This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים שהונפקו על ידי הרפובליקה הפדרלית של גרמניה. הערה: מכיוון רקמת הרשתית תהיה נטולה חמצן במהלך חלקים ממושכים של הליך זה, כל הצעדים צריכים להתבצע מהר ככל האפשר. עכברים צריכים להיות כהים מותאמים לפחות 3 שעות לפני הניתוח. כדי למנוע הסתגלות לאור ברשתית, הכנה חיתוך צריך להתבצע תחת אור אדום עמום. 1. הכנת כימיקלי מדיה אחרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן איימס בינוני 6. לאחר דיסקציה, לטבול רקמת הרשתית ב בינוני &#39;איימס בכל עת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2.2 גרם של בינוני &#39;איימס 298 HEPES מ&quot;ג ב 250 מ&quot;ל מים מזוקקים. ריכוז HEPES יהיה 5 מ&quot;מ. מערבבים בעדינות עד שכל החלקיקים המומסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני &#39;הבועה איימס בטמפרטורת החדר עם carbogen (חמצן 95%, 5% המכוניתפחמן דו בון) עבור 5 דקות לפחות. אספקת carbogen עם פיפטה פסטר זכוכית לפתרון. חבר את פיפטה פסטר דרך צינורות מתאימים לשקע של רגולטור הגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 475 מ&quot;ג-סודיום ביקרבונט לפתרון. התוספת של ביקרבונט לאחר מבעבע מונע משקעים של סידן פחמתי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן agarose gelling בטמפרטורה נמוכה. Agarose נדרש להטבעה של רקמת רשתית במהלך חתך vibratome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 180 agarose מ&quot;ג ב 9 מ&quot;ל איימס בינוני ו 1 מ&quot;ל מים מזוקקים. השתמש במיקרוגל כדי לחמם את פתרון agarose לאט עד שכל המוצקים הם מומסים. מחממים 5 - 10 במרווחים שניים כדי למנוע הצפה. הפתרון צריך להיות ברור ושקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות מומסת agarose באמבט מים ב 37 ° C למשך זמן של ההליך. </li></ol></li></ol> 2. הגדרת Vibratome הערה: כל החתך בוצע עםvibratome הנזכר בטבלת החומרים. ההגדרות שניתנו מתייחסים לסוג זה של vibratome בלבד. לפרטים נוספים על vibratome חתך של רקמה עצבית בבקשה להתייחס התייחסות 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח vibratome להב מזרק לתוך מחזיק להב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד הטיה אנכית של להב עם המכשיר &quot;vibrocheck&quot;. השתמש בורג התאמה על מחזיק הלהב כדי להטות את הלהב עד שהוא מקביל למישור החיתוך. המיקום המדויק של הלהב נחוץ כדי למנוע תופעות תריסים על פני שטח הסעיף וכדי לייצר קטע שטוח המכיל תאי חיים על פני השטח שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר vibratome להגדרות הבאות: משרעת, 1.00; מהירות, 0.20; עובי, 180 - 200 מיקרומטר. </li></ol> Dissection 3. רשתית עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש עכבר בוגר C57BL / 6 על ידי אידוי של כ 1 מ&quot;ל isoflurane במיכל אטום לאוויר. כאשר הרדמה תושלם, להרדים בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם. העכבר לא צריך להיות מעל גיל 3 חודשים, אחרת איכות הפרוסות תדרדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כדור העין על ידי הצבת מלקחיים מעוקל תחת עינו. בעדינות הרמת כדור העין יחשוף את עצב הראייה. חותכים את עצב הראייה עם מספריים באביב ולהעביר כדור העין כדי בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ המכיל 2 מ&quot;ל בינוני &#39;איימס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע כל הצעדים הבאים על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו. התאם את ההגדלה לערך המאפשרת שליטה ויז&#39;ואלי מההליכים הבאים (שלבים 3.4 - 3.