עבודה זו מומנה על ידי הקרן לחקר הסרטן לילדים (CCRF) ו NIH R01 AI146009 כדי B.S.M.

דגימות לויקפירזיס מתורמים בריאים התקבלו מבנק דם מקומי. כל הניסויים המתוארים כאן נקבעו להיות פטורים למחקר על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית (IRB) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית Biosafety (IBC) באוניברסיטת מינסוטה.
הערה: כל הניסויים בוצעו בהתאם לאמצעי הזהירות האוניברסלי לפתוגנים המועברים בדם, עם טכניקות סטריליות/אספטיות וציוד biosafety רמה 2 מתאים.
1. הכנת תוספי תזונה למדיום הרחבת תאי B
<ol><li>לשקם אוליגונוקלאוטידים CpG לריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.</li>
	<li>לשקם את CD40 ליגנד (CD40L) לריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל.</li>
	<li>לשקם את האדם רקומביננטי IL-10 (rhIL-10) לריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל.</li>
	<li>לשקם אדם רקומביננטי IL-15 (rhIL-15) לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל. הערה: שמור כל תוספת aliquots קטן ב -20 °C (70 °F) כדי -80 °C (6 °F) עד 6 חודשים.</li>
</ol>2. הכנת מדיום בסיסי
<ol><li>שלב מדיום בסיסי של תאי B עם תוסף מדיה של 5% (v/v) להרחבת תאי החיסון במבחנה (למשל, CTS Immune Cell SR) ו- 1% (v/v) פניצילין וסטרפטומיצין.</li>
	<li>מסנן-לעקר את המדיום הבסיסי באמצעות מתאם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק מעוקר.</li>
	<li>שמור על מדיום הבסיס ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.</li>
</ol>3. הכן מדיום הרחבה של תאי B
<ol><li>להעביר את הכמות הנדרשת של מדיום הבסיס לתוך מיכל סטרילי לתרבות תאי B ב 5 × 105 תאים / מ"ל.</li>
	<li>להשלים את המדיום הבסיסי עם 1 מיקרוגרם / מ"ל CpG, 100 ננוגרם / מ"ל CD40L, 50 ng/ mL rhIL-10, ו 10 ng/mL rhIL-15.</li>
	<li>סנן את אמצעי ההרחבה של תא B באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>יש להשוות את מדיום ההתפשטות של תאי B באינקובטור תרבית הרקמות ב-37°C, 5% CO2 עם לחות לפחות 30 דקות לפני השימוש. הערה: הכן מדיום הרחבה חדש של תאי B לשימוש ליום אחד. אל תכין את אמצעי ההרחבה של תא B לשימוש במשך מספר ימים. מתכון מדיה זה מעודד התפשטות של תאי זיכרון B ותאי B אנושיים ראשוניים מופעלים.</li>
</ol>4. טיהור והתרחבות תאי B אנושיים
הערה: מוסיפים 99–100% אלכוהול איזופרופיל למיכל הקפאה מבוקר טמפרטורה, בהתאם להוראת היצרן, ומצננים את מיכל ההקפאה ב-4 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים את שלב 4.1.
<ol><li>בידוד מחשבים אישיים מדגם לוקאפורזיס
	<ol>
<li>מעבירים דגימת לוקאפורזיס (כ-8-10 מ"ל) לצינור חרוט סטרילי של 50 מ"ל.</li>
		<li>העלה את עוצמת הקול ל- 35 מ"ל עם מלוחים סטריליים עם אגירת פוספט (PBS) של 1x פוספט.</li>
		<li>שכבה בזהירות מדגם 35 מ"ל leukaphoresis על 15 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 25 דקות ללא בלם, להסיר את שכבת הפלזמה מבלי להפריע מעיל באפי (שכבת PBMC), לאסוף את המחשבים מהממשק, ולהעביר צינור סטרילי חדש 50 מ"ל חרוט.</li>
		<li>העלה את מחשבי ה- PCMCs ל- 50 מ"ל עם PBS אחד.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ללא בלם. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה PBMC, אשר עשוי להיראות אדום.</li>
		<li>מוסיפים 7 מ"ל של מאגר תמוגה אמוניום-כלוריד-אשלגן, פיפטה 3 פעמים כדי לערבב היטב, ואת הדגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות.</li>
		<li>העלה את עוצמת הקול ל- 50 מ"ל עם PBS 1x.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות עם בלם התנגדות נמוכה. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה. גלולה צריך להיראות ורדרד או לבן. הערה: כדי להמשיך לתרבת את תאי B המבודדים זה עתה, הכינו את מדיום ההתפשטות של תאי B לפני שתתחילו בבידוד תאי B (שלב 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד תאי B ממחשבי PC באמצעות ערכת בידוד שלילית ראשונית של תאי B אנושיים
	<ol>
