Questo lavoro è stato finanziato dal Children's Cancer Research Fund (CCRF) e dal NIH R01 AI146009 al B.S.M.

Campioni di leucferesi da donatori sani sono stati ottenuti da una banca del sangue locale. Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati determinati come esenti per la ricerca dall'Institutional Review Board (IRB) e sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Committee (IBC) dell'Università del Minnesota.
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto della precauzione universale per gli agenti patogeni ematici, con tecniche sterili / asettiche e adeguate apparecchiature di livello-2 di biosicurezza.
1. Preparare integratori per il mezzo di espansione delle cellule B
<ol><li>Ricostituire l'oligonucleotide CpG ad una concentrazione di 1 mg/mL.</li>
	<li>Ricostituire il ligando CD40 (CD40L) ad una concentrazione di 100 μg/mL.</li>
	<li>Ricostituire l'IL-10 umano ricombinante (rhIL-10) ad una concentrazione di 50 μg/mL.</li>
	<li>Ricostituire l'IL-15 umano ricombinante (rhIL-15) ad una concentrazione di 10 μg/mL. NOTA: Mantenere ogni integratore in piccole aliquote a -20 °C a -80 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>2. Preparare il mezzo basale
<ol><li>Combinare il mezzo basale a cellule B con il 5% (v/v) integratore multimediale per l'espansione delle cellule immunitarie in vitro (ad esempio, CTS Immune Cell SR) e l'1% (v/v) penicillina e streptomicina.</li>
	<li>Sterilizzare il mezzo basale utilizzando un adattatore filtrante da 0,22 μm in una bottiglia sterilizzata.</li>
	<li>Mantenere il mezzo basale a 4 °C per un massimo di 1 mese.</li>
</ol>3. Preparare il mezzo di espansione delle celle B
<ol><li>Trasferire la quantità richiesta del mezzo basale in un contenitore sterile per coltura delle cellule B a 5 × 105 cellule/mL.</li>
	<li>Integrare il mezzo basale con 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 e 10 ng/mL rhIL-15.</li>
	<li>Filtrare il mezzo di espansione della cella B utilizzando un filtro da 0,22 μm.</li>
	<li>Equilibrare il mezzo di espansione delle cellule B nell'incubatore di coltura tissutale a 37 °C, 5% CO2 con umidità per almeno 30 minuti prima dell'uso. NOTA: Preparare un nuovo mezzo di espansione b-cell da utilizzare per un giorno. Non preparare il mezzo di espansione della cella B da utilizzare per più giorni. Questa ricetta multimediale incoraggia la proliferazione delle cellule B della memoria e delle cellule B umane primarie attivate.</li>
</ol>4. Purificazione ed espansione delle cellule B umane
NOTA: Aggiungere il 99-100% di alcol isopropile a un contenitore di congelamento a temperatura controllata, seguendo le istruzioni del produttore, e raffreddare il contenitore di congelamento a 4 °C prima di iniziare il passaggio 4.1.
<ol><li>Isolare i PBBC da un campione di leucforesi
	<ol>
<li>Trasferire un campione di leucforesi (circa 8-10 ml) in un tubo conico sterile da 50 ml.</li>
		<li>Portare il volume a 35 mL con 1x soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS).</li>
		<li>Sovrapporre con cura un campione di leucforesi da 35 mL su 15 mL di mezzo gradiente di densità.</li>
		<li>Centrifugare a 500 × g per 25 minuti senza freno, rimuovere lo strato plasmatico senza disturbare il cappotto buffy (strato PBMC), raccogliere i PBMC dall'interfaccia e trasferirli in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml.</li>
		<li>Portare i PBBC a 50 mL con 1 PBS.</li>
		<li>Centrifuga a 500 × g per 5 minuti senza freno. Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet PBMC, che può apparire rosso.</li>
		<li>Aggiungere 7 mL di tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio, pipettare 3 volte per mescolare bene e incubare a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti.</li>
		<li>Portare il volume a 50 mL con 1x PBS.</li>
		<li>Centrifuga a 400 × g per 5 min con freno a bassa resistenza. Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Il pellet dovrebbe apparire rosato o bianco. NOTA: Per continuare a colturare le cellule B appena isolate, preparare il mezzo di espansione della cella B prima di iniziare l'isolamento delle cellule B (passaggio 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento delle cellule B dai PBBC utilizzando il kit di isolamento negativo delle cellule B primarie umane