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את הקרנית על המעבר בלובן העין עם מלקחיים מחודדים או מחט 20 G. במהלך שלב זה, לייצב את כדור העין עם מלקחיים אחרים. היזהר שלא לפגוע ברשתית עם מכשיר ניקוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מספרי האביב לתוך החור הקטן עשוי בשלב 3.3 וחותכי עיגול סביב הקרנית. שוב, לייצב את כדור העין עם מלקחיים תוך חיתוך. שמור החתך מאוד קרוב לפני השטח כדי לא גut לתוך הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות הקרנית, העדשה, הגוף הזגוגי עם מלקחיים. הגוף הזגוגי מהווה רק שכבה שקופה דקה בחלק האחורי של העין. עם זאת, הוא חיוני עבור vibratome חתך כי הגוף הזגוגי יוסר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת פטרי, מקם את עיינית באופן מסתכל דרך החור למטה על הרשתית. שפת הפתח צריכה להיות מורכבת של רקמות scleral בלבד. אם החתך העגול (שלב 3.4) בוצע קרוב מדי לקו המשווה של עיינית, רקמת רשתית תהיה גם קרוב הווה אל החתך. היזהר אז שלא לפגוע ברשתית בשלב 3.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את בלובן העין עם מלקחיים ובזהירות לקרוע את הרקמה בנפרד. זה חיוני שלא לקרוע את הרשתית במהלך שלב זה. במידת הצורך, לנתק את הרשתית מן serrata אורה ידי מייצבת החלק scleral של הרקמה עם מלקחיים ובזהירות קילוף הרשתית עם מלקחיים אחרות. שמור המלקחיים סגורים; מעולם להתמודד מחדשטינה עם מלקחיים מאז הרקמה היא רכות מאוד תיתן לדרך מייד. הערה: בשלב זה, הרשתית ושאר עיינית יחוברו רק בראש עצב הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את האתר המצורף בראש עצב הראייה עם מספרי האביב. הרשתית צריכה עכשיו להיות צפה בחופשיות כמקשה אחת של רקמות בינוניות &#39;איימס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרשתית לתוך 4 - 6 מלבנים קטנים של כ 23 מ&quot;מ באמצעות סכין אזמל מעוקל על ידי החזקת הרשתית בשולי עם מלקחיים, כדי לתפעל אותו למקומו. הימנע צובט את רקמת הרשתית בתוך המלבנים. קח חתיכות מן החלקים המרכזיים של הרשתית, לא בפריפריה הרחוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר חתיכות רשתית עם פיפטה פסטר פלסטיק בקוטר גדול כדי בצלחת פטרי פלסטיק 35 מ&quot;מ, החלק התחתון של אשר הוחלף על ידי רשת עם גודל הרשת פחות מ -1 מ&quot;מ. תקן את צלחת פטרי בתוך השליש העליון של בקבוק בכוס או חרוטים לצלול חתיכות רשתית bu הבינוני &#39;איימסbbled עם carbogen. </li></ol> Embedding 4. רשתית חתיכות Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות 2 - 3 חתיכות רשתית לתוך צלחת 35 מ&quot;מ פטרי מפלסטיק יחד עם כמה מן הבינוני &#39;איימס. זה הכי נוח להשתמש פיפטה פסטר מפלסטיק בקוטר גדול עבור ההעברה. בשלב זה, את הכיוון המדויק של חתיכות ברשתית לא משנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר ככל האפשר של בינוני &#39;הנותר איימס עם פיפטה פסטר זכוכית. ברגע הנוזל הוסר להמשיך בשלב 4.3. אל תתנו יבש רקמת הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לכסות חתיכות רשתית עם 2 מ&quot;ל של מומס agarose (37 מעלות צלזיוס). בהתחשב בגודל שצוין בשלב 3.10, החלקים לא להתכרבל בתוך agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך agarose הנוזל, בעדינות לדחוף חתיכות ברשתית אל החלק התחתון של צלחת פטרי. שכבת תא גנגליון צריכה לפנות כלפי מטה. שימוש במיקרוסקופ סטריאו לשיפוט של מיקום מדויק. עבור מיצוב, להתמודד pi רשתיתeces עם מרית קטנה. מקם את הרשתית מהר ומדויק ככל האפשר מאז agarose יהיה לגבש במהירות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים חתיכות רשתית במקביל לחלק התחתון של המנה זכוכית; סעיפים אחרים יהיו משיקים או אלכסוני. יצירות בודדות לא צריכות לגעת זה בזה, אך גם לא צריך להיות יותר מדי רחוק אחד מהשני. נסה להניח את חלקי רשתית פחות או יותר על אותה הרמה אופקית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בצלחת פטרי זכוכית עם חתיכות רשתית מוטבעות לתוך המקרר (4 - C ° 6) עבור 2 דקות לפחות. זה יקשיח את agarose במהירות לעיבוד נוסף. ברגע agarose יש polymerized להמשיך לשלב הבא. </li></ol> שמת 5. הרשתית Pieces <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את גוש agarose המכיל חתיכות רשתית מצלחת פטרי. השתמש מרית או מכשיר דומה כדי להרים את הגלגלת agarose ממשטח הזכוכית. בשל כוחות דבקים, זה יכול להתברר די קשה. עם זאת, למנוע שבירלחסום agarose. לבצע זאת