ביטוי גנים או חלבון של סמנים ספציפיים-השליה. המסלולים בידול ברור ניתן להבחין על ידי הפרשת HLA-G (מאפיין של ד ^) או גונדוטרופין כוריוני אנושי (מ SYNs) 28, 29. לאחרונה, הוכיח כי העיכוב של איתות Activin / קטרים טובים בידול EVT מן hESCs, והסרת עכבות זה מעדיפה בידול כדי SYN 17. ואכן, פרסום מוקדם מצאו ששימוש BMP4 לבד להבדיל hESCs מייצר בעיקר תאי SYN 26. הנתונים באמצעות BMP4 / A / P ובינוניים מותנה (חסר B-FGF) מצביעים על כך שקיימתהן EVT ותאי SYN הנוכחי ביום בידול 5. אם אוכלוסיות EVT או SYN הטהורים הן רצויות, טיהור נוספת באמצעות סמנים פני תא, כגון HLA-G מצומדות כדי חרוזים עבור הבידוד של ד ^, אפשרי 29. לסיכום, שיטת התרבות המתוארת כאן היא דרך יעילה להפקת כמויות משמעותיות של תאי trophoblastic מ hPSCs שניתן להשתמש בהם עבור מגוון רחב של יישומים. בגלל פרוטוקול זה מייצר הוא SYNs ו ד ^, היא מערכת מודל מתאימה לבחינת השליה האנושית מוקדם. תאים אלה יכולים לשמש עבור מגוון רחב של יישומים, כולל גילוי תרופות והנדסה גנטית.

השליה נדרשת לצמיחה וההישרדות של העובר במהלך הריון ומקלה על חילופי גזים, חומרים מזינים, פסולת, והורמונים בין זרימת יולדות ועוברת. העוגב הראשון נוצרו במהלך העובר יונקים הוא השליה, שמתחיל לפתח 6-7 ימים לאחר ההתעברות בבני אדם ובבעלי 3.5-4.5 ימים בעכברים 1, 2, 3, 4. תאי Trophoblastic הם התאים החשובים ביותר של השליה, ותאים אלה מייצגים אחד אירועי בידול שושלת המוקדמים של העובר היונק. הם נובעים מתאי trophectoderm חוץ עובריים החיצוני של הבלסטוציסט preimplantation. הידע שלנו בשלבים המוקדמים של פיתוח שליה הוא מוגבל על ידי מגבלות אתיות ולוגיסטיות על דוגמנות התפתחות אנושית מוקדם. במהלך השתלה העוברית, trophoblastsלפלוש האפיתל האימהי להתמיין ובתאים מתמחים 5. Cytotrophoblasts (CTBs) הם mononucleated, אבות מובחן כי הפתיל להתמיין syncytiotrophoblasts (SYNs) ו trophoblasts פולשנית extravillous (ד ^), אשר עוגן השליה אל הרחם. SYNs הוא multinucleated, תאים מובחנים סופנים כי לסנתז הורמונים הכרחיים לקיום הריון. האירועים בידול מוקדם שיוצרים ד ^ ו SYNs הם מרכיב חיוני לייצור השליה, כמו ליקויי בתאים trophoblastic לגרום להפלה, רעלת הריון, ו -1 פיגור גדילה תוך רחמי. סוגי שורות תאים אנושיים trophoblast אשר פותחו כוללים הנציחו CTBs ו choriocarcinomas, אשר מייצר הורמוני השליה ומאפייני פולשנית תצוגה 6. תאי trophoblastic ראשית ממנהל השליות הראשון בטרימסטר אדם יכולים להיות מבודדים, אבל התאים במהירות DIFferentiate ולהפסיק מתרבים במבחנה. חשוב לציין, הפך שורות תאים ראשוניות יש פרופילי ביטוי גנים שונים, המציין כי שורות תאי trophoblast tumorigenic והנציחו לא יכולות לייצג במדויק העיקרי trophoblasts 7. בנוסף, שורות אלה צפויות להידמות אבות תאי גזע trophoblast השליה כי הם נגזרים בשלב מאוחר תחילה דרך הטרימסטר שלישי. יש צורך חזק במערכת תרבות חוץ גופייה של trophoblasts אדם בשלב מוקדם על מנת ללמוד את האירועים הראשונים של היווצרות שליה ותפקוד. תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר חולקים תכונות עם מסת התאים הפנימית של עובר preimplantation, משמשים לעתים קרובות מודל התפתחות אנושית מוקדם, כוללים ההיווצרות של השליה מוקדם. שני תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) ו hESCs ניתן להבדיל לתוך trophoblasts במבחנה באמצעות עצם מורחלבון 4 phogenic (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. מרה זו של תאי פלוריפוטנטיים לתאי trophoblastic באמצעות BMP4 היא ספציפית עבור תאים אנושיים והיא בשימוש נרחב כדי ללמוד על ההתפתחות של השליה האנושית מוקדם כי היא אינה דורשת גישה עוברית אדם מוקדם 9, 16. לאחרונה, התגלה כי תוספת של מעכבי A83-01 (א) ו PD173074 (P), אשר חוסמים את המסלולים SMAD2 / 3 ו MEK1 / 2 איתות, מגביר את היעילות של בידול hPSC לתוך אבות דמוי trophectoderm, בעיקר SYNs ו ד ^, ללא דור נרחב של המזודרם, האנדודרם, או תאים האאקטודרם 9, 17 </sup&gt;. באמצעות תנאים בינוניים אלה, hESCs בדיל עבור יש 12 ימים פרופילי ביטוי גנים דומה כתאי trophectoderm המבודדים עובר הבלסטוציסט הבמה אדם ומפרישים הורמוני גדילת השליה ספציפיות שונים, תומכי תוקפיו של מערכת מודל במבחנת 9, 11. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידול במבחנה של hPSCs לתוך אבות trophoblast אדם באמצעות BMP4 / A / P בינוני תרבות. תנאים אלה לייצר מספר שופע של תאים עבור מגוון רחב של יישומים, כולל רצף RNA, שיבוש הגן באמצעות siRNAs, זיהומים הפתוגן, ושינוי גנטי באמצעות transfection בתיווך lipofection.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>This is referred to as &quot;serum replacement&quot; in this protocol.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Rock inhibitor Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Irradiated CF1 MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i low oxygen incubator</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol is used to isolate total RNA.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>This is referred to as &quot;extracellular matrix&quot; in this protocol.</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells

השליה היא האיבר הראשון לפתח במהלך embryogenesis ודרושה להישרדות של העובר המתפתח. השליה מורכבת תאים trophoblastic שונים המבדילים מתאי trophectoderm חוץ עובריים של הבלסטוציסט preimplantation. ככזה, את הבנתנו את אירועי הבידול המוקדמים של השליה האנושית מוגבלת בגלל מגבלות אתיות ומשפטיות על בידוד המניפולציה של עובר אנושי. תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) הם מערכת מודל חזקה לחקירת התפתחות אנושית והוא יכול גם להיות מובחן במבחנה לתאים trophoblastic מבטאי סמנים של סוגי תאי trophoblast השונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחנת hPSCs לתאי trophoblastic באמצעות עצם morphogenic חלבון 4 ומעכבים של מסלולי איתות Activin / קטרים. פרוטוקול זה מייצר סוגי תאים trophoblast שונים שיכולים להיות transfected עם siRNAsעל חקירת פנוטיפים הפסד של פונקציה או יכול להיות נגוע פתוגנים. בנוסף, hPSCs ניתן מהונדס גנטי ולאחר מכן מובחן לתוך אבות trophoblast עבור רווח של פונקצית המנתח. שיטת בידול במבחנה זו להפקה trophoblasts אדם החל hPSCs מתגברת על המגבלות האתיות ומשפטיות של עבודה עם עוברי אדם מוקדם, מערכת זו יכולה לשמש עבור מגוון רחב של יישומים, כולל גילוי תרופות מחקר בתאי גזע.

