הפרוטוקול שלנו מבחין כי השימוש בתמציות כליות מפרות וחזירים הוא משאב מצוין וחסכוני לחקר פיזיולוגיה של הכליות, במיוחד בחינת המתאם בין גורם הגדילה ה אנדותל כלי הדם ואנליטים אחרים. זה תמיד היה אתגר לתאם VEGF, גורם גדילה חיוני אנגיוגנזה איברים, עם חלבונים אחרים. טכניקה זו מאפשרת לנו לבחון את הקשר בין VEGF ו analytes כגון הורמונים.
זה בהחלט יקדם את בסיס הידע שלנו לגבי גורם גדילה חשוב זה. שיטה זו עשויה להיות שימושית עבור מתאם analytes אחרים תמציות קליפת המוח הכליה מלבד אלה שהוזכרו בסרטון זה. הדגמה חזותית תסייע לאחרים להשיג תוצאות לשחזור ללא שגיאות דגימה.
השימוש ברקמה טרייה חיוני להצלחת טכניקה זו. חשוב להשיג כליות שלמות טריות מיד לאחר השחיטה מבעל חיים. תמיד להעביר את הרקמה למעבדה על קרח.
השתמש מספריים סטריליים, מלקחיים, סכין, וצלחות פטרי לנתח כליות ולגלות את החלק הנדרש רקמה. חותכים בעדינות את הכליה לחצי לאורך מישור הסגיטל וחותכים חתיכת רקמה מאזור קליפת המוח במרכז הכליה. טחון את הרקמה לחתיכות קטנות עם הסכין ולהעביר אותו לתוך צינור microfuge עם מיליליטר אחד של קרח קר 1X RIPA מאגר החילוץ תיזה.
סמן את הצינור עם פרטים לדוגמה ספציפיים והצב אותו על קרח. השתמש homogenizer כף יד עם בדיקה סטרילית כדי הומוגניזציה של הרקמה במשך 1 עד שתי דקות עד שלא נראים גושים, ואז מיד צנטריפוגה הצינור ב 9, 600 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להכין aliquots נפרדים של המדגם עבור ELISA וניתוח חלבון הכולל, כדי למנוע מחזורי הקפאה / הפשרה מרובים.
לפני תחילת הבדיקות, הביאו את כל חברי ההנהלה ואת צלחת ההתזה לטמפרטורת החדר תוך הסרת הבארות העודפות ואחסוןן בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. מדללים את חיץ הכביסה 20X ל-300 מיליליטר במים מזוקקים כפולים ומגדירים את בארות הריקות ללא כל פתרון. הוסף 50 microliters של תקן או מדגם ועוד 50 microliters של חזרת peroxidase חידה לכל באר, ואז מיד להוסיף 50 microliters של פתרון נוגדנים לכל באר ולאטום את הצלחת.
מערבבים את הצלחת ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, לשטוף כל באר עם 200 microliters של חיץ לשטוף. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של מצע A ומצע B לכל באר, מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי הקשה על הצד, ואז לאטום ולהדגר אותו בחושך במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר. הקישו בעדינות על הצלחת וקראו את הספיגה ב-450 ננומטר עם ספקטרופוטומטר. מכינים את הריג'נדים ושוטפים את המאגר כפי שתואר קודם לכן, ואז מוסיפים 100 מיקרוליטרים סטנדרטיים או מדגמים לכל באר, אוטמים את הצלחת, מערבבים היטב ודגירים אותה במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
הסר את הנוזל בכל באר ולהוסיף 100 microliters של reagent זיהוי A.Seal את הצלחת דגירה זה עוד שעה. לאחר מכן, לשטוף כל באר עם 400 microliters של חיץ לשטוף, ולאחר מכן להוסיף 90 microliters של פתרון מצעים לכל באר, בעדינות הקש על הצלחת, ו דגירה זה עוד שעה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה האחרונה, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר, הקישו בעדינות על הצלחת וקראו את הספיגה ב-450 ננומטר עם ספקטרופוטומטר.
להעריך את החלבון הכולל של תמציות כליות חזיר וחזיר עם בדיקה סטנדרטית BSA ולהשתמש בהערכה זו כדי לנרמל את התוצאות LH ו VEGF-A-ELISA. הרמות הממוצעות והחציון של LH ו- VEGF חושבו עבור בעלי חיים ומינים. לאחר אימות הנורמליות של נתונים, מודלים רגרסיה ליניארית נוצלו כדי לבחון את הקשר בין LH ו VEGF.
LH נמצאה כמנבאת חזקה ומשמעותית של VEGF בכליות חזיר וחזירים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לדגום אזורים זהים בכל רקמה. הליך דומה יכול לשמש כדי לחלץ כל סוג של רקמה.
זכור לנרמל אנליטים על ידי תמצית חלבון הכולל של כל רקמה שאתה משתמש.