וכל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גוש agarose על coverslip זכוכית ולהתאים את גודל עם להב סכין המנתחים. השאר 1 - 2 מ&quot;מ של agarose בכל צד של חתיכות רשתית. הגודל הסופי של הבלוק צריך להיות סביב 1,066 מ&quot;מ (10 מ&quot;מ מתייחס לגובה של הבלוק, 6 מ&quot;מ עד אורך קצה שלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק את בלוק agarose לבעל הדגימה של vibratome באמצעות דבק מיידי. חתיכות רשתית צריכות להיות ממוקמות בחלק העליון של הבלוק הגבוה 10 מ&quot;מימ ו מכוון במקביל פני השטח שלו, בעוד שחלק התחתון מודבק לבעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הבלוק מייד על ידי מזיגה הבינונית בעבר המבעבע &#39;איימס למגש החיץ של vibratome. </li></ol> 6. הכנת הסעיפים האופקית Vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל חתך. בתחילה להגדיר את העובי של חיתוך ידני עד שברי רקמת רשתית מופיעים הפרוס. ואז לשנות את ההגדרות בשלב 2.3. מאזרשתית העכבר היא רק כ -200 מיקרומטר עבה, לא תהיינה יותר מ 2 - 3 פרוסות לכל בלוק agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סעיפים ממגש חיץ עם מוט זכוכית ולהעבירם 2 מ&quot;ל בינוני &#39;איימס בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות חלקים מיד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2/55% O 2). את agarose המקיף את החלקים יישאר מוצק בחממה והוא יכול לשמש כדי להתמודד עם החלקים ללא פגיעה ברשתית. איכות פרוסת Better מתקבלת בעת אחסון על 37 מעלות צלזיוס בתוך האטמוספרה בהתאמה לעומת הבינוני &#39;מחומצן איימס ב RT. סעיפים ניתן להשתמש מיד או ניתן לאחסן עד 4 שעות בחממה עם תוצאות פיזיולוגיות טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ חתיכות רשתית הבאות בסעיפי agarose וחזור 4 - 6. </li></ol>

<ol>
	<li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse.">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response.">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li><li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods.">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li><li>Singer, J. H., Lassov&#225;, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li><li>Peichl, L., Gonz&#225;lez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae:+a+comparison+of+rat,+mouse,+gerbil,+and+guinea+pig.">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+and+function+of+mammalian+horizontal+cells.">Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells.</a> Development of the Retina. , (1998).</li><li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light/dark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina.">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li><li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slice+preparation+of+the+retina.">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).</li><li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses.">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li><li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+(Commentary+on+Feigenspan+&amp;+Babai).">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan &amp; Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> בניגוד פרוסות אנכיות, את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים אורינטציה רדיאלית כמו תאים אופקיים ותאי amacrine נשמרה היטב. לעומת הכנות רשתית כולה, סוגי התאים אלה נגישים בקלות עבור microelectrodes ויכולים להיחקר על ידי שני טכניקות אלקטרו והדמיה. כאן, התמקדנו הרשתית החיצונית; עם זאת, גישה דומה דווחה במיוחד עבור תאי amacrine של הרשתית הפנימית 10. המאפיינים של הכנת החתך האופקית יש כמה השלכות על מחקרים תפקודיים. מספר קשרים סינפטיים בין קולטני האור חרוט תאים אופקיים postsynaptic היה כמעט זהה לגמרי לזה של הרשתית ללא פגע. קשרים