אנדוקנבינואידים הם מתווכים שומנים שמורים המווסתים תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון אורגניזמים. האנדוקנבינואידים הראשונים שהתגלו הם אננדמיד ו-2-ארכידונוילגליצרול, 2-AG. ה- nematode C.elegans הוא מודל רב עוצמה של בעלי חיים לחקר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים.
לאחרונה, גילינו כי 2-AG ממלא תפקיד בסיסי ברגולציה של סחר בכולסטרול C.elegans. זו הסיבה שזה הפך להיות הכרחי לתכנן ולייעל שיטה ללמוד אנדוגני 2-AG על ידי גילוי כימות C.elegans. שיטות אנליטיות שדווחו בעבר לכמת 2-AG בדגימות ביולוגיות בדרך כלל כרוכות בשימוש בתקנים deuterated כי הם מסחריים שנרכשו נדרשים כדי לקבל אותם זמינים לרכישה.
עם זאת, הם יקרים, ובשל נוכחותם של קשרים כפולים מרובים, רגישים להתחמצן לאורך זמן. הגרסה הנפוצה ביותר של התקנים מבוססת על חומצה ארכידונית מתומן להיות מתאים לכימות על ידי דילול איזוטופ, על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרוסקופיית מסה אחורית. כדי להתגבר על הקשיים הקשורים לעלות ויציבות של התקנים deuterated לכמת 2-AG, השתמשנו בשיטה נוחה ופשוטה להכין תקן אנליטי המבוסס על deuterium-5-גליצרול.
הרצף להכנת התקן הנדנוד דורש הליך בן שלושה שלבים. ניתן לשמור בצורה מוגנת עד שיהיה צורך גם. המטרה העיקרית של עבודה זו היא להראות שיטה מלאה ללמוד 2-AG ב C.elegans מן הסינתזה של תקן deuterated אנליטי הכנה והפקת דגימות נמטודה ולבסוף, הניתוח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרוסקופיה מסה.
לקבלת 1-AG deuterated כסטנדרט פנימי deuterated עבור מסיונות כימות בצע פרוטוקול שלושה שלבים. על מנת להגן רק על אלכוהול ראשוני, תחילה להוסיף 38 מיליגרם של גליצרול deuterated לצינור תגובה 10 מיליליטר באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף stirrer מגנטי. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של DCM נטול מים באמצעות מזרק המילטון חמישה מיליליטר ולמלא את הצינור עם חנקן יבש לתת אווירה אינרטית.
הכינו אמבטיה בעזרת בקבוק דיואר רדוד מלא באטיל אצטט מזוקק. ממלאים את צינור התגובה הסגור הרמטית בתוך האמבטיה ומצננים אותו לאט על ידי הוספת חנקן נוזלי לאתיל אצטט עד שהממס קפוא. זהירות, נוזל רותח באלימות בטמפרטורת החדר עלול לגרום לכוויות חמורות אם במגע עם העיניים והעור.
לאחר מכן, להוסיף 54 מיליגרם של התנגשות נטולת מים באמצעות מזרק המילטון. זהירות, התנגשות היא נדיף ויש לו ריח חזק מאוד ולא נעים. ב 70 מיליגרם של טרבוטיל-דימתיל-cetylchloride ומערבבים הכל במשך שלוש שעות במינוס 78 מעלות על ערבוב מגנטי.
מוסיפים שני מיליליטר של מי מלח כדי להירווה את התגובה. לחלץ את הפתרון עם שני מיליליטר של dichloromethane מזוקק שלוש פעמים באמצעות משפך מופרד שמירה על תמציות אורגניות בכל פעם. לאחר מכן, לשלב את שלוש תמציות אורגניות יבש מעל נתרן סולפיט.
לטהר את התערובת הגולמית על ידי כרומטוגרפיה עמוד באמצעות ג'ל סיליקה כמו השלב נייח ו 10% הגדלת הקסאן אתיל אצטט שיפוע החל מ 100% הקסאן וגימור עם 100% אתיל אצטט. עבור שלב זה esterification, להוסיף 10 מיליגרם של המוצר כאמור בעבר צינור תגובה 10 מיליליטר באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף stirrer מגנטי. הוסף שני מיליליטר של DCM נטול מים באמצעות מזרק המילטון חמישה מיליליטר ולמלא את הצינור עם חנקן יבש לתת אווירה אינרטית.