<li>התחדשו במחשבי PCBM במאגר הבידוד לריכוז של 5 × 107 תאים/מ"ל. הערה: אם המספר הכולל של מחשבים אישיים קטן מ- 5 × 107 תאים, הקטן את נפח מאגר הבידוד כדי לשמור על 5 × 107 תאים/מ"ל. נפחים מינימליים ומקסימליים של השעיית תאים הם 0.25 מ"ל ו- 8 מ"ל, בהתאמה.</li>
		<li>מעבירים עד 8 מ"ל (5 ×10 7 תאים/מ"ל) לצינור סטרילי, פוליפרופילן, עם כובע.</li>
		<li>הוסף 50 μL / mL של משפר קוקטייל למחשבים.</li>
		<li>הוסיפו 50 μL/mL של קוקטייל בידוד למחשבי PCMCs, כיפה הצינור, והפך 2-3 פעמים לערבב.</li>
		<li>דגירה ב RT במשך 5 דקות; בדקהה-4 של הדגירה, חיידקים מגנטיים מערבולת לפחות 30 שניות.</li>
		<li>העבר 50 μL של microbeads מגנטי לכל 1 מ"ל של PBMCs, כובע הצינור, והפך 2-3 פעמים לערבב.</li>
		<li>יש לשלך עד 10 מ"ל עם מאגר בידוד ופיפט בעדינות למעלה ולמטה 2-3 פעמים.</li>
		<li>מניחים את הצינור בתחנה מגנטית ודגרים ב- RT במשך 3 דקות.</li>
		<li>החזק את המגנט ואת הצינור יחד, ובתנועה אחת, להפוך את המגנט ואת הצינור יחד לשפוך את המתלה התא לתוך הצינור החדש. השלך את הצינור הישן.</li>
		<li>חזור על שלב 4.2.8 (להפחית את זמן הדגירה ל 2 דקות) ויוצקים את ההשעיה B-cell לתוך צינור חרוט נקי.</li>
		<li>תאי B המועשרים מוכנים לשימוש. אם ייעשה שימוש מיידי בתאים, המשך לסעיף 4.3 (הרחבת תאי B אנושיים). בדוק את הטוהר של תאי B המבודדים לפי ציטומטריית זרימה (אופציונלי). אם יש להקפיא תאים לפני השימוש, המשך לשלב 4.2.12.</li>
		<li>כדי להקפיא את תאי B, צנטריפוגה ב 400 × g במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה.</li>
		<li>resuspend התאים במדיום הקפאה ב 107 תאים / מ"ל, ו aliquot 1 מ"ל / cryovial.</li>
		<li>מניחים את ההקפאה במיכל ההקפאה המצונן, ומאחסנים ב -80 מעלות צלזיוס לילה; לאחר מכן, להעביר את cryovial קפוא למיכל חנקן נוזלי; לשמור על תאים קפואים עד שנה אחת. הערה: התשואה הצפויה של תאי B מבודדים היא 2%-8% מסך המחשבים האישיים, עם כדאיות של 95%-99%.</li>
	</ol></li>
	<li>הרחבת תאי B אנושיים הערה: אם אתה משתמש בתאי B מבודדים זה עתה, דלג על שלבים 4.3.1-4.3.5. לספור את התאים ולהעביר את מספר התאים הנדרש לתוך צינור חרוט סטרילי ולהמשיך עם שלב 4.3.6.<ol>
<li>סרום שור עוברי חם מראש (FBS) באמבט מים לפני הפשרת תאי B. הכינו 20 מ"ל של מדיום הרחבת תאי B, העבירו לבקבוק T25, ושווים מראש את המדיום באינקובטור תרבית רקמות (ב-37 °C (37 °C, 5% CO2, עם לחות) לפחות 15 דקות לפני השימוש.</li>
		<li>להפשיר תאי B באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בזמן ההמתנה, להעביר 2 מ"ל של FBS שחומם מראש לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל חרוט.</li>
		<li>לאחר תאי B מופשרים לחלוטין, מיד להוסיף 1 מ"ל של FBS מחומם מראש, טיפה חכם, לתוך המדגם. דגירה ב- RT למשך דקה.</li>
		<li>בעדינות פיפטה כדי resuspend את המדגם ולהעביר את כל נפח, dropwise, לתוך צינור חרוט המכיל 2 מ"ל של FBS מחומם מראש.</li>
		<li>העלה את עוצמת הקול ל- 15 מ"ל עם PBS סטרילי של 1x, כיפה והפך את הצינור בעדינות 2-3 פעמים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות.</li>
		<li>להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה התא, resuspend גלולה התא עם 1 מ"ל של מדיום הרחבה B-cell שווה מראש, ולספור את התאים. מספר התא הכולל צריך להיות כ- 107 תאים.</li>
		<li>העבר את התאים לבקבוק המכיל 20 מ"ל של מדיום הרחבת תאי B המשווונים מראש. הריכוז הסופי של התאים צריך להיות כ 5 x 105 תאים / מ"ל.</li>
		<li>דגירה אנכית של הבקבוק באינקובטור של תרבית רקמות.</li>
		<li>רענן את מדיום ההרחבה לחלוטין כל יומיים על ידי העברת כל נפח תאי B לצינור חרוט סטרילי וחזר על שלבים 4.3.6–4.3.9. הערה: בקבוקון T25 יכול להכיל 10-20 מ"ל של בינוני; בקבוקון T75 יכול להכיל עד 20-60 מ"ל של בינוני.</li>
	</ol></li>
</ol>5. הנדסת תאי B אנושית ראשונית
<ol><li>מהנדס B תאים ב 48 ± 2 שעות לאחר הרחבה / הפעלה לקבלת תוצאות אופטימליות. הכינו את מדיום הרחבת תאי ה-B, aliquot 1 מ"ל של המדיום לצלחת תרבית רקמות של 48 באר, וקדם-שיווי משקל באינקובטור של תרבית רקמות לפחות 15 דקות לפני השימוש. הערה: בעת עיצוב CRISPR/Cas9 sgRNA עבור גן מעניין, בצע את השלבים המפורטים להלן. - עיצוב sgRNAs באמצעות כלי מקוון11. - עיצוב sgRNAs על אקסון המשותף לכל isoforms של החלבון. - להזמין sgRNA שונה כימית מחברות מכובדות. - sgRNA בדרך כלל מגיע בצורה lyophilized; לשקם sgRNA ב DNase / RNase סטרילי ללא טריס-EDTA (TE) מאגר לריכוז של 1 מיקרוגרם / μL.</li>
