엔도칸 나비 노이드는 다양한 유기체에서 여러 생물학적 과정을 조절하는 지질 중재자입니다. 처음 발견된 엔도칸나비노이드는 아난다미드와 2-아라치도노일글리세롤, 2-AG입니다. 선충 C.elegans는 생물학적 과정의 큰 다양성을 연구하는 강력한 동물 모델입니다.
최근, 우리는 2-AG가 C.elegans에서 콜레스테롤 인신 매매의 규제에 근본적인 역할을 한다는 것을 발견했습니다. 이것이 C.elegans의 검출 및 정량화에 의해 내인성 2-AG를 연구하는 방법을 설계하고 최적화하는 것이 필수적이 된 이유입니다. 이전에 보고된 분석 방법은 생물학적 샘플에서 2-AG를 정량화하는 데 일반적으로 상업적으로 획득된 유족 표준의 사용을 포함하며 이를 구매할 수 있어야 합니다.
그럼에도 불구 하 고, 그들은 비싼, 그리고 여러 이중 채권의 존재로 인해, 시간이 지남에 산화 얻을 에 민감한. 표준의 가장 일반적인 버전은 동위원소 희석에 의해 정량화에 적합한 옥타데테레이션 아라키도니아산을 기반으로, 액체 크로마토그래피에 의해, 후방 질량 분광법. 2-AG를 정량화하기 위해 중음 표준의 비용 및 안정성과 관련된 어려움을 극복하기 위해, 우리는 중수소 -5-글리세롤에 기초한 분석 표준을 준비하는 편리하고 간단한 방법을 사용했다.
펜디테레이션 된 표준을 준비하는 순서에는 세 단계 의 절차가 필요합니다. 필요할 때까지 보호된 형태로 보관할 수 있습니다. 이 작업의 주요 목적은 분석 성 증식 표준의 합성에서 선충 샘플의 준비 및 추출에 C.elegans에서 2-AG를 연구하는 완전한 방법을 보여주고 마지막으로, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법에 의한 분석이다.
정량화 분석에 대한 유정된 내부 표준으로 유족 1-AG를 획득하기 위한 3단계 프로토콜을 따릅니다. 1차 알코올만 보호하기 위해 먼저 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10 밀리리터 반응 튜브에 38밀리그램의 글리세롤을 추가하고 자기 교반기를 추가합니다. 다음으로, 5밀리리터 해밀턴 주사기를 사용하여 5밀리리터의 무수DCM을 추가하고 튜브를 건조한 질소로 채우면 불활성 분위기를 조성합니다.
증류주 에틸 아세테이트로 채워진 얕은 드와르 플라스크를 사용하여 목욕을 준비하십시오. 용매가 동결될 때까지 에틸 아세테이트에 액체 질소를 천천히 첨가하여 목욕 내부에 밀폐된 반응 튜브를 채우고 냉각시하십시오. 주의, 액체는 격렬하게 실온에서 끓고 눈과 피부와 접촉하는 경우 심한 화상을 일으킬 수 있습니다.
다음으로, 해밀턴 주사기를 사용하여 54 밀리그램의 무수 성 충돌을 추가합니다. 주의, 충돌은 휘발성이며 매우 강하고 불쾌한 냄새가납니다. 70 밀리그램의 테르부틸 디메틸-세틸클로리데에서 자기 교반기에서 영하 78도에서 3시간 동안 모든 것을 저어줍니다.
반응을 담금질하기 위해 소금물 두 밀리리터를 추가합니다. 매번 유기 추출물을 유지하는 분리된 깔때기를 사용하여 증류된 디클로로메탄 2밀리리터로 용액을 3회 추출합니다. 그런 다음 3개의 유기농 추출물을 결합하여 황산나트륨위에 건조시합니다.
실리카 젤을 고정상으로 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의한 조질 혼합물을 정화하고 100% 헥산에서 시작하여 100%에틸 아세테이트로 마무리하는 헥산 에틸 아세테이트 그라데이션을 10% 증가시합니다. 이 에스테르화 단계를 위해, 파스퇴르 핍펫을 사용하여 10 밀리리터 반응 튜브에 이전에 언급 된 제품의 10 밀리그램을 추가하고 자기 교반기를 추가하십시오. 5밀리리터 해밀턴 주사기를 사용하여 무수DCM 2밀리리터를 넣고 튜브를 건조한 질소로 채우면 불활성 분위기를 조성합니다.
