פרוטוקול זה מתאר שתי אסטרטגיות של תוספי שומנים עם שילוב של ניתוח אורך ושעתוק באורגניזם המודל, C.elegans. הטכניקה מתארת כיצד לבחון שינויים בשעתוק באמצעות מעט תולעים או רקמות תולעים מנותחות, וכיצד ניתן לשלב את ההזנה הנוזלית של אוכלוסיית חרקים עם טכניקות הידרו. אנשים המבצעים טכניקה זו חייבים לתרגל דיסקציה של רקמות בגלל חלון הזמן הקצר לביצוע הניסוי כדי להשיג ניתוח שעתוק הולם.
כדי להתחיל, לאסוף חיידקי OP50 על ידי צנטריפוגה של התרבות שגדלה בן לילה ב 4, 000 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט. להשעות את כדור החיידקים ב 20 מיליליטר של דילול חיידקים, הגבלה תזונתית או בסיס BDR על ידי מערבולת ושוב, לחזור על צנטריפוגה במשך 10 דקות.
לאחר השלכת הסופר-נטנט, השהה מחדש את גלולת החיידקים במדיום BDR כדי להכין מלאי חיידקי BDR של 20 X. יש לדלל את מלאי החיידקים ל-5X באמצעות מדיום BDR לפני השימוש. באמצעות אתנול או דימתיל סולפוקסיד כממס, הכינו תמיסת מלאי שומנים בבקבוקון זכוכית חדש ומלאו את בקבוקון הזכוכית בארגון או בחנקן כדי למנוע חמצון.
העבירו את תמיסת מלאי השומנים לתמיסת חיידקי ה-BDR כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי בתנאי האכלה. ערבבו אותו היטב על ידי מערבולת במשך 20 שניות. הכן את הרכב הנשלט על ידי ערבוב אותם נפחים של אתנול מסונן או דימתיל סולפוקסיד עם חיידקי BDR.
בצע תוספי שומנים ותרבית נוזלית על ידי העברת הכמות הרצויה של בקרת שומנים או רכב לכל באר של 12 צלחת באר עם שלושה עד ארבעה שכפולים עבור כל מצב האכלה. ערבבו את תרחיף התולעים Caenorrhabditis elegans המסונכרן עם חיידקי 5X BDR ביחס של אחד לאחד כדי להשיג ריכוז סופי של 1, 500 תולעים למיליליטר ופי 2.5 לחיידקים. לאחר מכן מעבירים שני מיליליטר של תערובת חיידקי התולעת לכל באר של צלחת 12 הבאר.
בסיום לעטוף את צלחת 12 הבאר בנייר כסף ולנער את הצלחת באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס ב 100 סל"ד לאורך הדגירה הרצוי. עבור תוספי שומנים על צלחות, זרעו מיליליטר אחד של חיידקים מותנים בשומנים למרכז של מדיום צמיחת נמטודה בגודל 10 ס"מ או צלחת אגר NGM. ודא כי פתרון העבודה הסופי הוא מערבולת מספר פעמים בין זריעת שתי הצלחות כאשר עובדים עם מספר גבוה של צלחות.
יבשו את הצלחת בחושך בתוך מכסה מנוע בטיחותי. העבר 3000 תולעים מתרבית התולעים המסונכרנת לצלחת 10 סנטימטרים. יבשו את הצלחת במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית עד שתולעים ששחו על הצלחות עם תוספי השומנים, יתחילו לזחול.
לאחר הייבוש, יש לדגום את הלוח המותנה בשומנים באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי ואם משתמשים בשומנים רב בלתי רוויים להגן על הצלחת מפני אור. הכינו 20 מיקרוליטרים של תמיסת ליזיס סופית לכל דגימה על ידי ערבוב 0.2 מיקרוליטרים של DNase I עם 19.8 מיקרוליטרים של תמיסת ליזיס בצינור PCR וערבבו אותו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים. כדי לחלץ את הרנ"א מהמספר הקטן של תולעים שלמות, הסירו את החיידקים על ידי העברת 15 עד 20 תולעים ממדשאת החיידקים לצלחת NGM טרייה שלא נזרעה.
מעבירים 15 עד 20 תולעים מצלחת ה-NGM הלא ממומשת לצינור ה-PCR המכיל 20 מיקרוליטרים של תמיסת הליזיס הסופית שזה עתה הוכנה עם המספר המינימלי של חיידקים ודוגרים את תגובת התזה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סיום הדגירה, שמרו את הדגימה באמבט מים קרים נחמד ובדקו את התולעים ארבע פעמים, חמש שניות בכל פעם עם משרעת של 30% ודופק למשך 15 שניות בין כל זמן של סוניקציה. יש לדגור על השפופרת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפני הוספת שני מיקרוליטרים של תמיסת עצירה לתגובת התזה ולערבב אותה על ידי הקשה עדינה.
לדגור את התגובה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להגדיר את הצינור על קרח. כדי לחלץ רנ"א מרקמת התולעת, בחרו כ-20 תולעים ממדשאת החיידקים והכניסו אותן לצלחת NGM חדשה ולא מעובדת כדי לסלק את החיידקים מהתולעים. העבירו 20 תולעים עם כמה שפחות חיידקים לזכוכית שעון המכילה 500 מיקרוליטר של תמיסת M9 המכילה ארבעה מיקרומולרים לבמיזול.
כאשר התולעים משותקות, נתחו את הנבט או המעי באמצעות מחט 25 מדים שניתן לחבר למזרק מיליליטר אחד. באמצעות פיפטה זכוכית autoclaved, להעביר את הרקמות המנותקות לתוך צינור PCR ולהתיישב את הצינור על קרח במשך שתי דקות המאפשר את התצהיר של החומר בתחתית. הסר את הסופרנטנט מצינור ה- PCR לפני הוספת 20 מיקרוליטר של תמיסת ליזיס סופית וערבב אותו היטב על ידי הקשה.
לאחר דגירה של תגובת התזה במשך חמש דקות, הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת עצירה והקש על הצינור מספר פעמים. דגירה של הצינור במשך שתי דקות לפני שתמשיך לתעתיק ההפוך. במחקר האימות, RNA שחולץ מאוכלוסייה גדולה ומכמה תולעים הראה אינדוקציה דומה של הגנים לעיבוד נוירופפטידים, egl-3 ו-egl-21.
הוא מציע כי מיצוי RNA מכמה תולעים יכול להיות חלופה תקפה לטכניקות סינתזת CDNA סטנדרטיות מאוכלוסיות גדולות. במעי המנותח של תולעי הטרנסגן lipl-4, בתוספת חומצה דיהומו-גמא-לינולנית, או DGLA, הגנים לעיבוד נוירופפטידים עצביים לא הושרו. נטילת תוסף DGLA בריכוזים שונים הצילה את הארכת תוחלת החיים בתולעים לאחר נפילת שומן-3.
תולעים עם תוספי שומנים עשויות גם להיות מעובדות לריצוף RNA, פרוטאומיקה, מטבוליזם ומחקרים התנהגותיים כדי לזהות פנוטיפים נוספים בתנאים ספציפיים אלה. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על מחקר הזדקנות, ביולוגיה של שומנים וכל תחום מחקר אחר שמטרתו ליצור קשר בין פנוטיפ מסוים לבין גורם תזונתי או מטבוליט.