סקירה כללית של במבחנה בידול של hPSCs פרוטוקול בידול במבחנה זה מתחיל עם hESCs מובחן גדל על MEFs אשר יועבר אל מזין ללא תנאים למעבר אחד (איור 1 א). בעוד תיארנו את הבידול של hESCs בפרוטוקול זה, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להבדיל hiPSCs בהצלחה לתאי trophoblastic. מעבר מטריקס מסיר את רוב MEFs המוקרן, אשר אינם רצויים עבור ניתוחים הדורשים אוכלוסיות טהורות של תאי trophoblastic אדם. hPSCs המובחן גדל על תאי מטריקס ותרבותי עם המכיל CM-FGF B עד המושבות מוכנות passaging (כשבוע). זה שומר על המדינה pluripotent לפני גרימת BMP4 / A / בידול בתיווך P. המושבות הם שיבשו לגושים של ~ 50-100 תאיםבאמצעות dispase ו passaged בשנית לצלחת מטריקס מצופה תאית. למחרת passaging, התאים החסידים מוכנים להשרות התמיינות, והמדיום מופעל להכיל BMP4 / A / P חסר B-FGF. תאי הבדיל להתרבות במשך כ 2 שבועות, במהלכן התאים ניתן לאסוף עבור בידוד RNA או המשמשים בניסויי transfection. שינויים מורפולוגיים להופיע 1-2 ימים לאחר הבידול כבר יזם, ותוצאות מניסוי נציג אחד מוצגות באיור 1B. שים לב כי תאים בימי בידול 1-2 הנם גדולים יותר מהתאים מהיום 0 (האיור 1B). מושבת תא הבדיל גדלה במהירות, ושינוי זה בולט מדי יום. במהלך ההתמיינות, התאים להתחלק להרחיב את ממרכז המושבה, גדל בכיוון החוצה (ימים 3-5; איור 1B). החלק החיצוני של המושבה מכיל תא גדול יותר לעומת tהוא התאים במרכז המושבה. התאים המבדילים להיות כהה יותר ושטוח יותר מאשר תאי גזע פלוריפוטנטיים בתרבית על תאי מטריקס; השינויים בהירים תא הם יותר נראים לעין כאשר אתה מציג את התאים עם מיקרוסקופ זקוף משמש תרבית תאים שיגרתית. מושבות הפרט להתמזג יחד על ידי בידול יום 5 (איור 1 ב &#39;), עם תאים גדלו על גב אחד את השני. לאחר יום בידול 4-5, תאים המכילים גרעינים רבים נוכחים (לא מוצג) (איור 1 ב). BMP4 / A / P גורם בידול ביטוי של סמני Trophoblast בדקנו שינויים בביטוי הגנים במהלך שלושת הימים הראשונים של בידול BMP4 / A / P באמצעות RT-PCR כמותי (qRT-PCR). RNA היה מבודד בבית ימים בידול 1, 2, ו -3 ועל המרה cDNA. היעלמותו של תאי גזע פלוריפוטנטיים ניתן להעריך הן בy מורפולוגיה, ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ, ועל ידי qRT-PCR, באמצעות פריימרים עבור גנים pluripotency. רמות הביטוי היחסיות של NANOG, סמן של תאי גזע פלוריפוטנטיים, הוא מופחת על ידי ~ 75% לאחר יום אחד של בידול כאשר תאים בתרבית עם BMP4, והרמות מופחתות על ידי ~ 90% בנוכחות BMP4 / A / P ( איור 2). על ידי בידול יום 2, רמות NANOG נמוכים מאוד עבור תאים בתרבית BMP4 לבד או BMP4 / A / P בהשוואה לאלו במדיום hESC CM (המכיל B-FGF). זוהי תוצאה צפויה, כי אנחנו לא שומרים תאים שלא עברו התמיינות לאחר יומיים של בידול (איור 1B), אשר הם בהירים קטנים יותר לעומת תאים מובחנים. היעילות של בידול בתיווך BMP4 לתאים trophoblastic ניתן להעריך באופן ישיר על ידי qRT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים עבור שני סמנים trophoblast: KRT7 ו Cdx2. שני גנים אלה אינם באים לידי ביטוי ב גזע אנושי pluripotentתאים, ומגבירה הביטוי שלהם לאחר 2-3 ימי טיפול BMP4 (איור 2). שימוש בתנאים המתוארים כאן, רמות תמליל KRT7 להגדיל ביום בידול 1 ב BMP4 / A / P בינוני נשארות קבוע במשך 3 הימים הראשונים של בידול (איור 2). יש KRT7 ביטוי בעת שימוש BMP4 לבד עלייה מאוחרת ביום 2, בהסכמה עם תצפיות קודמות כי Activin / מעכבי קטרים להגביר את קצב הבידול של 9 hESCs. דרך נוספת להעריך את היעילות של שימוש מעכבים אלה היא לקבוע את השפע היציב של תמלילי Cdx2 ו KRT7 בתאים שטופלו BMP4 לבד. רמות Cdx2 דומות במשך ימי בידול 1-3 בעת שימוש או BMP4 לבד או BMP4 יחד עם Activin / מעכבי קטרים. עם זאת, תמלילי KRT7 הם עשירים יותר לאחר יום אחד של בידול בנוכחות מעכבי אלה, דבר המרמז על יותרבידול מהיר (איור 2). ביטוי Cdx2 בדרך כלל מגיע לשיאן ביום בידול 2 עבור שני התנאים ומפחית לאחר יום 3 (איור 2). HESCs המובחן אינו מבטא גם KRT7 או Cdx2 (איור 2), כצפוי. לסיכום, BMP4 / A / תנאי P במהירות להבדיל hESCs, וביטוי סמן השליה ניתן לאתר מוקדם ככל יום בידול 3. Transfections של siRNAs ו פלסמיד דנ&quot;א זיהומים ויראלי שימוש במבחנה -derived תאים Trophoblastic במבחנה שמקורם בתאי trophoblastic האדם ניתן transfected עם siRNAs לשבש את ביטוי הגנים או של קידוד או RNAs noncoding. יזמנו את הבידול של hESCs באמצעות BMP4 / A / P, ביצע שני סבבי transfections siRNA (באמצעות 75 pmol של siRNAs) בימים בידול 1 ו -2,ואסף התאים עבור בידוד RNA. RT-PCR כמותי היא שיטה יעילה כדי לקבוע את היעילות מציאה עבור קידוד או או גנים noncoding. השימוש בשתי siRNAs משלים באזורים שונים של זמן, noncoding RNA lncRHOXF1 19, השגנו מציאה 80% של תמלילי lncRHOXF1 (איור 3 א). בשלב הבא, אנחנו transfected siRNA אחד (25 pmol) עבור הגן המקודדים חלבונים hnRNP U, גם בימים בידול 1 ו -2 צפינו ירידה של 80% תמלילי hnRNP U בעקבות שני transfections רצופים. בשינה ובתאי trophoblast הבדיל במבחנה יכול לשמש גם כדי לחקור תגובות חיסון מולדות. ביצענו זיהומים של בידול יום 2 תאים באמצעות וירוס סנדאי ב משרד הפנים של 1 ואסף התאים לאחר 8 שעות של דגירה ויראלי. שימוש qRT-PCR, זיהינו תמלילי חלבון נגיפי בשפע (Sev-NP) בתאים נגועים (איור 3 ב), מעיד על פרו ויראלי פעילpagation בתאים trophoblastic. חשוב לציין, תאים נגועים (באמצעות משרד הפנים = 1) לא לשנות במראה הם קיימא (מידע לא מוצג). בתאים trophoblastic נגזר במבחנה ניתן transfected גם עם פלסמיד דנ&quot;א. ביצענו transfections באמצעות פלסמיד GFP והציג זה לבנות לתוך BMP4 / A / תאים שטופלו P ביום בידול 1 ויום 3 צילמו עבור GFP למחרת (איור 4). אנחנו בדרך כלל מתקבלים יעילות transfection 30-50% ב 24 hr-transfection פוסט. לסיכום, בתאים trophoblastic נגזר במבחנה יכול להיות מנוצל עבור gain- וניסויים הפסד של פונקציה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55268/55268fig1.jpg" /> איור 1: In vitro התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי trophoblastic מוקדם באמצעות BMP4 / A / P. (א) סכמטי של בידול BMP4<html> של hPSCs לתאים trophoblastic באמצעות BMP4 / A / P. (ב) תמונות בהירות שדה נציג של תאי HUES9 במהלך D0, D2, D6 של בידול BMP4 / A / P. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. ראשי החץ מציינים hESCs תא בודד כי אינם מובחנים זה מזה. החיצים להדגיש תכונות מורפולוגיות במהלך התמיינות. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55268/55268fig2.jpg" /> איור 2: BMP4 / A / בידול P במהירות downregulates NANOG pluripotency סמן upregulates Cdx2 גנים trophoblast ו KRT7. ניתוח qRT-PCR עבור NANOG (סמן pluripotency), Cdx2, ו KRT7 (סמנים trophoblast). הערכים הם ממוצעים ממהלכים בשלושה עותקים.<html> //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55268/55268fig3.jpg" /> איור 3: ג&#39;ין שיבושים ואי זיהום ויראלי באמצעות בתאי trophoblastic אדם מובחן במבחנה. (א) qRT-PCR ניתוח של hESCs (HUES9) הבדיל ואז transfected עם siRNAs ספציפית ארוך, noncoding RNA lncRHOXF1 (משמאל) או הגן המקודדים חלבונים hnRNP U (מימין) במשך יומיים רצופים. יעילות המציאה (KD) היא בדרך כלל 70-80%, ואת התוצאות מניסוי transfection אחד מוצגות. (ב) qRT-PCR ניתוח לפרוטוקול חלבון נגיפי סנדאי של תאים trophoblastic בידול יום 2 נגוע בווירוס סנדאי (משרד הפנים = 1) במשך 8 שעות. הברים השגיאים לציין את SEM.&quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55268/55268fig4.jpg" /> איור 4: המבוא של פלסמיד דנ&quot;א לתוך תאי trophoblastic אדם מובחנים במבחנה. Transfection של פלסמיד דנ&quot;א GFP לתוך ובתאים trophectoderm בידול יום 1 ויום 3, דמיינו למחרת. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

8.5K Views.  University of Pennsylvania. Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Video: In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Bioengineering

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Neuroscience

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biology

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

פרוטוקול עבור בלסטואידים אנושיים מידול בלסטוציסט פיתוח והשתלה של בלסטוציסטים

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...