	<ol>
<li>Resuspend PBBC nel tampone di isolamento a una concentrazione di 5 × 107 celle/mL. NOTA: se il numero totale di PBBC è inferiore a 5 × 107 celle, ridimensionare il volume del buffer di isolamento per mantenere 5 × 107 celle/mL. I volumi minimi e massimi di sospensione cellulare sono rispettivamente di 0,25 mL e 8 mL.</li>
		<li>Trasferire fino a 8 mL (5 × 107 celle/ml) in un tubo sterile, polipropilene, fondo rotondo con tappo.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL/mL di Cocktail Enhancer ai PBPC.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL/mL di Isolation Cocktail ai PBPC, limitare il tubo e invertire 2-3 volte per mescolare.</li>
		<li>Incubare a RT per 5 min; al4° minuto di incubazione, microperline magnetiche a vortice per almeno 30 s.</li>
		<li>Trasferire 50 μL di microperline magnetiche per 1 ml di PBBC, limitare il tubo e invertire 2-3 volte per mescolare.</li>
		<li>Ricaricare fino a 10 mL con tampone di isolamento e pipettare delicatamente su e giù 2-3 volte.</li>
		<li>Posizionare il tubo in una stazione magnetica e incubare a RT per 3 minuti.</li>
		<li>Tenere insieme il magnete e il tubo e, in un unico movimento, invertire il magnete e il tubo insieme per versare la sospensione cellulare nel nuovo tubo. Scartare il vecchio tubo.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.2.8 (ridurre il tempo di incubazione a 2 minuti) e versare la sospensione b-cell in un tubo conico pulito.</li>
		<li>Le cellule B arricchite sono pronte all'uso. Se le cellule verranno utilizzate immediatamente, continuare alla sezione 4.3 (Espansione delle cellule B umane). Controllare la purezza delle cellule B isolate per citometria a flusso (opzionale). Se le cellule devono essere congelate prima dell'uso, continuare al passaggio 4.2.12.</li>
		<li>Per congelare le cellule B, centrifugare a 400 × g per 5 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Rimospend le cellule in mezzo congelante a 107 cellule/mL e aliquota 1 mL/crioviale.</li>
		<li>Posizionare il crioviale nel contenitore di congelamento refrigerato e conservare a -80 °C durante la notte; quindi, trasferire il criooviale congelato in un serbatoio di azoto liquido; mantenere le cellule congelate fino a 1 anno. NOTA: la resa prevista delle cellule B isolate è del 2%-8% dei PBBC totali, con una vitalità del 95%-99%.</li>
	</ol></li>
	<li>Espansione delle cellule B umane NOTA: se si utilizzano celle B appena isolate, ignorare i passaggi da 4.3.1 a 4.3.5. Contare le cellule e trasferire il numero richiesto di cellule in un tubo conico sterile e continuare con il passaggio 4.3.6.<ol>
<li>Siero bovino fetale pre-caldo (FBS) in un bagno d'acqua prima di scongelare le cellule B. Preparare 20 ml di mezzo di espansione delle cellule B, trasferire in un pallone T25 e pre-equilibrare il mezzo in un incubatore di coltura tissutale (a 37 °C, 5% DI CO2, con umidità) almeno 15 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Scongelare le cellule B in un bagno d'acqua a 37 °C. Durante l'attesa, trasferire 2 ml di FBS pre-riscaldato in un tubo conico sterile da 15 ml.</li>
		<li>Dopo che le cellule B sono state completamente scongelate, aggiungere immediatamente 1 mL di FBS pre-riscaldato, per quanto riguarda la goccia, nel campione. Incubare a RT per 1 min.</li>
		<li>Pipettare delicatamente per rimospendare il campione e trasferire l'intero volume, a goccia, in un tubo conico contenente 2 ml di FBS prerifatti.</li>
		<li>Portare il volume a 15 ml con PBS sterile 1x, cappuccio e invertire delicatamente il tubo 2-3 volte.</li>
		<li>Centrifuga a 400 × g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare, rimescolare il pellet cellulare con 1 mL di mezzo di espansione della cella B pre-equilibrato e contare le cellule. Il numero totale di cellule deve essere di circa 107 celle.</li>
		<li>Trasferire le cellule in un pallone contenente 20 ml del mezzo di espansione delle cellule B pre-equilibrate. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di circa 5 x 105 cellule/mL.</li>
		<li>Incubare il pallone verticalmente in un'incubatrice di coltura tissutale.</li>