	<li>הכן CRISPR / Cas9 מצע transfecting על ידי ערבוב 1 μL (1 מיקרוגרם / μL) של sgRNA שונה כימית עם 1.5 μL (1 מיקרוגרם / μL) של נוקם סטרפטוקוקוס שונה כימית Cas 9 (S.p. Cas9) גרעין לכל תגובת transfection. לפקד, השתמש ב- μL אחד של מאגר TE במקום ב- sgRNA. הערה: כאשר CD19 sgRNA משמש לניסוי KO בגן, ראה איור 2 לקבלת תוצאות. כש-AAVS1 sgRNA משמש לניסוי KI בגנים, ראו איור 5 לתוצאות.<ul>
<li>שמור את כל הרכיבים על קרח.</li>
	</ul></li>
	<li>מערבבים בעדינות ומעבירים 2.5 μL של CRISPR / Cas9 מצע חוצה לכל תגובה לתוך צינור של 0.2 מ"ל 8 צינור רצועה; מניחים בצד ב-RT.</li>
	<li>הפעל גרעין (אלקטרופורטור), והכן ריאגנטים transfection כפי שמוצג בטבלה 1. הערה: זהו צעד טוב להפסקה, במידת הצורך, על ידי הצבת כל ריאגנטים על קרח. הסר את כל ריאגנטים מקרח כאשר מוכן לחדש את הניסוי. בעת שימוש בחלבון S.p. Cas9, החוקר חייב מראש מורכב CRISPR / Cas9-sgRNA ריבונוקלאופרוטאין על ידי ערבוב 1 מיקרוגרם sgRNA עם 5 מיקרוגרם של חלבון S.p. Cas9, הימנעות כל בועות, דגירה התערובת ב RT לפחות 20 דקות לפני השימוש לקבלת תוצאות אופטימליות.</li>
	<li>לספור ולהעביר 106 תאי B לכל תגובת transfection לתוך צינור חרוט סטרילי.</li>
	<li>העלה את עוצמת הקול ל-15 מ"ל עם PBS סטרילי של 1x, וצנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות. בזמן ההמתנה, הכינו את ריאגנט transfection התא הראשי (טבלה 2) והניחו בצד ב- RT.</li>
	<li>להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה התא.</li>
	<li>Resuspend גלולת התא עם 10 מ"ל של סטרילי 1x PBS וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>להשליך את supernatant לחלוטין מבלי להפריע גלולה התא.</li>
	<li>העבר 0.5 מיקרוגרם של MRNA GFP שונה כימית (ככתב transfection) לכל 106 תאים B לכדור התא (אופציונלי).</li>
	<li>Resuspend גלולת התא עם 20 μL תא ראשי transfection מגיב לכל 106 תאי B; מערבבים בעדינות על ידי pipetting 5-6 פעמים. העבר 20.5 μL לכל תגובת transfection לתוך הצינור 0.2 מ"ל של רצועת 8 צינור המכיל 2.5 μL של מצע TRANSFection CRISPR / Cas9.</li>
	<li>פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת כדי לערבב ולהעביר את כל נפח (23 μL) לתוך cuvette transfection. מכסים ומקשים בעדינות על הקובטה שעל הספסל כדי להבטיח שהנוזל מכסה את תחתית הקובט.</li>
	<li>השתמש בפרוטוקול B-cell ראשי אנושי על הגרעין עבור transfection. הערה: ניתן למקם את הגרעין (אלקטרופורטור) ולהשתמש בו מחוץ למכסה המנוע של תרבות הרקמות. כיפה cuvette כדי להבטיח סטריליות.</li>
	<li>מניחים את התאים האלקטרופוטים בקובט ב- RT למשך 15 דקות.</li>
	<li>העבר 80 μL של מדיום הרחבת תאי B המשווונים מראש מלוח תרבית הרקמה לתגובת transfection ב cuvette. מניחים את הקובטה באינקובטור תרבית הרקמות במשך 30 דקות.</li>
	<li>בעדינות פיפטה כמה פעמים כדי לערבב ולהעביר את כל נפח המדגם מן cuvette לבאר המתאימה של צלחת 48-באר רקמה תרבות המכיל 1 מ"ל של מדיום הרחבת B-cell. הריכוז הסופי של התאים צריך להיות 106 תאים / מ"ל.</li>
	<li>אם מבצעים ניסוי KI גן, להעביר rAAV6 וקטור ב 500,000 ריבוי של זיהום לתוך הבאר המתאימה המכילה תאים electroporated (כ 45 דקות לאחר electroporation). ראו מבנה וקטורי rAAV6 לדוגמה באיור 4A. הערה: לדוגמה: דגימת בקרה תיקרא אלקטרופוטית ללא CRISPR/Cas9 או הווקטור rAAV6. דגימה וקטורית בלבד תטופל ללא CRISPR/Cas9 ולאחר מכן תשתנה עם הווקטור rAAV6. דגימת KI תהיה electroporated עם CRISPR /Cas9 ולאחר מכן להיות transduced עם וקטור rAAV6. rAAV6 חייב להכיל זרועות הומולוגיות במעלה ובמורד הזרם של אתר DSB היעד עבור HDR.</li>
	<li>מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 עם לחות.</li>
	<li>ספור את התאים ואת יכולת הקיום של הרשומה ביום הראשון שלאחר ההנדסה.</li>
