מדידת תנועתיות היבול ומזון הפסבדרוזופילה

שיטה זו משמשת להערכת תנועתיות היבול באמצעות ספירת התכווצות היבול וגילוי חלוקת המזון רק במערכת העיכול. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מעריכה ללא הרף את תנועתיות היבול. זה עלות נמוכה וקל לביצוע.

שיטה זו מאפשרת להשתמש רק מילוי כמודל ללמוד תפקוד העיכול על מעברי המזון במערכת העיכול. עוזר להדגים את התהליך יהיה ג'ונמנה שי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לשמור על זבובים בבקבוקונים המכילים 10 מיליליטר של מזון טרי באינקובטור 25 מעלות צלזיוס עם 60% לחות ואור 12 שעות, מחזור כהה 12 שעות.

ודא כי מספר גדול של זבובים פנוטיפ הרצון eclose בו זמנית על ידי culturing זבובים צעירים עם מזון סטנדרטי עם שמרים יבשים ואז להעביר את זבובים למבוגרים לבקבוקון עם שמרים רטובים ולאפשר יומיים להטלת ביצים. השאירו את הביצים באינקובטור לפתח ולהעביר זבובים למבוגרים לבקבוקון חדש כדי לאסוף יותר ביצים. לאסוף את זבובים זכר או נקבה eclosed כל יום ולתרבת אותם בקבוקונים חדשים עם מזון סטנדרטי לגיל הרצוי.

הרדים את הזבובים עם פחמן דו חמצני ולהעביר זבוב אחד לתוך צלחת ניתוח היטב עם 200 microliters של PBS. לתפוס את הזבוב בבית החזה שלה עם זוג פינצטה ולפתוח את בית החזה עם זוג אחר של פינצטה ואז למשוך את הקצוות בכיוונים מנוגדים כדי לפתוח את הבטן. מוציאים בזהירות את היבול והבטן מהגוף ומחכים שהזבבוב יתעורר.

כאשר הזבוב ער, ספור את מספר הפעמים שהיבול מתכווץ בדקה אחת. חזור על ספירת ההתכווצות חמש פעמים, מחכה 30 שניות בין כל ספירה. שוקלים את הצבע הכחול וממיסים אותו ב-PBS בריכוז של 20%.

לאחר מכן מערבבים אותו לתוך מזון תחזוקה נוזלי מבושל לריכוז סופי של 5% במהלך תהליך קירור המזון. לאחר שמירה על זבובים בבקבוקונים עם מזון רעב במשך ארבע שעות, להעביר אותם בקבוקונים חדשים עם מזון צבוע ותרבות אותם לזמן הרצוי, תוך שמירה על כך בתנאי תחזוקה המזון עובר דרך לטוס בערך שעתיים. העבר זבוב הרדמה לתוך צלחת ניתוח היטב המכיל 200 microliters של PBS.

השתמש פינצטה כדי לתפוס את הזבוב בבית החזה ולהסיר את הראש עם זוג אחר של פינצטה, ולאחר מכן להעביר את הגוף ל באר חדשה עם PBS ולשטוף אותו עם רעידות עדינות כדי להסיר את הצבע המחובר לגוף. פתח את הבטן עם שני זוג פינצטה והפרד בזהירות את כל המעיים מהגוף. קח את היבול של כל המעיים ולשים אותו בצינור עם 100 microliters של PBS.

שים את שאר המעיים בצינור אחר עם 100 microliters של PBS ואז להשתמש טיפים פיפטה לטחון את היבול ואת המעיים ולהמיס את הצבע PBS. חוזרים על הניתוח עד שנאספים מספיק יבולים ומעיים. לאחר איסוף הדגימות, צנטריפוגה הצינורות במהירות הגבוהה ביותר במשך דקה אחת ולהעביר 90 microliters של supernatant לגם של צלחת 96 גם.

הפוך סדרה של דילול צבע כחול סטנדרטי בריכוזים מ 1 פעמים 10 כדי 7 כדי 10 כדי 4 גרם למיליליטר ולהוסיף אותם ל בארות. למדוד את הספיגה ב 630 ננומטר של הבארים ולהשתמש במדידות הסטנדרטיות כדי להתוות גרף קו של ספיגה לעומת ריכוז צבע. לאחר מכן השתמש בעקומה כדי לחשב את ריכוז הצבע של הדגימות.

בדיקת תנועתיות היבול שימשה לספירת התכווצויות יבולים על זבובים מוטנטים NPRL בן שלושה ימים ובקרות רקע גנטיות. המוטציה נמצאה כדי להקטין באופן משמעותי את קצב התכווצות היבול. כדי לאשר עוד יותר את הפונקציה של NPRL2 על היבול, תנועת המזון זוהתה על ידי האכלת מזון צבוע לזבובים.

כל הזבובים היו כמויות דומות של צבע ביבול אבל זבובים NPRL2 היה פחות צבע במעיים אשר עשוי להיות קשור עם שיעור התכווצות היבול ירד. בעת הקלדת פרוטוקול זה, ודא כי היבול נשאר מגע לגוף ואת הזבוב הוא חי וער. אחרת, היבול יאבד את היכולת להתכווץ.

במהלך תהליך הניתוח, היבול והמעיים צריכים להיות במגע. אם הצבע דולף לתוך מדיום הניתוח, לא ניתן להשתמש יותר במדגם. בואו פשוט למלא את התיאבון שלנו ואת פליטת המזון בתוך זמן קצר ניתן גם להעריך על ידי גילוי כמות הצבע במעיים כולו.