		<li>Aggiornare completamente il mezzo di espansione ogni 2 giorni trasferendo l'intero volume di cellule B in un tubo conico sterile e ripetere i passaggi 4.3.6-4.3.9. NOTA: Il pallone T25 può contenere 10-20 ml di mezzo; Il pallone T75 può contenere fino a 20-60 ml di mezzo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ingegneria primaria delle cellule B umane
<ol><li>Progettare celle B a 48 ± 2 ore dopo l'espansione/attivazione per risultati ottimali. Preparare il mezzo di espansione delle cellule B, aliquota 1 mL del mezzo in una piastra di coltura tissutale a 48 pozze e pre-equilibrare in un incubatore di coltura tissutale almeno 15 minuti prima dell'uso. NOTA: Quando si progetta uno sgRNA CRISPR/Cas9 per un gene di interesse, seguire i passaggi descritti di seguito. - Progettare sgRNA utilizzando uno strumento online11. - Progettare sgRNA su un esone comune a tutte le isoforme della proteina. - Ordina sgRNA modificato chimicamente da aziende rispettabili. - lo sgRNA di solito si presenta in forma lëfilizzata; ricostituire lo sgRNA in tampone Tris-EDTA (TE) sterile privo di DNasi/RNasi ad una concentrazione di 1 μg/μL.</li>
	<li>Preparare il substrato transfetto CRISPR/Cas9 mescolando 1 μL (1 μg/μL) di sgRNA modificato chimicamente con 1,5 μL (1 μg/μL) di Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) di reazione di nucleasi per transfezione modificata chimicamente. Per il controllo, utilizzare 1 μL di TE buffer anziché sgRNA. NOTA: Quando lo sgRNA CD19 viene utilizzato per un esperimento gene KO, vedere la figura 2 per i risultati. Quando lo sgRNA AAVS1 viene utilizzato per un esperimento KI genico, vedere la figura 5 per i risultati.<ul>
<li>Tieni tutti i componenti sul ghiaccio.</li>
	</ul></li>
	<li>Mescolare delicatamente e trasferire 2,5 μL di substrato transfetto CRISPR/Cas9 per reazione in un tubo di un nastro a 8 tubi da 0,2 ml; accantonato a RT.</li>
	<li>Accendere un nucleofector (elettroporatore) e preparare i reagenti di trasfezione, come mostrato nella tabella 1. NOTA: Questo è un buon passo per una pausa, se necessario, mettendo tutti i reagenti sul ghiaccio. Rimuovere tutti i reagenti dal ghiaccio quando sono pronti a riprendere l'esperimento. Quando si utilizza la proteina S.p. Cas9, lo sperimentatore DEVE pre-complesso CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteina mescolando 1 μg di sgRNA con 5 μg di proteina S.p. Cas9, evitando eventuali bolle e incubando la miscela a RT per almeno 20 minuti prima dell'uso per risultati ottimali.</li>
	<li>Contare e trasferire 106 cellule B per reazione di trasfezione in un tubo conico sterile.</li>
	<li>Portare il volume a 15 mL con PBS sterile 1x e centrifugare a 400 × g per 5 min. Durante l'attesa, preparare il reagente di trasfezione della cella primaria (tabella 2) e accantonare a RT.</li>
	<li>Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Rimossare il pellet cellulare con 10 mL di PBS sterile 1x e centrifuga a 400 × g per 5 min.</li>
	<li>Scartare completamente il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Trasferire 0,5 μg di mRNA GFP modificato chimicamente (come reporter di trasfezione) per 106 cellule B al pellet cellulare (opzionale).</li>
	<li>Resopend il pellet cellulare con reagente di trasfezione a cellule primarie da 20 μL per 106 cellule B; mescolare delicatamente pipettando 5-6 volte. Trasferire 20,5 μL per reazione di trasfezione nel tubo da 0,2 ml della striscia a 8 tubi contenente 2,5 μL del substrato di trasfezione CRISPR/Cas9.</li>
	<li>Pipetta su e giù una volta per mescolare e trasferire l'intero volume (23 μL) in una cuvetta di trasfezione. Cappuccio e toccare delicatamente la cuvetta sulla panca per assicurarsi che il liquido copra il fondo della cuvetta.</li>
	<li>Utilizzare il protocollo b-cell primario umano sul nucleofector per la trasfezione. NOTA: Il nucleofector (elettroporatore) può essere posizionato ed essere utilizzato al di fuori della cappa di coltura tissutale. Limitare la cuvetta per garantire la sterilità.</li>
	<li>Riposare le celle elettroporate nella cuvetta a RT per 15 minuti.</li>
	<li>Trasferire 80 μL del mezzo di espansione pre-equilibrato della cellula B dalla piastra di coltura tissutale nella reazione di trasfezione nella cuvetta. Posizionare la cuvetta nell'incubatore di coltura tissutale per 30 minuti.</li>