	<li>רענן את מדיום ההרחבה של תאי B כל יומיים על-ידי ספירת התאים ולאחר מכן העברת כל נפח התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 × g במשך 5 דקות, ולזרוק את supernatant מבלי להפריע גלולה. לשים מחדש את התאים עם 100 μL של מדיום הרחבת תאי B טריים, ולהעביר לבאר של צלחת תרבית רקמות 24-גם. העלה את הנפח הבינוני כדי להשיג ריכוז תאים סופי ב 5 × 105 תאים / מ"ל. הערה: צלחת 48 באר יכול להחזיק עד 1 מ"ל בינוני / טוב; צלחת 24 באר יכול להחזיק עד 2 מ"ל בינוני / טוב; צלחת 12-באר יכול להחזיק עד 4 מ"ל בינוני / טוב, צלחת 6-באר יכול להחזיק עד 8 מ"ל בינוני / טוב.</li>
	<li>אפשר לתאים המהונדסים להתרחב לפחות 5 ימים לפני ביצוע ניתוחים במורד הזרם, כגון ניתוח ציטומטריית זרימה, ניתוח TIDE ו- PCR של צומת.</li>
</ol>

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells.">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li><li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion.">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li><li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status.">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li><li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes.">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li><li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells.">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li><li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li><li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR/Cas9+targeted+nuclease.">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144 (2018).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+editing:+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells.">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li><li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jim&#233;nez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture.">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li><li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome.">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404 (2014).</li><li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

הוגש פטנט על שיטות ייצור ושימוש בתאי B ערוכים בגנום עם M.J.J. , K.L., ו B.S.M כממציאים. B.S.M היא יועצת ובעלת מניות Immusoft Inc. Immusoft Inc מימנה מחקר במעבדה של B.S.M.

הנדסת גנום מדויקת בתאי B אנושיים ראשוניים הייתה מאתגרת עד לאחרונה9,10. פרסמנו בעבר פרוטוקולים באמצעות CRISPR/Cas9 כדי להנדס תאי B אנושיים ראשוניים9. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים משופרים עבור בידוד B-cell, הרחבה, והנדסה כדי לאפשר KO יעיל של CD19 או לדפוק ב EGFP.
כאן אנו מראים כי פרוטוקול ההתרחבות שלנו מאפשר התרחבות מהירה של תאי B בתרבות להרחבה של עד פי 44 תוך 7 ימים (איור 1). פרוטוקול זה הראה קצב התרחבות מהיר יותר מאלה שדווחו על ידי Johnson et al.9 ו- Hung et al.10 הצעדים הקריטיים להבטחת התרחבות בריאה ומהירה של תאי B ראשוניים מחדשים את המדיום עם גורמי הפעלה טריים כל יומיים ומבטיחים שמספר תאי B הכוללים בתרבות לא יעלה על 2 × 106 תאים / מ"ל.
מצאנו גם שהפרוטוקול המשופר שלנו להדבקת מערכת CRISPR/Cas9 עבור CD19 KO הביא ליעילות גבוהה של CD19 KO(איור 2 ואיור 3). בדומה למחקר קודם9, ראינו ירידה קלה בהתאוששות התא ואת הכדאיות לאחר electroporation ב 24 שעות. זה מציין כי electroporation משפיע על בריאות התא הכוללת של תאי B ראשוניים; עם זאת, התאים בסופו של דבר ריבאונד בתוך 48 שעות (נתונים לא מוצגים).
היתרון של שימוש בפרוטוקול electroporator זה הוא שאנחנו יכולים electroporate דגימות בקצב הרבה יותר מהר (16 תגובות בפחות מ 1 דקות), ואילו פרוטוקוליםקודמים 9,10 לקחת בערך 10-12 דקות עבור 16 תגובות. בנוסף, מערכת transfection זה מבטל את הקשת החשמלית הפוטנציאלית של electroporator שנצפה במחקריםקודמים 9,10. יתר על כן, ניתן לשנות את קנה המידה של שיטה הנדסית זו עבור מספר גדול יותר של תאי B באמצעות cuvettes גדולים יותר, זמינים מסחרית (נתונים שאינם מוצגים).