סינפטיים תפקדו, מראה שחרור טוניק של הנוירוטרנסמיטר בחושך. הסינפסה יכול להיות מופעל על ידי אחד גירויים אנדוגני כמו אור / מעברים כהים או על ידי גירוי דו קוטבי חיצוני. תחת = &quot;jove_content&quot;&gt; שלב קריטי אחד של הטכניקה הוא הבידוד של הרשתית עוצמה, אשר אמורה להתבצע מהר ככל האפשר מבלי לפגוע ברקמה. בנוסף, הנוכחות של שרידי הגוף הזגוגי משפיעה לרעה על איכות הפרוסות. עוד צעד קריטי הוא המיקום הנכון של חתיכות רשתית. למרות בזהירות מירבית נלקחה לאתר את חתיכות רשתית במקביל התחתונה של צלחת הזכוכית, המטוס של חתך עדיין מסוגל לנסוע מעט בעקיפין דרך הרשתית. בהתאם לזווית, השדה הדנדריטים של נוירונים אוריינטציה רדיאלית יהיה פחות או יותר קטום. הטכניקה המוצגת כאן היא מוגבלת בעיקר נוירונים אוריינטציה אופקית. לכן, אין זה אפשרי להקליט קולטני אור ותאים דו קוטביים שלמים פרוס אופקי, מאז אקסונים תא דו הקוטביים יקוצצו. בנוסף, אי אפשר בהחלט לשלוט ברמת חתך. קלע זרק פיסת רשתית יחידהובכך ight להיחתך ברמה בלתי רצויה, למשל בין מגזרים חיצוניים ופנימיים של קולטני אור. הגדלת מספר חתיכות רשתית במרחק של רחוב אחד סיכויי עליות agarose של מטוס נכון של חתך לפחות בחתיכה אחת. הכנת החתך האופקית היא גם מתאימה ללימוד המאפיינים הייחודיים של סינפסות סרט של קולטני אור מוט חרוט. עד כה, השתמשנו מערכת החי נוק-אאוט לחקור את התפקיד של חלבונים presynaptic complexin 3 ו complexin 4 על העברה סינפטית בין קולטני האור חרוט תאים אופקיים 11. כמו כן ניתן ללמוד את המאפיינים של קולטני הנוירוטרנסמיטר postsynaptic, כפי שהוצג קודם 9. יישומים עתידיים יכללו במחקר של חלבונים סינפטיים מבוססים על קווי עכבר מהונדסים עם טכניקות אלקטרו והדמיה. כמו כן ניתן יהיה לחקור את פרו biophysicalperties של צומת פער בין תאים אופקיים. מאז תגובות אור ניתן למדוד, הטכניקה תהיה גם לשמש כדי לחקור את הקידוד של גירויי אנדוגני ב הסינפסה הראשונה של מערכת הראייה. אפשר לבצע את ההכנה בחושך כדי למנוע הסתגלות לאור הרקמות, אחרת תגובות האור תהיינה בעיקר חרוט מונחה. לסיכום, הכנת החתך האופקית מייצגת גישה חדשנית להגדיל את הנגישות של סינפסות בודדות כתנאי מוקדם ללימוד תכונות הפעילות שלהם ברשתית היונקת 12.

מידע חזותי מקודד כדפוס במרחב ובזמן דינמיקה של הפעלת קולטי אור, ואת סינפסה הסרט בין קולטני אור ונוירונים מסדר השני קובעת את העברת הזרם של מידע חזותי. הכנת החיתוך האנכית של הרשתית היונקת היא כלי בעל ערך רב ללמוד עיבוד אותות במסלולים אנכיים, כלומר בין קולטני אור ותאים דו קוטביים, ובין תאים דו קוטביים סוגים מסוימים של תאי amacrine 1, 2, 3, 4. עם זאת, חתך אנכי תמיד גורם עיצור חמור של שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית רבים, שמוביל לאובדן ניכר של קשרים סינפטיים. במיוחד ברשתית החיצונית, תאים אופקיים מושפעים בשל שדות דנדריטים המורחבים רוחבי להפיץ שלהם ומערכות מסוף האקסון 5. בעוד אנכילהכנת פרוסה, הקלט הסינפטי של מאה מסופי photoreceptor חרוט אל דנדריטים של תא אופקי ובכך מצטמצמת כמה קשרים דלילים. זה עשוי להספיק כדי ללמוד את המאפיינים של סינפסות בודדות, אך היא עושה בשום פנים ואופן לא מייצג את יכולות עיבוד אותות שבבסיס ההפעלה המסונכרנת של סינפסות סרט קולטי אור. לפיכך, אנו פתחנו להכנת פרוסה אופקית, מה שמשאיר כמעט כל קולטי האור החרוטים קלט הסינפטי על דנדריטים תא אופקיים שלמות ומתפקד. המטוס של ריצות חתך מקביל פני השטח של הרשתית, אידיאלי חיתוך דרך שכבת הגרעין הפנימי בין תאים אופקיים ותאי amacrine. לפיכך, פרוסות אופקיות של הרשתית החיצונית נוצרות המכילות, באתר presynaptic, קולטני אור עם פלחים פנימיים וחיצוניים וכן מסוף הסינפטי, ותאים אופקיים תאים דו קוטביים באתר הפוסט-סינפטי. הכנה זו מתאימה היטב to לחקור תשומות הסינפטי מתואמות לתוך דנדריטים תא אופקיים על ידי כל קולטני האור חרוט בתוך השדה הדנדריטים שלו. זה ובכך עשוי להיות שימושי כדי להבין טוב יותר את פעולתו של סינפסה סרט קולטי האור, שהוא חיוני להעברת מידע חזותי מהמטריצה ​​של הפעלת קולטי האור לתוך תגובה postsynaptic.