얼음 목욕을 사용하여 0도까지 용액을 식힙니다. 다량 조절 가능한 마이크로파이프를 사용하여 아라치도니아산 36밀리그램을 저어줍니다. 그런 다음 40-메틸-아미노피리딘 15밀리그램을 넣고 저어줍니다.
다량 조절 가능한 마이크로파이프를 사용하여 15밀리그램의 디아실프로필카르보디미드를 추가하고 저어줍니다. 2밀리리터의 물을 추가하여 반응을 담금질한 다음 분리깔문을 사용하여 증류된 DCM 2밀리리터로 용액을 세 번 추출합니다. 세 가지 유기 추출물을 섞어 황산 나트륨 위에 건조시키고, 실리카 젤을 고정상으로 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 조혼합물을 정화한 다음 100%헥산에서 시작하여 505헥사네에틸 아세테이트로 마무리하는 헥산 에틸 아세테이트 그라데이션을 10% 증가시면 정제합니다.
마지막으로, 보호 해제 단계에 대해 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10 밀리리터 반응 튜브에 이전에 합성된 제품의 15밀리그램을 추가하고 자기 교반기를 추가합니다. 5밀리리터 해밀턴 주사기를 사용하여 무수테트라하이드로푸란 2밀리리터를 넣고 튜브를 건조한 질소로 채우면 불활성 분위기를 조성합니다. 그런 다음 얼음 목욕을 사용하여 용액을 0도까지 식힙니다.
해밀턴 주사기를 사용하여 THF에 테트라부틸람모늄 불소의 1개의 어금니드 용액150개를 추가합니다. 1시간 후, 2밀리리터의 물을 추가하여 반응을 해소합니다. 분리 깔때기를 사용하여 DCM을 세 번 증류한 2밀리리터로 솔루션을 추출합니다.
3개의 유기농 추출물을 결합하고 황산나트륨 위에 건조시다. 표백 절차의 경우 웜을 시드 6센티미터 NGM 플레이트에 켭니다. 접시에 계란과 중력 성인이 많이 있도록 벌레가 2 ~ 3 일에서 성장할 수 있도록하십시오.
계란과 어른이 많으면 접시에 M9 5 밀리리터를 붓습니다. 유리 파이펫을 사용하여 웜을 15 밀리리터 팔콘 튜브로 이송합니다. 2, 000 G에서 2 분 동안 튜브를 원심 분리하고 벌레를 펠릿.
벌레 펠릿을 방해하지 않고 M9의 대부분을 흡입합니다. 표백 용액 3 밀리리터를 넣고 약 5분 동안 반전하거나 그대로 성인 웜수가 감소할 때까지 용액을 부드럽게 혼합합니다. 일단 몸의 대부분이 용해되면, 원심분리기는 2, 000 G에서 1 분 동안.
벌레 펠릿을 방해하지 않고 표백 용액의 대부분을 흡입합니다. 튜브에 15 밀리리터의 M9을 넣고 잘 섞습니다. 원심 분리기는 1 분 동안 2, 000 G에서 다시.
벌레 펠릿을 방해하지 않고 M9의 대부분을 흡입합니다. 벌레 샘플 준비를 위해, 표백 절차에 의해 얻은 N2 배아는 20도에서 M9 완충에서 하룻밤에 있었다. 이어서, 2, 000 G.에서 2분간 튜브를 원심분리하여 동기화된 L1s를 수확하여 M9 버퍼로 웜을 한 번 더 세척하고 살아있는 L1의 수를 정량화한다. 약 10, 000개의 벌레를 NGM 플레이트에 넣고 OP 50 에체리치아 대장균의 1밀리리터를 이전에 건조시켰다.
웜이 L4 단계에 도달할 때까지 플레이트를 20도에서 적어도 48시간 동안 배양합니다. 50 밀리리터 팔콘 튜브에서 차가운 M9 버퍼를 사용하여 벌레를 수확하십시오. 한 번 더 씻고 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨 넣습니다.