כמה צעדים קריטיים כדי להבטיח בריאות אופטימלית הכוללת של התא ויעילות KO: ראשית, להבטיח כי אמצעי הרחבת B-cell מוכן מראש שווה לפחות 15 דקות לפני השימוש. שנית, הנפח הכולל של מצע transfection לא יעלה על 20% (v / v) של מגיב הגרעין. שלישית, יש להרחיב/להפעיל את התאים למשך 48 ± 2 שעות לקבלת תוצאות מיטביות. רביעית, הקש בעדינות על קובט האלקטרופורציה לפני הצבת האלקטרופורטור כדי להבטיח שתמיסת תגובת ההעתקה מכסה את תחתית הקובט. החמישית, הקפד לנוח את התאים electroporated ב cuvette רק 15 דקות ב RT; השארת תאים בגרעין מגיב לאחר electroporation במשך זמן רב מדי יכול לפגוע בהישרדות התא הכולל. שישית, הקפד להדגיר את התאים עם מדיה cuvette במשך לא יותר מ 30 דקות. שביעית, הצבת 106 תאים electroporated ב 1 מ"ל עבור 48 h הראשון נוטה לעזור לתאים להתאושש מהר יותר מאשר culturing אותם בצפיפות נמוכה יותר (נתונים לא מוצגים). לבסוף, שימוש בחלבון Cas9 mRNA או Cas9 יגרום ליעילות עריכה דומה (נתונים שאינם מוצגים); עם זאת, השתמשנו Cas9 mRNA לנוחות ועלות.
שני חששות עיקריים בעת שימוש CRISPR/Cas9 הם השפעות מחוץ ליעד ו translocations כרומוזומלי. השפעות מחוץ ליעד הנגרמות על ידי זוגות בסיס לא תואמים של sgRNA לרצף היעד, להוביל לאתרי קשירה אפשריים רבים על הגנום וליצור מרובים, גנים לא רצויים KOs. לכן, יש לקחת בחשבון את הציון החזוי מחוץ ליעד יחד עם הציון ביעד כדי למזער את הבעיה. טרנסלוקציה כרומוזומלית יכולה להתרחש עקב השפעות מחוץ ליעד או כאשר מפילים גנים מרובים. זה יכול לגרום לאירועים קטסטרופליים באופן ניסיוני וקליני. עורכי בסיס12 לשנות נוקלאוטידים יחיד (שתי מחלקות: עורך בסיס ציטוצין ועורך בסיס אדנין) כדי לשבש את אלמנט שחבור, כדי ליצור קודון עצירה מוקדמת, או כדי ליצור מוטציה נקודה, המוביל לגן היעד KO ללא DSB (נבדק בהרחבה במקומותאחרים 12). לכן, הגישה הבסיסית לעריכת יכול לשמש KOs יחיד או מרובה גנים לעקוף טרנסלוקציות כרומוזומליות.
אנו גם מדגימים כי CRISPR/Cas9, יחד עם rAAV6, ניתן להשתמש כדי לתווך ביעילות KI ספציפי לאתר וביטוי של EGFP ב- AAVS1 לוקוס. ראינו ביטוי EGFP לפחות 12 ימים לאחר ההנדסה. ראינו גם שתי אוכלוסיות חיוביות ל-EGFP: ביטוי EGFP גבוה ובינוני במדגם KI ביום 12 (איור 5A),ואילו המדגם הווקטורי בלבד הראה אחוז מינימלי של תאים עם ביטוי EGFP ביניים. אנו משערים כי תופעה זו של "אוכלוסיות גבוהות ובינוניות" נובעת משילוב ביאלי של הווקטור. חקירה נוספת באמצעות PCRפורש 13 של תאי ביניים וגבוהים EGFP ניתן לעשות כדי לאשר השערה זו. שתי אזהרות על שימוש ב- AAV כווקטור: ראשית, לווקטורים של AAV יש קיבולת מטען קטנה, עד 4.7 קילו-בייס, הגורמת לבעיות בעת דפיקות בגן גדול. הקטנת גודל זרועות ההומולוגיה תאפשר לינה של גן גדול יותר, אשר בתורו יקטין את יעילות KI (נתונים לא מוצגים). לחלופין, ניתן להשתמש בשילוב בו זמני או רציף של וקטורים רבים לטעינתגנים 14,15. מחקרים דיווחו על תגובה חיסונית וסיווג של תאים שעברו עירוי AAV במודלים של בעלי חיים חיסוניים16,17. לחלופין, ניתן לחקור תבנית HDR של תורם שאינו מבוסס ויראלי כדי לעקוף בעיה זו.
לסיכום, הוכחנו תהליכים מקיפים, צעד אחר צעד של בידוד, התרחבות והנדסה של תאי B שהביאו ליעילות גבוהה של שינויים בגנים. שיטה הנדסית זו יכולה לשמש עבור הגן KO וללמוד את הפונקציות של גנים בתאי B. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש להנדסת תאי B כדי לבטא נוגדן רקומביננטי להילחם נגד זיהום. לבסוף, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מהנדס תאי B כדי לבטא ולהפריץ אנזימים טיפוליים שיכולים לשמש כטיפול מבוסס תאים אוטולוגי לטיפול באנזימופתיות.