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish (plastic)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispensary university hospital</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome injector blade</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved scalpel blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies

הכנות פרוסות אנכיות מבוססות היטב ללמוד מעגלים והעבירו אותות ברשתית של יונקי הבוגרים. המטוס של חתך בהכנות אלה הוא בניצב לפני שטח הרשתית, מה שהופך אותו אידיאלי לחקר נוירונים רדיאלית אורינטציה כמו קולטני אור ותאים דו קוטביים. עם זאת, סוכות דנדריטים הגדולות של תאים אופקיים, תאי amacrine רחב בתחום, ותאי גנגליון הן בעיקר קטומות, עזב פעילות סינפטית מופחתת במידה ניכרת בתאים אלה. בעוד תאי גנגליון ותאי amacrine העקורים ניתן ללמוד הכנה שלמה הרכובה של הרשתית, תאים אופקיים ותאי amacrine ממוקמים שכבת הגרעין הפנימית הם רק גרוע נגישים עבור אלקטרודות ברקמת רשתית כולה. כדי להשיג נגישות מקסימלית ויושרה הסינפטי, פתחנו תכשיר חתך אופקי של רשתית העכבר, ולמדו להעברת אות ב הסינפסה בין קולטני אור ואופקיתאים. חתך אופקי מאפשר (1) זיהוי חזותי קל וחד משמעי של גופי תא אופקיים מיקוד אלקטרודה, ו (2) שמירה על שדות דנדריטים תא אופקי המורחבים, כתנאי מוקדם קלט הסינפטי חרוט שלם ופונקציונלי דנדריטים תא אופקיים. תאים אופקיים מן הפרוסות אופקיות הציגו פעילות סינפטית טוניק בחושך, והם הגיבו לתדרך הבזקי אור עם ירידה של פעילות סינפטית נוכחית והפחיתה פנימה. ראיות Immunocytochemical מציין שכמעט כל קונוסים בתוך השדה הדנדריטים של תא אופקי להקים סינפסות עם דנדריטים ההיקפיים. בהכנת הפרוסה האופקית ולכן מתאימה גם ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של נוירונים ברשתית להאריך אותה אופקית כמו גם להעברת אות חושית ואינטגרציה ברחבי סינפסות שנבחרו.

<html> ב פרוסות אופקיות של רשתית העכבר, גופי תא אופקיים ניתן היו לזהות בקלות על פי המורפולוגיה הייחודית שלהם עם מספר דנדריטים העיקרי העולה מתוך (איור 1 א) גוף תא מצולעים. גופי התא האופקיים סמוך לפני השטח של הפרוסה היו נגישים באופן שגרתי עבור אלקטרודות מהדק תיקון. במהלך הקלטות, תאים היו מלאים צבע פלואורסצנטי, חושף arborization הדנדריטים שלהם המורכב, שדמה את המורפולוגיה של תאים אופקיים נושאות האקסון של רשתית העכבר השלמה 8 (איור 1 ב). תיוג של pedicles קונוס עם agglutinin בוטנים מצמיד והעמסה הראה קשר המרחבי הדוק בין pedicles חרוט דנדריטים תא אופקיים (איור 1 ג). עם כמה יוצא מן הכלל, כל pedicles חרוט בתוך השדה הדנדריטים של התא האופקי יצרו קשר תהליכים דנדריטיים. אף אוזן גרון &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; כדי להוכיח כי המגעים בין קונוסים תאים אופקיים תפקדו, הקלטות מהדק התיקון בוצעו מגופי תא אופקיים בתנאים כהים מותאם, תגובות נוכחיות היו. מאופיין מלווה זרם פנימה רב בינוני עד פעילות סינפטית בתדר גבוה (איור 2 א). הסטייה מנקודת התחלה ואת הזרמים סינפתטי נגרמו על ידי השחרור מתמיד של גלוטמט בחושך, הפעלת גלוטמט AMPA- ו kainate מסוג postsynaptic קולטני 9. אירועים הסינפטי פרט התאפיינו צורת גל monophasic או מסלולים נוכחיים מורכבים יותר (איור 2 ב). הנוכחות של פעילות postsynaptic טוניק מצביעה על כך גלוטמט שוחרר על הקשרים סינפטיים בין קולטני אור החרוט דנדריטים תא אופקיים שמוצגים באיור 1C. Horizoתאי פתיחות opening סגירות closures רשמה הגיבו לשינויים בעוצמת אור, המציין