	<li>Pipettare delicatamente un paio di volte per mescolare e trasferire l'intero volume del campione dalla cuvetta ad un pozzo appropriato di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzi contenente 1 mL del mezzo di espansione della cellula B. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di 106 cellule/mL.</li>
	<li>Se si esegue un esperimento KI genico, trasferire il vettore rAAV6 a 500.000 molteplicità di infezione nelle cellule elettroporate appropriate contenenti bene (circa 45 minuti dopo l'elettroporazione). Vedere esempio di costrutto vettoriale rAAV6 nella figura 4A. NOTA: Ad esempio: un campione di controllo verrà elettroporato senza CRISPR/Cas9 o il vettore rAAV6. Un campione solo vettoriale sarà elettroporato senza CRISPR/Cas9 e quindi trasdotto con il vettore rAAV6. Un campione KI verrà elettroporato con CRISPR/Cas9 e quindi trasdotto con il vettore rAAV6. rAAV6 deve contenere bracci di omologia verso l'alto e a valle del sito DSB mirato per HDR.</li>
	<li>Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C e al 5% di CO2 con umidità.</li>
	<li>Conta le celle e registra la vitalità al primo giorno dopo l'ingegneria.</li>
	<li>Aggiornare il mezzo di espansione della cella B ogni 2 giorni contando le celle e quindi trasferendo l'intero volume delle celle in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 ml. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Rimostrare le cellule con 100 μL di mezzo di espansione fresco delle cellule B e trasferirli in un pozzo di una piastra di coltura tissutale di 24 po '. Portare il volume medio per ottenere una concentrazione cellulare finale a 5 × 105 cellule/mL. NOTA: Una piastra da 48 porsi può contenere fino a 1 mL medio/bene; una piastra da 24 po' può contenere fino a 2 mL medio/bene; una piastra da 12 po' può contenere fino a 4 mL medio/bene e una piastra da 6 po po' può contenere fino a 8 mL medio/bene.</li>
	<li>Consentire alle celle ingegnerizzate di espandersi per almeno 5 giorni prima di eseguire analisi a valle, ad esempio per l'analisi della citometria del flusso, l'analisi TIDE e la PCR di giunzione.</li>
</ol>

<ol>
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È stato depositato un brevetto sui metodi di produzione e utilizzo di cellule B modificate dal genoma con M.J.J, K.L., e B.S.M. come inventori. Immusoft Inc.M ha sponsorizzato la ricerca nel laboratorio di B.S.M.

L'ingegneria del genoma precisa nelle cellule B umane primarie è stata impegnativa fino apoco tempo fa 9,10. In precedenza avevamo pubblicato protocolli che utilizzavano CRISPR/Cas9 per progettare cellule B umane primarie9. Qui, delineamo protocolli migliorati per l'isolamento, l'espansione e l'ingegneria delle celle B per consentire un KO efficiente del CD19 o per l'eGFPknocking-in .
Qui dimostriamo che il nostro protocollo di espansione consente la rapida espansione delle cellule B in coltura per un'espansione fino a 44 volte in 7 giorni(Figura 1). Questo protocollo ha mostrato un tasso diespansione più rapido di quelli riportati da Johnson et al×. 
La Corte ha inoltre riscontrato che il nostro protocollo migliorato per il trasfetto del sistema CRISPR/Cas9 per CD19 KO ha comportato un'elevata efficienza del CD19 KO(figura 2 e figura 3). Analogamente a uno studio precedente9, abbiamo osservato una leggera riduzione del recupero cellulare e della vitalità dopo l'elettroporazione a 24 ore. Ciò indica che l'elettroporazione influisce sulla salute generale delle cellule B primarie; tuttavia, le celle alla fine rimbalzano entro 48 ore (dati non mostrati).
Il vantaggio dell'uso di questo protocollo elettroporatore è che possiamo elettroporate i campioni ad una velocità molto più veloce (16 reazioni in meno di 1 min), mentre i protocolliprecedenti 9,10 prendono circa 10-12 min per 16 reazioni. Inoltre, questo sistema di trasfezione elimina il potenziale arco elettrico dell'elettroporatore osservato negli studiprecedenti 9,10. Inoltre, questo metodo ingegneristico può essere scalato per un numero maggiore di celle B utilizzando cumvette più grandi e disponibili in commercio (dati non mostrati).
