Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Este protocolo detalha um método para gerar uma população bem caracterizada de células endoteliais hemogênicas humanas. Essas células podem ser utilizadas para estudar a regulação molecular e a transição endotelial-hematopoiética. Comece cultivando células-tronco embrionárias humanas por quatro dias para diferenciá-las em células endoteliais primordiais.

No quinto dia, aspirar o meio acima das células. Em seguida, lave suavemente as células com um mililitro de DMEM / F-12 por poço. Adicione um mililitro de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No sexto e sétimo dia, substitua o meio acima das células por um mililitro de meio de diferenciação de células endoteliais homogênicas recém-preparado por poço e incube as células por mais 24 horas. No oitavo dia. depois de separar e lavar as células, divida-as uniformemente em tubos de microcentrífuga no gelo, cada um contendo um mínimo de 600 microlitros de células a uma densidade de 1 vez 10 para a 5ª célula por mililitro.

Adicione anticorpos aos tubos que contêm células, conforme apropriado, e incube no gelo protegido da luz por 30 minutos. Pellet as células por centrifugação a 1000 vezes G e 4 graus Celsius durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 600 microlitros de tampão de classificação gelado.

Coe as amostras através da tampa do filtro de malha de tubos FACS de cinco mililitros e armazene as células no gelo protegidas da luz para triagem imediata das células. Para isolar células endoteliais hemogênicas por FACS, primeiro a população de células CD45-negativas. Então, dentro da população CD45-negativa, porta as células CD31-positivas.

Em seguida, dentro da população CD31-positiva, porta para a população de células VE-caderina-negativas. E então, dentro da população negativa de caderina VE, porta para as células c-Kit-positivas. Da população c-Kit-positiva, a população de células CD34-positivas.

E, finalmente, a partir da população celular CD34-positiva, identificar e coletar as células KDR-positivas. Após a semeadura de células endoteliais hemogênicas em um meio à base de metilcelulose formulado para o crescimento de células progenitoras hematopoiéticas, colônias de unidades formadoras de colônias eritróides e colônias de unidade formadora de explosão - eritróides são contadas no oitavo dia. Unidade Formadora de Colônia-Granulócito-Macrófago e Unidade Formadora de Colônia-Granulócito, Eritróide, Macrófago e Megacariócito.

Colônias progenitoras hematopoiéticas multipotentes são contadas no dia 14. Por cada 1000 células endoteliais hemogênicas plaqueadas, aproximadamente 20 unidades formadoras de colônias são geradas. Células com morfologia de células endoteliais também são visíveis nas culturas.

Estas são as células endoteliais hemogênicas que dão origem a progenitores hematopoiéticos de múltiplas linhagens em um nível de célula única. Este protocolo é um sistema de cultura livre de soro e murino 2D que pode gerar células endoteliais hemogênicas humanas em aproximadamente uma semana.