תאי B הם תת-קבוצה של שושלת הלימפוציטים המופקת מתאי גזע hematopoietic. הם מבצעים תפקיד קריטי במערכת החיסון ההומוריסטית האדפטיבית על ידי ייצור כמויות גדולות של נוגדנים בתגובה לאתגרים החיסוניים1. תאי B הם גם סימנים מקדימים של תאי זיכרון B ותאי פלזמה מובחנים, ארוכי טווח, ובכך מספקים חסינות הומוריסטית מתמשכת2. תאי פלזמה, בפרט, הם ייחודיים בקרב תאי החיסון ביכולתם לייצר כמויות גדולות של נוגדן מסוים תוך כדי הישרדות במשך שנים או עשרות שנים3. בנוסף, קלות הבידוד מדם היקפי הופכת את שושלת התאים B למועמד מצוין לטיפולים חדשניים מבוססי תאים4.
בעבר, שיטות אינטגרציה אקראיות, כגון אלה באמצעות וקטורים lentiviral או טרנספוזון היפהפייה הנרדמת, שימשו להנדסת תאי B עבור משלוח transgene וביטוי5,6,7,8. עם זאת, האופי הלא ספציפי של גישות אלה מקשה על חקר הפונקציות הביולוגיות של גן מסוים בתאי B ונושא סיכון אינהרנטי של מוטגנזה הכנסתית וביטוי טרנסג'ין משתנה ו / או השתקה בסביבה הטיפולית.
מערכת CRISPR/Cas9 היא כלי הנדסת גנום רב עוצמה המאפשר לחוקרים לערוך במדויק את הגנום של תאים שונים במינים רבים. לאחרונה, שתי קבוצות, כולל שלנו, פיתחו בהצלחה שיטות להרחבת ex vivo והנדסת גנום ממוקדת של תאי B אנושיים ראשוניים9,10. נתאר את התהליך של טיהור תאי B אנושיים ראשוניים מדגם לוקאפורזיס. לאחר מכן, נתאר את הפרוטוקול המעודכן שלנו להרחבת תאי B ולהפעלה של תאי B מבודדים. לאחר מכן נתאר תהליך להדחת אשכול של בידול 19 (CD19), קולטן B-cell ספציפי וסימן ההיכר של תאי B, על ידי electroporation להציג CRISPR / Cas9 mRNA יחד עם CD19 sgRNA לתוך תאי B פעילים.
Cas9 mRNA מתורגם ונקשר ל- CD19 sgRNA כדי ליצור קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP) CRISPR/Cas9-sgRNA. לאחר מכן, sgRNA במתחם מוביל Cas9 ליצור שבר גדיל כפול (DSB) ברצף היעד על exon 2 של הגן. התאים יתקנו את ה- DSB על ידי "הצטרפות קצה לא הומולוגית" על ידי החדרה או מחיקה של נוקלאוטידים, מה שיוביל למוטציה של frameshift ויגרום לגן להיות בנוקאאוט. לאחר מכן נמדוד את אובדן CD19 על ידי ציטומטריית זרימה וננתח היווצרות אינדל על ידי מעקב אחר אינדלים על ידי ניתוח פירוק (TIDE).
לאחר מכן נתאר את תהליך השימוש ב- CRISPR/Cas9 יחד עם וקטור AAV6 רקומביננטי (rAAV6, תבנית תורמת לתיקון מונחה הומולוגיה (HDR)) כדי לתווך בהכנסה ספציפית לאתר של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר(EGFP) בגן שילוב וירוסים הקשורים לאדנו 1 (AAVS1). גן AAVS1 הוא מוקד פעיל ללא פונקציות ביולוגיות ידועות ואתר אינטגרציה נגיפי AAV על הגנום האנושי; לכן, הוא נחשב "נמל בטוח" להנדסת גנום. כאן אנו מדווחים כי התרחבות והפעלה של תאי B אפשרו התרחבות של עד פי 44 ב-7 ימי תרבות (איור 1). אלקטרופורציה של תאי B הראתה ירידה קלה בבריאות הכללית של התאים (איור 2A) ב-24 שעות לאחר ההעברה. ניתוח התוויית פיזור של סמן CD19 (איור 2B) הראה ירידה של עד 83% בתאים הערוכים (איור 2C).