Alcuni passaggi critici per garantire una salute complessiva ottimale delle cellule e l'efficienza ko: in primo luogo, assicurarsi che il mezzo di espansione delle cellule B sia preparato e pre-equilibrato per almeno 15 minuti prima dell'uso. In secondo luogo, il volume totale del substrato di trasfezione non deve superare il 20% (v/v) del reagente di nucleofezione. In terzo luogo, le celle devono essere espanse/attivate per 48 ± 2 ore per risultati ottimali. In quarto luogo, toccare delicatamente la cuvetta di elettroporazione prima di posizionare nell'elettroporatore per assicurarsi che la soluzione di reazione di trasfezione copra il fondo della cuvetta. Quinto, assicurarsi di riposare le celle elettroporate nella cuvetta per soli 15 minuti a RT; lasciare le cellule nel reagente della nucleofezione dopo l'elettroporazione per troppo tempo può danneggiare la sopravvivenza complessiva delle cellule. Sesto, assicurati di incubare le cellule con mezzi nella cuvetta per non più di 30 minuti. Settimo, posizionare 106 cellule elettroporate in 1 mL per le prime 48 ore tende ad aiutare le cellule a riprendersi più rapidamente rispetto alla loro recupero a densità inferiore (dati non mostrati). Infine, l'utilizzo della proteina Cas9 mRNA o Cas9 comporterà efficienze di modifica simili (dati non mostrati); tuttavia, abbiamo usato Cas9 mRNA per comodità e costi.
Due problemi principali quando si utilizza CRISPR/Cas9 sono gli effetti fuori bersaglio e le traslocazioni cromosomiche. Gli effetti off-target causati da coppie di basi non corrispondenti di sgRNA alla sequenza bersaglio, portano a numerosi possibili siti di legame sul genoma e creano più KO genici indesiderati. Pertanto, il punteggio off-target previsto dovrebbe essere preso in considerazione insieme al punteggio di destinazione per ridurre al minimo questo problema. La traslocazione cromosomica può verificarsi a causa di effetti fuori bersaglio o quando si eliminano più geni. Ciò può causare eventi catastrofici in modo sperimentale e clinico. Gli editori di base12 alterano un singolo nucleotide (due classi: editor di base citosina ed editor di base di adenina) per interrompere l'elemento di giunzione, per creare un codone di arresto prematuro o per creare una mutazione puntile, portando al gene bersaglio KO senza DSB (ampiamente esaminato altrove12). Pertanto, l'approccio di editing di base può essere utilizzato per ko a geni singoli o multipli per aggirare le traslocazioni cromosomiche.
Dimostriamo inoltre che CRISPR/Cas9, insieme a rAAV6, può essere utilizzato per mediare in modo efficiente ki site-specific ed espressione di EGFP presso il locus AAVS1. Abbiamo osservato l'espressione EGFP per almeno 12 giorni dopo l'ingegneria. Abbiamo anche osservato due popolazioni positive all'EGFP: un'espressione ad alta e media EGFP nel campione KI il giorno 12 (Figura 5A), mentre il campione solo vettoriale ha mostrato una percentuale minima di cellule con espressione EGFP intermedia. Ipotizzamo che questo fenomeno delle "popolazioni alte e intermedie" sia dovuto all'integrazione biallelica del vettore. Ulteriori indagini che utilizzano la PCR13 delle celle intermedie e ad alto EGFP possono essere fatte per confermare questa ipotesi. Due avvertimenti sull'uso dell'AAV come vettore: in primo luogo, i vettori AAV hanno una piccola capacità di carico, fino a 4,7 kilobase, causando problemi quando bussano a un gene di grandi dimensioni. La riduzione delle dimensioni dei bracci di omologia consentirà l'accomodamento di un gene più grande, che a sua volta ridurrà l'efficienza del KI (dati non mostrati). In alternativa, è possibile utilizzare l'integrazione simultanea o sequenziale di più vettori di caricamento genico14,15. Gli studi hanno riportato una risposta immunitaria e una clearance delle cellule trasdotta dall'AAV nei modelli animali immunocompetenti16,17. In alternativa, è possibile esplorare un modello HDR donatore non virale per aggirare questo problema.
In sintesi, abbiamo dimostrato processi completi e passo-passo di isolamento, espansione e ingegneria delle cellule B che hanno portato ad elevate efficienze di modifica genica. Questo metodo ingegneristico può essere utilizzato per il gene KO e per studiare le funzioni dei geni nelle cellule B. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per progettare cellule B per esprimere un anticorpo ricombinante per combattere l'infezione. Infine, questo metodo può essere applicato all'ingegnere cellule B per esprimere e secernore enzimi terapeutici che possono essere utilizzati come terapia autologa a base cellulare per trattare le ezimopatie.

Le cellule B sono un sottogruppo del linfocita derivato dalle cellule staminali ematopoietiche. Svolgono un ruolo fondamentale nel sistema immunitario umoristico adattivo producendo grandi quantità di anticorpi in risposta alle sfide immunitarie1. Le cellule B sono anche precursori delle cellule B della memoria e delle cellule plasmatiche di lunga durata differenziate e terminali, fornendo così un'immunità umorale duratura2. Le cellule plasmatiche, in particolare, sono uniche tra le cellule immunitarie nella loro capacità di produrre grandi quantità di un anticorpo specifico mentre sopravvivono per anni odecenni 3. Inoltre, la facilità di isolamento dal sangue periferico rende il lignaggio delle cellule B un ottimo candidato per nuove terapie a base cellulare4.