מצננים את הפתרון לאפס מעלות באמצעות אמבטיית קרח. Ad 36 מיליגרם של חומצה אצ'ידונית באמצעות מיקרופיגט מתכוונן רב נפח ומערבבים. לאחר מכן, מוסיפים 15 מיליגרם של 40-מתיל אמינו-פירידין ומערבבים.
מוסיפים 15 מיליגרם של diacylpropylcarbodiimid באמצעות מיקרופיפט מתכוונן רב נפח ומערבבים. הוסף שני מיליליטר של מים כדי להירווה את התגובה ולאחר מכן לחלץ את הפתרון עם שני מיליליטר של DCM מזוקק שלוש פעמים באמצעות משפך מפריד. מערבבים את שלוש התמציות האורגניות ויבשים מעל נתרן סולפיט, מטהרים את התערובת הגולמית באמצעות כרומטוגרפיה של עמודה באמצעות ג'ל סיליקה כשלב נייח ואז 10% מגדילים את שיפוע האתיל אצטט הקסאן החל מ-100% הקסאן ומסיימים עם 50 50% הקסאן אתיל אצטט.
לבסוף, עבור שלב deprotection, להוסיף 15 מיליגרם של המוצר מסונתז בעבר צינור תגובה 10 מיליליטר באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף stirrer מגנטי. הוסף שני מיליליטר של tetrahydrofuran נטול מים באמצעות מזרק המילטון חמישה מיליליטר ולמלא את הצינור עם חנקן יבש לתת אווירה אינרטית. ואז לקרר את הפתרון לאפס מעלות באמצעות אמבטיית קרח.
הוסף 150 microliters טיפה חכם של פתרון טוחנת אחת של פלואוריד טטרה בוטילמוניום ב- THF באמצעות מזרק המילטון. לאחר שעה, מוסיפים שני מיליליטר מים כדי להרווה את התגובה. לחלץ את הפתרון עם שני מיליליטר מזוקק DCM שלוש פעמים באמצעות משפך מפריד.
מערבבים את שלוש התמציות האורגניות ויבשים מעל נתרן סולפיט. עבור הליך הלבנה, להפוך תולעים על זרע שישה ס"מ NGM צלחות. אפשר לתולעת לגדול מיומיים עד שלושה ימים, כך שיש הרבה ביצים ומבוגרים gravid על הצלחת.
ברגע שיש לך שפע של ביצים ומבוגרים, לשפוך חמישה מיליליטר של M9 על הצלחת. באמצעות פיפטה זכוכית, להעביר את התולעים לצינור בז 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור במשך שתי דקות ב 2, 000 G ו גלולה התולעים.
יניקה רוב M9 מבלי להפריע גלולת התולעת. מוסיפים שלושה מיליליטר של תותב הלבנה ומערבבים את הפתרון בעדינות על ידי היפוך במשך כחמש דקות או עד שתראו ירידה במספר התולעים הבוגרות שלמות. ברגע שרוב הגופות התמוססו, צנטריפוגה ב 2, 000 G לדקה אחת.
יניקה רוב פתרון הלבנה מבלי להפריע גלולת התולעת. מוסיפים 15 מיליליטר של M9 לצינור ומערבבים היטב. צנטריפוגה שוב ב 2, 000 G לדקה אחת.
יניקה רוב M9 מבלי להפריע גלולת התולעת. להכנת דגימת תולעת, תן לעוברים N2 שהושגו על ידי הליך הלבנה היה לילה במאגר M9 ב 20 מעלות. לאחר מכן, לקצור L1s מסונכרן על ידי צנטריפוגה הצינור שתי דקות ב 2, 000 G.Wash התולעים עם חיץ M9 עוד פעם אחת לכמת את מספר L1 חי. זרעים כ 10, 000 תולעים לתוך לוחות NGM עם מיליליטר אחד של OP 50 Escherichia קולי מיובש בעבר.
הדגירה את הצלחות לפחות במשך 48 שעות ב 20 מעלות עד התולעים להגיע לשלב L4. לקצור את התולעים באמצעות חיץ M9 קר בצינור בז 50 מיליליטר. לשטוף אותם עוד פעם אחת ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
גלולה התולעים על ידי צנטריפוגה ב 2, 000 G לדקה אחת. לחסל את רוב העל-טבעי. לאחר מכן, לטבול את הצינור בחנקן נוזלי ומערבבים במינוס 80 מעלות.