ניתוח TIDE של הכרומטוגרפים (איור 3A) גילה כי % indels היה דומה לאחוז אובדן החלבון על ידי ציטומטריית זרימה(איור 3B). ניתוח ציטומטריה זרימה של ניסוי KI הראה כי התאים שקיבלו וקטור AAV (איור 4), יחד עם RNP, הביעו עד 64% תאים חיוביים ל- EGFP (איור 5A) ומאוחר יותר הציגו אינטגרציה מוצלחת על ידי תגובת שרשרת פולימראז צומת (PCR) (איור 5B). ספירת תאים הראתה כי כל הדגימות התאוששו במהירות בתוך 3 ימים לאחר ההנדסה (איור 5C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

תאי B הם לימפוציטים שמקורם בתאי גזע ההמטוטופיאטיים והם מרכיב מרכזי בזרוע ההומוריסטית של מערכת החיסון האדפטיבית. הם עושים מועמדים אטרקטיביים לטיפולים מבוססי תאים בגלל קלות הבידוד שלהם מדם היקפי, היכולת שלהם להתרחב במבחנה, ואת תוחלת החיים שלהם vivo. בנוסף, ניתן להשתמש בתפקוד הביולוגי התקין שלהם – כדי לייצר כמויות גדולות של נוגדנים – כדי לבטא כמויות גדולות מאוד של חלבון טיפולי, כגון נוגדן רקומביננטי למלחמה בזיהום, או אנזים לטיפול באנזימופתיות. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לבידוד תאי B אנושיים ראשוניים מתאי מונונוקלור דם היקפיים (PBMCs) והפעלה/הרחבה של תאי B מבודדים במבחנה. לאחר מכן אנו מדגימים את השלבים הכרוכים בשימוש במערכת CRISPR/Cas9 עבור KO ספציפי לאתר של גנים אנדוגניים בתאי B. שיטה זו מאפשרת KO יעיל של גנים שונים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של גנים מעניינים. לאחר מכן אנו מדגימים את השלבים לשימוש במערכת CRISPR/Cas9 יחד עם וקטור רקומביננטי, הקשור לאדנו, ויראלי (rAAV) לשילוב יעיל ספציפי לאתר של קלטת ביטוי טרנסג'ין בתאי B. יחד, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה הנדסית צעד אחר צעד שניתן להשתמש בה בתאי B אנושיים ראשוניים כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים, כמו גם לפיתוח טיפולי B-cell.

פרוטוקול ההרחבה וההפעלה המעודכן איפשר התרחבות מהירה של תאי B עד פי 44 ב-7 ימים (איור 1; n =3 תורמים). בניסוי KO, ספירת תאי B באמצעות כתמים כחולים Trypan הראה יותר מ 80% תאים קיימא עם ירידה קלה בשחזור התא הן את הפקד ואת דגימות CD19 KO ב 24 שעות לאחר electroporation (איור 2A;p ≥ 0.05, n = 3 תורמים). תוצאה זו מצביעה על כך שאלקטרופורציה השפיעה מעט על הבריאות הכללית של תאי B. תאי B נאספו ביום 5 שלאחר ההעברה לניתוחי ציטומטריית זרימה ו- TIDE. חלקות פיזור מייצגות של הפקד ודגימת KO הראו 14% ו-95% תאים CD19 שליליים, בהתאמה (איור 2B). כמות החלקות הזרימה הראתה ירידה משמעותית בביטוי CD19 בדגימות KO בהשוואה לבקרה (איור 2B;p ≤ 0.0001, n = 3 תורמים). כרומטוגרמות של רצף גנומי (ראה רצפי פריימר בטבלה 3)הראו פסגות כפולות בתאי CD19 KO B, המציינות הכנסות/מחיקות של נוקלאוטידים לאחר CRISPR/Cas9 בתיווך DSB, בעוד ששיאים בודדים נצפו בפקד, מה שמצביע על כך שלא התרחש DSB במדגם זה (איור 3A). ניתוח Indel של הכרומטוגרפים (באמצעות כלי ניתוח TIDE מקוון חינם) של דגימות KO הראה אחוז גבוה של היווצרות indel (>90%) ב- CD19 locus, אשר עולה בקנה אחד עם % אובדן חלבון CD19 זוהה על ידי cytometry זרימה (איור 3B;p ≥ 0.05, n = 3 תורמים). תוצאות אלה מצביעות על כך ש- CRISPR/Cas9 יצר ביעילות CD19 KO בתאי B. תאי B מניסוי KI נאספו ביום 12 שלאחר ההנדסה עבור ניתוחי PCR של זרימה וצומת PCR (טבלה 4). חלקות פיזור הראו 64% מהתאים החיוביים של EGFP במדגם שקיבל את הווקטור rAAV6 (איור 4) יחד עם RNP, בעוד שלא נצפה תא חיובי ל- EGFP בפקד; דגימה מינימלית של חיוביות EGFP נצפתה במדגם שקיבל וקטור AAV בלבד (איור 5A). הגברה של PCR בצומת (ראו רצפי פריימר בטבלה 3)הראתה 1.5 קג"מ בדגימה KI (איור 5B),בעוד שאף מוצר PCR לא נצפה בדגימה של הפקד או של הווקטור בלבד. ספירות תאים הראו כי התהליך ההנדסי משפיע על שחזור התאים במדגם KI יותר מהפקד או מהדגימות הווקטוריות בלבד (איור 5B). עם זאת, כל הדגימות התאוששו במהירות תוך 3 ימים לאחר ההנדסה (איור 5B). יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך ששילוב מוצלח של EGFP בלוקוס AAVS1 מוביל לביטוי יציב של EGFP לפחות 12 ימים לאחר ההנדסה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig01.jpg"> איור 1: הרחבת תא B במבחנה. תאי B נזרעו ב 1 × 106 תאים ביום 0 (אפס) בצפיפות של 5 × 105 ל mL והרחיב 44-פי 7 ימים (n = 3 תורמים עצמאיים). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02a.jpg"> איור 2A: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02alarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02b.jpg"> איור 2B: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02blarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2C" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02c.jpg"> איור 2C: הסתרת CD19 בתיווך CRISPR/Cas9 (KO) בתאי B. (A) גרף עמודות מציג >70% שחזור תאים (לוח שמאל) ו >80% הכדאיות (לוח ימני) של תאים לאחר transfection נצפו הן בדגימות הבקרה והן בדגימות CD19 KO ב 24 שעות לאחר electroporation. (B) התוויות זרימה מייצגות של CD19 gating של תאים חיים מראה 84.3% ו 3.43% CD19 חיובי תאים במדגם הפקד ואת מדגם CD19 KO, בהתאמה. (C) גרף עמודות מראה הפחתה משמעותית של CD19 בקבוצה CD19 KO בתיווך CRISPR/Cas9 (p ≤ 0.0001). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02clarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig03a.jpg"> איור 3A: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig03alarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig03b.jpg"> איור 3B: אובדן חלבון CD19 לעומת היווצרות אינדל. (A)כרומטוגרמות מתארות פסגות רצף של דוגמת ההסתרה (KO) של הפקד ו- CD19. התיבה האפורה בפסגות הפקד מדגישה את רצף היעד של CD19 gRNA עם אתר החיתוך החזוי המצוין על-ידי חץ. CD19 KO הראה רצף "פסגות כפולות" סביב אתר החיתוך החזוי, המציין הכנסה/מחיקה של נוקלאוטידים לאחר ההפסקה הכפולה. (B) גרף עמודות המציג תוצאות עקביות בין אובדן חלבון % CD19 לבין היווצרות % indel ב- CD19 locus (p ≥ 0.05). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig03blarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig04.jpg"> איור 4: מבנה וקטורי RAAV6 AAVS1 MND-GFP. קלטת הביטוי מכילה רצף חזק של מקדם סינתטי (MND), ומיד אחריו רצף קידוד משופר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ורצף אדנילציה פולי (Poly A). זרועות הומולוגיה AAVS1 לאגף במעלה הזרם של מקדם MND במורד הזרם של רצפי פולי A. EGFP יתבטא תחת הרגולציה של מקדם MND. אורכי רצף מצוינים מעל כל רכיב של המבנה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05a.jpg"> איור 5A: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05alarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05b.jpg"> איור 5B: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05blarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5C" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05c.jpg"> איור 5C: שילוב ספציפי לאתר בתיווך CRISPR/Cas9 ו- rAAV6 של קלטת הכתבים של EGFP בתאי B ביום ה-12 שלאחר ההנדסה. (A) התוויית זרימה מייצגת אינה מציגה תאים B חיוביים ל- EGFP בפקד או במדגם הווקטורי בלבד לעומת 64.4% מתאי EGFP חיוביים B מדגם ה- knockin (KI). (B) תגובת שרשרת פולימראז צומת של מדגם KI מראה את הלהקה החזויה 1.5 Kbps; לא נמצאה רצועה בפקד או בדוגמת וקטור בלבד. מים שימשו כדי להבטיח שום זיהום במהלך תהליך PCR. (C) גרף עמודות מתאר את צמיחת התאים של הפקד, את הווקטור בלבד ואת דגימות EGFP-KI על פני תקופה של 3 ימים לאחר ההנדסה. קו מנותק מציין את קלט התא 1 ×10 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05clarge.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שם</td>
			<td>רצף gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>5'-GCTGTGCTGGTGTCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>AAVS1</td>
			<td>5'-GTCACCAATCCTGTCTCTAG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: רצפי gRNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ריאגנטים</td>
			<td>עוצמת קול לתגובה אחת</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון תא ראשי P3</td>
			<td>16.4 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>תוספת 1</td>
			<td>3.6 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>הכולל</td>
			<td>20 מ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: הכנת תערובת מגיבים של Nucleofection.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תיאור</td>
			<td>רצף</td>
			<td>מטרה</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימטרים קדמיים של CD19</td>
			<td>5'-AAATTCAGGAGGGGGGGAAG-3'</td>
			<td>להגביר את לוקוס CD19 לניתוח Indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>תמיר הפוך CD19</td>
			<td>5'-GCGGACCTCCTCTTCCATG-3'</td>
			<td>להגביר את לוקוס CD19 לניתוח Indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר קדימה של PCR צומת</td>
			<td>5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3'</td>
			<td>PCR של צומת</td>
		</tr>
<tr>
<td>צומת PCR הפוך פריימר</td>
			<td>5'-גאגאגטגטגאקאקקטק-3</td>
			<td>PCR של צומת</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: נעשה שימוש בפריימריז.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תיאור</td>
			<td>פלואורופור</td>
			<td>שיבוט</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19 אנטי-אנושי</td>
			<td>PerCP (פרCP)</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>צבע הכדאיות</td>
			<td>eפלור 780</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: נוגדן ציטומטרי זרימה וצבע הכדאיות.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להנדסת גנום מבוסס CRISPR / Cas9 של תאי B אנושיים ראשוניים לנוקאאוט גנים (KO) ו knock-in (KI) כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים בתאי B ופיתוח של טיפולי B-cell.

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K Views.  University of Minnesota. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להנדסת גנום מבוסס CRISPR / Cas9 של תאי B אנושיים ראשוניים לנוקאאוט גנים (KO) ו knock-in (KI) כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים בתאי B ופיתוח של טיפולי B-cell.

Video: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection גרוס פיין epithelia של האוזן הפנימית חושית למבוגרים דג הזברה ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...