כי המפל הולכים אותות קולטניים אור חרוט היה גם תם ופונקציונלי ב כנת חתך אופקית. עקב צמצום של שחרור משדר, טוניק פנימה הנוכחי של תאים אופקיים כהה מותאם היה עצור, ואת פעילות סינפטית הופיע פחתה באופן ברור במהלך נוכחות של גירוי אור שדה מלא (1,300 W / 2 ס&quot;מ, 470 40 ננומטר) (איור 3A). כמו כן, מתג לחושך ממצב אור המותאם גרם זרם פנימה וגדילת פעילות סינפטית (איור 3 ב). בנוסף, פולסים חשמליים קצרים (1-15 V, 1 msec) יושמו באמצעות אלקטרודה גירוי דו קוטבי פלטינת אירידיום כדי depolarize כל קולטני האור החרוט בקרבת גוף תא אופקי. המהדורה נגרם הגירוי של גלוטמט עוררת זרמים סינפתטי משרעת גדולה בתא האופקי רשם (איור 3 ג). בסעיףummary, ממצאים אלה מראים באופן משכנע כי סינפסה בין קולטני אור חרוט תאים אופקיים ניתן להשפיע באופן ניסיוני על ידי או שאור גירוי אנדוגני או על ידי שלילת קוטביות מבוקרת של אלמנטי presynaptic. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55173/55173fig1.jpg" /> איור 1: מורפולוגיה קשרים סינפטיים של תאים אופקיים בתוך הכנה פורסת אופקית. תא אופקי (חץ) ממוקם קרוב לפני השטח של הפרוסה היה דמיין עם אופטיקה בניגוד Dodt. בר סולם = 10 מיקרומטר (א). בניסויים הדמיה, תא אופקי התמלא אורגון גרין 488 BAPTA-1 (100 מיקרומטר) באמצעות אלקטרודה-תיקון, אשר עדיין מחוברת התא. בר סולם = 10 מיקרומטר (B). כיסוי של תא אופקי מוזרק צבע ואת המערה של pedicles חרוט שכותרתו עם agglutinin בוטנים מצמיד והעמסה מגלה קשרים סינפטיים משוערים.<html> בר סולם = 10 מיקרומטר (C). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55173/55173fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55173/55173fig2.jpg" /> איור 2: פעילות סינפטית הקלטות מגוף תא אופקי. כל תא מתח- clamp הקלטה בבית פוטנציאל החזקת -60 mV מראה פעילות סינפטית טוניק בתדר גבוה (A). ברזולוציה הזמנית גבוהה (B), אירועים הסינפטי להציג גל monophasic (חץ) או מסלולים נוכחיים מורכבים יותר (ראשי חץ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55173/55173fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> g3.jpg &quot;/&gt; איור 3: תגובות נוכחיות של גופי תא אופקיים עוררים על ידי אור חשמל גירוי. בתגובת אור של גוף תא אופקי כהה מותאם רשם ב -60 mV מחזיק פוטנציאלי. תאורה מלאה שדה מעכב את טוניק פנימה הנוכחי ומפחית פעילות סינפטית (א). גוף תא אופקי בהיר מותאם רשם באותם תנאי מציג זרם פנימה הבא בזק כהה מלווה פעילות סינפטית עלתה במהלך החושך (B). קווים אופקיים ב A ו- B מייצגים את העיתוי של גירוי. גירוי תאים ידי פולסים חשמליים קצרים גורם זרמים סינפתטי גדולים משרעת עקב השחרור המסונכרן של גלוטמט קולטני אור קונוס (C). פוטנציאל החזקה: -60 mV. החץ מציין עיתוי דופק הגירוי. זרמים קטועים בתחילת העקבות מייצגות חפצי גירוי..com / קבצים / ftp_upload / 55,173 / 55173fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K Views.  Friedrich-Alexander-University (FAU) Erlangen-Nürnberg.  פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה. 

Video: Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Biology

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

חקר תאים עצביים דו-קוטביים ואופקיים ברשתית המפוצלת של מורין

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

מחבר זרקור: שימוש בטכניקת הרשתית המפוצלת לגישה משופרת וניסויים מואצים 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video