ניתוח רשתית העכבר הוא תהליך עדין באמת בשל הגודל והצורה של העיניים ואת השבריריות של סעיף הרשתית. הכרחי לתרגול, בעל פרוטוקול מפורט המספקים שיטה יעילה וטיפים הוא המפתח לנתח רשתית באיכות גבוהה ומקטע. אנו מספקים טיפים וייעוץ כדי לסייע לחוקרים להימנע ממלכודות נפוצות ולקבל כמה סעיפים רשתית באיכות גבוהה המתאימים לאימונוהיסטוכימיה.
סמן את החלק הזמני של העין של עכבר המתת סנפיר באמצעות צרוב זנב על ידי נגיעה בקרנית בקלילות רבה ולא יותר משבריר שנייה כדי לשרוף מעט את הקרנית ולהימנע מלעשות חור. מיד לאחר מכן השתמשו בדומונט 545 מדפים מעוקלים כדי להחנות עיני עכבר. מניחים את העיניים ב cryotube 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 4%PFA ו PBS ודגירה במשך 15 דקות על קרח.
לאחר מכן, להעביר את העיניים קבוע באמצעות מדפים מעוקל Dumont 545 לצלחת ניתוח 35 מילימטר שונה מלא PBS וממוקמים תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמש microknife לעשות חתך קטן על סימן הכוויה בניצב אל וקצת מעל הגבול limbus של הקרנית. הכנס מספריים מעוגלים לתוך החתך ולבצע חתך היקפי של הקרנית בעקבות הלימבוס.
לאחר מכן, באמצעות מדפים דקים של Dumont 5, להסיר את הקרנית, לחלץ את העדשה, ולהרים אותו בעדינות מן החלק האחורי של העין. הגוף הזינה ית לצאת עם העדשה ואת הרשתית יהיה גלוי כמו משטח לבן המכסה את החלק הפנימי של העין האחורית. לשטוף את כוסות העין המבודדות פעמיים במיליליטר אחד של PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
כדי להגן על כוסות העיניים, יש לצייד אותן ב-15% סוכרוז ו-PBS למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עד שהן שוקעות. לאחר מכן מעבירים את כוסות העיניים ל-30% סוכרוז ו-PBS למשך שעתיים עד שלוש שעות עד שהם שוקעים. מניחים את כוסות העין ב OCT ב 10 על ידי 10 מילימטר קריו-תבניות להטמיע.
תחת מיקרוסקופ ניתוח, לכוון את העין בתבנית קריו לאורך ציר הגחון הגבי שלה על ידי סיבוב העין עד סימן הכוויה הוא על גבי. עצב הראייה הוא אחד שמאלה ואת חלק לחתוך את התבנית פונה ימינה. כדי לצלם להקפיא את רקמת הרשתית, לטבול את ההקפאה-עובש לפחות חמש דקות בסק מתכת המכיל isopentane ולאחר מכן למקם את הקוטקר בחנקן נוזלי עד שליש מגובה התוך של המקור.
מוציאים את הבלוק הקפוא, עוטפים אותו בנייר אלומיניום, ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש בעט או שארפי כדי לסמן את הבלוק הקפוא כדי לתעד את הכיוון שלו. לאחר התאמת טמפרטורת ההקפאה בין מינוס 20 למינוס 25 מעלות צלזיוס, מניחים את התבניות המכילות את כוסות העיניים המוטבעות בפנים ומאפשרים להם לצייד לטמפרטורת ההקפאה למשך שעה.
התקן את הבלוק ב cryostat עם כיוון הגחון הגבי ולהתחיל לחתוך 10 חלקים טוריים עבים מיקרומטר. מניחים בזהירות את קטעי הרשתית על שקופיות מיקרוסקופ מבואר ממוספר ולאחר מכן לאחסן בתיבות שקופיות במינוס 20 מעלות צלזיוס או מינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן immunostaining. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים לרודופסין, סמן פוטורצפטור, חומצה גלוטמית decarboxylase 65, וסמן תאים אמקרין, סינתזת גלוטמין וסמן תא מולר, ו calbindin, סמן תא אופקי בוצע על קטעי רשתית.
התוצאות מצביעות על כך שפרוטוקול זה מניב סעיפי רשתית באיכות גבוהה ונשמר היטב שלא כמו בקטעי רשתית באיכות ירודה המתקבלים מפרוטוקול אחר. הקטעים הפנימיים והחיצויים העשירים ברודופסין נשארים אנכיים וללא כל הפרדה מאפיתל פיגמנט רשתית. Interneurons, כגון תאי אמקרין חיוביים Gad65, נשארים מרודים כראוי בתוך השכבה הגרעינית הפנימית ואת שכבת plexiform הפנימית.
כמו כן, תאי מולר נשמרים היטב עם סומא מיושר כראוי בתהליכים ציטופלסמיים המשתרעים משכבת תא הגנגליון לשכבה הגרעינית החיצונית. יתר על כן, תאים אופקיים מוגדרים היטב ניתנים לגילוי בשכבה הגרעינית הפנימית ובגבול שכבת הפלקסיפורם החיצוני. חשוב לסמן את אזור טופר של העיניים ולשמור על הכיוון במהלך הטבעה.
תמיד להכין paraformaldehyde מתחת למכסה המנוע עם ציוד מגן אישי המתאים.