In precedenza, metodi di integrazione casuali, come quelli che utilizzano vettori lentivirali o un transposone della Bella Addormentata, sono stati utilizzati per progettare cellule B per la consegna transgena el'espressione 5,6,7,8. Tuttavia, la natura non specifica di questi approcci rende difficile studiare le funzioni biologiche di un gene specifico nelle cellule B e comporta un rischio intrinseco di mutagenesi inserimento ed espressione transgena variabile e/o silenziamento nell'ambiente terapeutico.
Il sistema CRISPR/Cas9 è un potente strumento di ingegneria genomica che consente ai ricercatori di modificare con precisione il genoma di varie cellule in numerose specie. Recentemente, due gruppi, tra cui il nostro, hanno sviluppato con successo metodi per l'espansione ex vivo e l'ingegneria genomica mirata delle cellule Bumane primarie 9,10. Descriveremo il processo di purificazione delle cellule B umane primarie da un campione di leucforesi. Successivamente, descriveremo il nostro protocollo aggiornato per l'espansione delle celle B e l'attivazione di celle B isolate. Descriveremo quindi un processo per eliminare il cluster di differenziazione 19 (CD19), uno specifico recettore delle cellule B e un segno distintivo delle cellule B, per elettroporazione per introdurre l'mRNA CRISPR /Cas9 insieme allo sgRNA CD19 nelle cellule B attivate.
Cas9 mRNA viene tradotto e si lega allo sgRNA CD19 per formare un complesso crispr/cas9-sgRNA ribonucleoproteina (RNP). Successivamente, lo sgRNA nel complesso porta Cas9 a creare una rottura a doppio filamento (DSB) alla sequenza bersaglio sull'esone 2 del gene. Le cellule ripareranno il DSB "unendo fine non omologha" introducendo o eliminando i nucleotidi, portando a mutazioni frameshift e causando l'eliminazione del gene. Misureremo quindi la perdita di CD19 per citometria del flusso e analizzeremo la formazione di indelenze tracciando le indeli mediante analisi di decomposizione (TIDE).
Descriveremo quindi il processo di utilizzo di CRISPR/Cas9 insieme a un vettore AAV6 ricombinante (rAAV6, un modello donatore per la riparazione diretta dall'omologia (HDR)) per mediare l'inserimento specifico del sito di proteine fluorescenti verdi avanzate(EGFP) nel gene 1 (AAVS1) adeno-associato al virus. Il gene AAVS1 è un locus attivo senza funzioni biologiche note e un sito di integrazione virale AAV sul genoma umano; pertanto, è considerato un "porto sicuro" per l'ingegneria del genoma. Qui, segnalamo che l'espansione e l'attivazione delle cellule B hanno permesso un'espansione fino a 44 volte in 7 giorni di coltura (Figura 1). L'elettroporazione delle cellule B ha mostrato una leggera riduzione della salute generale delle cellule(figura 2A)a 24 ore dopo la trasfezione. L'analisi del grafico a dispersione del marcatore CD19 (Figura 2B) ha mostrato una riduzione fino all'83% delle celle modificate (Figura 2C).
L'analisi TIDE dei cromatografi(figura 3A)ha rivelato che la % delle indeli era simile alla perdita di proteine % per citometria del flusso(figura 3B). L'analisi della citometria del flusso dell'esperimento KI ha mostrato che le cellule che hanno ricevuto vettore AAV (Figura 4), insieme all'RNP, hanno espresso fino al 64% di cellule positive all'EGFP (Figura 5A) e in seguito hanno mostrato un'integrazione riuscita mediante reazione a catena della polimerasi di giunzione (PCR)(Figura 5B). Il conteggio delle celle ha mostrato che tutti i campioni sono stati rapidamente recuperati entro 3 giorni dopo l'ingegneria (Figura 5C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

Le cellule B sono linfociti derivati da cellule staminali ematopoietiche e sono una componente chiave del braccio umoristico del sistema immunitario adattivo. Fanno candidati attraenti per le terapie a base cellulare a causa della loro facilità di isolamento dal sangue periferico, della loro capacità di espandersi in vitro e della loro longevità in vivo. Inoltre, la loro normale funzione biologica - per produrre grandi quantità di anticorpi - può essere utilizzata per esprimere grandi quantità di una proteina terapeutica, come un anticorpo ricombinante per combattere l'infezione, o un enzima per il trattamento delle ezimopatie. Qui, forniamo metodi dettagliati per isolare le cellule B umane primarie dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBBC) e attivare / espandere cellule B isolate in vitro. Dimostriamo quindi i passaggi necessari per l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 per ko site-specific di geni endogeni nelle cellule B. Questo metodo consente un KO efficiente di vari geni, che può essere utilizzato per studiare le funzioni biologiche dei geni di interesse. Vengono quindi dimostrati i passaggi per l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 insieme a un vettore ricombinante, adeno-associato, virale (rAAV) per un'efficiente integrazione site-specific di una cassetta di espressione transgena nelle celle B. Insieme, questo protocollo fornisce una piattaforma ingegneristica passo-passo che può essere utilizzata nelle cellule B umane primarie per studiare le funzioni biologiche dei geni e per lo sviluppo di terapie a cellule B.