1 분 동안 2, 000G에서 원심 분리로 벌레를 펠렛. 대부분의 상체를 제거하십시오. 그런 다음 튜브를 액체 질소에 담그고 영하 80도에서 저어줍니다.
N2에 속하는 냉동 웜 펠릿의 약 100 마이크로 리터를 해동한 다음 메탄올 1.3 밀리리터를 추가합니다. 그 후, 4 분 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 내부 중음 표준의 1, 000 ppb, 클로로폼 2.6 밀리리터, 염화 칼륨의 0.5 어금다 1.3 밀리리터, 0.08 인산의 어금니를 1 대 1의 최종 비율로 추가한다.
샘플을 1분 동안 소용돌이치게 한 다음 초음파 수조에서 얼음으로 15분 동안 초음파 처리합니다. 1분 동안 다시 두 번 샘플을 소용돌이시키고 상 분리를 유도하기 위해 2, 000G에서 10분 동안 원심분리를 합니다. 깨끗한 유리 튜브로 하한 위상을 수집하고 질소 로 건조하고 아세토나이트 100 마이크로리터로 다시 중단하십시오.
내인성 2-AG의 성공적인 정량화를 달성하기 위해, 3단계 방법을 사용하여 포화 아날로그를 합성할 필요가 있었다. 그 후, 대량 분석법에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추출 및 분석된 웜 샘플에 첨가되었다. 내부 표준으로 사용, 합성 증식 1-AG는 내인성 대사 산물을 정량화하는 도구였다.
이 방법은 글리세롤 분자가 손실되는 2-AG 및 중음 1-AG에 대한 전이를 사용하여 최적화되었습니다. C.elegans 샘플로부터의 2-AG 내생술은 질량 분광법에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 화학적으로 합성된 1-AG와 이소토성 희석에 의해 성공적으로 검출및 정량화되었다. 샘플 1은 유정된 표준 1-AG로 제조되었으며, 표준없이 2개를 샘플링하였다.
샘플 1 및 3에서 의 원래 농도는 각각 1, 000 ppb의 1, 000 ppb이었기 때문에, 피크 영역 비로부터 샘플 340 ppb의 샘플에서 2-AG의 내인성 농도를 계산할 수 있고 360 ppb의 샘플을 위한 350 ppb의 평균을 주는. 비율은 각각 2-AG의 피크 영역과 2개의 격리된 견본을 위한 1-AG의 최고 영역 사이 질로 계산되었습니다. 둘 다 추출에 이전에 추가 된 유족 표준.
콜레스테롤 인신 매매의 향상과 지질이 그 과정에 미치는 영향의 정보의 부족에 2-AG의 최근 발견 된 중요성을 감안할 때,이 엔도 칸 나비 노이드에 대한 신뢰할 수있는 검출 방법이 필요했다. 유족이 된 아날로그 2-AG를 얻기 위해 여기에 보고된 간단하고 견고한 합성 방법의 성공적인 개발은 이 프로토콜의 핵심 단계였다. 모노아실글리세롤을 정량화하는 대부분의 보고된 방법은 일반적으로 정기적인 저장 조건하에서 비싸고 불안정한 시판가능한 분석 표준을 사용하여 저예산 실험실에 연결할 수 없게 만듭니다.
그러나 이 방법은 접근성이 높은 시작 재료를 사용하여 표준의 합성을 제안하여 이를 해결합니다. 합성 방법은 정교한 조건 없이 똑바로 앞으로, 최소한의 장비와 반응에 대 한 액세스를 가진 모든 실험실에서 수행 하는 것이 좋습니다., 심지어 감소 된 예산에. 요약하자면, 이 새로운 절차는 C.elegans에서 콜레스테롤 인신 매매에서 이러한 엔도칸 나비 노이드의 역할에 대한 설명 후 제기 된 질문 중 일부에 대한 답변을 하는 데 도움이되는 2-AG를 감지하고 정량화하는 직선 적이고 재현 가능한 방법을 설명합니다.