להפשיר כ 100 microliters של כדורי תולעת קפואים השייכים N2 ולאחר מכן להוסיף 1.3 מיליליטר של מתנול. לאחר מכן, sonicate המדגם במשך ארבע דקות. לאחר sonication, להוסיף 1, 000 ppb של התקן deuterated הפנימי, 2.6 מיליליטר של כלורופורם, ו 1.3 מיליליטר של 0.5 טוחנת של אשלגן כלורי, 0.08 טוחנת של חומצה זרחונית ליחס סופי של אחד לאחד.
Vortex הדגימות במשך דקה אחת ולאחר מכן sonicate אותם באמבט מים קולי במשך 15 דקות על קרח. Vortex הדגימות שוב פעמיים במשך דקה אחת צנטריפוגה אותם במשך 10 דקות ב 2, 000 G כדי לגרום להפרדת פאזה. לאסוף את השלב התחתון לתוך צינור זכוכית נקי, לייבש אותו תחת חנקן, ו resuspend אותו 100 microliters של אצטוניטריל.
כדי להשיג כימות מוצלח של 2-AG אנדוגני, היה צורך לסנתז אותו אנלוגי רווי באמצעות שיטה שלושה שלבים. לאחר מכן, הוא נוסף לדגימות תולעת, מופק ונותח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, יחד עם ספקטרומטריית מסה. משמש כסטנדרט פנימי, deuterated סינתטי 1-AG היה הכלי לכמת את המטבוליט אנדוגני.
השיטה עברה אופטימיזציה באמצעות המעברים עבור 2-AG ועל deuterated 1-AG שבו מולקולות גליצרול הולכים לאיבוד. 2-AG אנדוגני מדגימות C.elegans זוהה בהצלחה וכמת על ידי דילול איזוטופי עם 1-AG deuterized מסונתז כימית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים יחד עם ספקטרומטריית מסה. מדגם אחד הוכן עם תקן deuterated 1-AG, בעוד מדגם שניים ללא התקן.
מאז הריכוז המקורי של תקן deutrated מדגם אחד ושלוש היה של 1, 000 ppb כל אחד, מיחס אזור השיא ניתן לחשב את הריכוז אנדוגני של 2-AG המדגם של 340 ppb עבור מדגם אחד ו 360 ppb עבור מדגם שלוש, נותן ממוצע של 350 ppb. היחסים חושבו כאיכות בין אזורי השיא של 2-AG ו- 1-AG deuterated, בהתאמה, עבור שתי דגימות מבודדות. שניהם עם תקן deuterated הוסיף הקודם לחילוץ.
בהתחשב בחשיבות שהתגלתה לאחרונה של 2-AG בשיפור של סחר בכולסטרול וחוסר מידע של איך שומנים משפיעים על תהליך זה, זה היה הכרחי שיטת זיהוי אמין עבור אנדוקנבינואיד זה. הפיתוח המוצלח של שיטה סינתטית פשוטה וחזקה שדווחה כאן כדי להשיג אנלוגי deuterated 2-AG היה צעד מפתח של פרוטוקול זה. רוב השיטות המדווחות לכימות monoacylglycerols כרוכות בשימוש בתקנים אנליטיים זמינים מסחרית, שהם בדרך כלל יקרים ולא יציבים בתנאי אחסון רגילים, מה שהופך אותם לבלתי נגישים למעבדות בעלות תקציב נמוך יותר.
עם זאת, שיטה זו פותרת זאת על ידי הצעת סינתזה של התקן באמצעות חומרי התחלה נגישים יותר. השיטה הסינתטית היא ישר קדימה ללא תנאים מתוחכמים הדרושים, מה שהופך אותו אידיאלי להתבצע בכל מעבדה עם ציוד מינימלי וגישה למגיעים, גם בתקציב מופחת. לסיכום, הליך חדש זה מתאר דרך ישר קדימה לשחזור של גילוי וכמות 2-AG שיסייע לענות על כמה שאלות שהועלו לאחר תיאור התפקיד של אנדוקנבינואידים אלה בסחר בכולסטרול C.elegans.