Il protocollo aggiornato di espansione e attivazione ha permesso la rapida espansione delle cellule B fino a 44 volte in 7 giorni(figura 1;n =3 donatori). Nell'esperimento KO, il conteggio delle cellule B utilizzando la colorazione blu di Trypan ha mostrato più dell'80% di cellule vitali con una leggera riduzione del recupero cellulare sia nel controllo che nei campioni CD19 KO a 24 ore dopo l'elettroporazione(figura 2A; p ≥ 0,05, n = 3 donatori). Questo risultato indica che l'elettroporazione ha leggermente influenzato la salute complessiva delle cellule B. Le cellule B sono state raccolte il giorno 5 dopo la trasfezione per la citometria del flusso e le analisi TIDE. I grafici a dispersione rappresentativi del campione di controllo e KO hanno mostrato rispettivamente il 14% e il 95% di cellule CD19 negative (figura 2B). La quantificazione dei grafici di flusso ha mostrato una significativa riduzione dell'espressione cd19 nei campioni ko rispetto al controllo(figura 2B;p ≤ 0,0001, n = 3 donatori). I cromatogrammi del sequenziamento genomico (cfr. sequenze primer nella tabella 3) hanno mostrato doppi picchi nelle cellule CD19 KO B, indicando inserimenti/eliminazioni di nucleotidi DSB post-CRISPR/Cas9-mediati, mentre singoli picchi sono stati osservati nel controllo, indicando che non si è verificato alcun DSB in questo campione (Figura 3A). L'analisi indelebile dei cromatografi (utilizzando uno strumento di analisi TIDE online gratuito) dei campioni ko ha mostrato un'alta percentuale di formazione di indelenze (>90%) al locus CD19, che è coerente con la perdita di proteine % CD19 rilevata dalla citometria del flusso (Figura 3B; p ≥ 0,05, n = 3 donatori). Questi risultati indicano che CRISPR/Cas9 ha generato in modo efficiente un CD19 KO nelle celle B. Le cellule B dell'esperimento KI sono state raccolte il giorno 12 dopo l'ingegneria per la citometria a flusso e le analisi PCR digiunzione (tabella 4). I grafici a dispersione hanno mostrato il 64% delle cellule positive all'EGFP nel campione che ha ricevuto il vettore rAAV6 (Figura 4) insieme all'RNP, mentre nel controllo non è stata osservata alcuna cellula positiva all'EGFP; nel campione che ha ricevuto solo vettore AAV (figura 5A) è stata osservata una positività minimadell'EGFP. Un'amplificazione PCR di giunzione (cfr. sequenze di primer nella tabella 3) ha mostrato ampliconi da 1,5 Kbps nel campione KI (Figura 5B), mentre nel campione di controllo o solo vettoriale non è stato osservato alcun prodotto PCR. Il conteggio delle celle ha mostrato che il processo di progettazione influisce sul recupero delle celle nel campione KI più del controllo o dei campioni solo vettoriali (Figura 5B). Tuttavia, tutti i campioni sono rimbalzati rapidamente entro 3 giorni dall'ingegneria (Figura 5B). Insieme, questi risultati indicano che una riuscita integrazione di EGFP nel luogo AAVS1 porta a un'espressione stabile dell'EGFP almeno 12 giorni dopo l'ingegneria.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig01.jpg"> Figura 1: Espansione delle cellule B in vitro. Le cellule B sono state sementi a 1 ×10 6 cellule il giorno 0 (zero) ad una densità di 5 × 105 per mL e espanse di 44 volte in 7 giorni (n=3 donatori indipendenti). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02a.jpg"> Figura 2A: Clicca <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02alarge.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02b.jpg"> Figura 2B: Clicca <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02blarge.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2C" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02c.jpg"> Figura 2C: Knockout CD19 mediato DA CRISPR/Cas9 (KO) nelle celle B. ( A ) Il graficoabarre mostra >70% il recupero cellulare (pannello sinistro) e >80% la vitalità (pannello destro) delle cellule dopo la trasfezione sono stati osservati sia nel controllo che nei campioni KO CD19 a 24 ore dopo l'elettroporazione. (B) I grafici rappresentativi del flusso di CD19 di cellule vive mostrano rispettivamente l'84,3% e il 3,43% di cellule positive cd19 nel campione di controllo e nel campione CD19 KO. (C) Il grafico a barre mostra una significativa riduzione del CD19 nel gruppo CD19 KO mediato da CRISPR/Cas9 (p ≤ 0,0001). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02clarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig03a.jpg"> Figura 3A: Clicca <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig03alarge.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig03b.jpg"> Figura 3B: Perdita di proteine CD19 vs formazione di indele. (A) I cromatogrammi raffigurano picchi di sequenziamento del campione di controllo e CD19 knockout (KO). La casella grigia sui picchi di controllo evidenzia la sequenza di destinazione del gRNA CD19 con il sito di taglio previsto indicato da una freccia. CD19 KO ha mostrato il sequenziamento dei "doppi picchi" intorno al sito di taglio previsto, indicando l'inserimento / eliminazione dei nucleotidi dopo la rottura a doppio filamento. (B) Grafico a barre che mostra risultati coerenti tra % perdita di proteine CD19 e % formazione di indelebili nel locus CD19 (p ≥ 0,05). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig03blarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig04.jpg"> Figura 4: costrutto vettoriale MND-GFP rAAV6 AAVS1. Expression cassette contiene una forte sequenza di promotore sintetico (MND), immediatamente seguita da una sequenza di codifica EGFP (Green Fluorescence Protein) potenziata e sequenza di poli adenilazione (Poly A). I bracci di omologia AAVS1 fiancheggiano a monte del promotore MND e a valle delle sequenze poli A. L'EGFP sarà espressa ai sensi del regolamento del promotore MND. Le lunghezze di sequenza sono indicate sopra ogni componente del costrutto. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05a.jpg"> Figura 5A: Clicca <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05alarge.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05b.jpg"> Figura 5B: Clicca <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05blarge.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5C" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05c.jpg"> Figura 5C: Integrazione site-specific mediata da CRISPR/Cas9 e rAAV6 della cassetta reporter EGFP nelle celle B al giorno 12 dopo l'ingegneria. (A) Il diagramma di flusso rappresentativo non mostra cellule B positive all'EGFP né nel controllo né nel campione solo vettoriale contro il 64,4% delle cellule B positive all'EGFP del campione di knockin (KI). (B) La reazione a catena della polimerasi di giunzione del campione KI mostra la banda prevista di 1,5 Kbps; non è stata trovata alcuna banda nel campione di controllo o solo vettoriale. L'acqua è stata utilizzata per garantire che non vi siano contaminazioni durante il processo PCR. (C) Il grafico a barre descrive la crescita cellulare del controllo, solo vettoriale, e i campioni EGFP-KI per un periodo di 3 giorni dopo l'ingegneria. La linea interrotta indica l'input di 1 × 106 celle. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05clarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>nome</td>
			<td>sequenza gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd19 Cd</td>
			<td>5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>AAVS1</td>
			<td>5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: sequenze di gRNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenti</td>
			<td>Volume per reazione 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di cellule primarie P3</td>
			<td>16,4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplemento 1</td>
			<td>3,6 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>totale</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Preparazione della miscela di reagenti nucleofection.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>descrizione</td>
			<td>sequenza</td>
			<td>scopo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer di inoltro CD19</td>
			<td>5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3'</td>
			<td>Amplifica il locus CD19 per l'analisi di Indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19 Primer inverso</td>
			<td>5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3'</td>
			<td>Amplifica il locus CD19 per l'analisi di Indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer forward PCR di giunzione</td>
			<td>5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3'</td>
			<td>Giunzione PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer inverso PCR di giunzione</td>
			<td>5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3</td>
			<td>Giunzione PCR</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Primer utilizzati.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>descrizione</td>
			<td>Fluorofo</td>
			<td>clone</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19 anti-umano</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colorante di vitalità</td>
			<td>eFlour 780</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Anticorpo della citometria a flusso e colorante di vitalità.

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 delle cellule B umane primarie per knockout genico (KO) e knock-in (KI) per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle cellule B e lo sviluppo di terapie a cellule B.

Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K Views.  University of Minnesota. Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 delle cellule B umane primarie per knockout genico (KO) e knock-in (KI) per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle cellule B e lo sviluppo di terapie a cellule B.

Video: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

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Biologia

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellazione del genoma umano Morbid utilizzando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...