שיטה זו מאפשרת לטפל ולמת את האופן שבו התאים מתארגנים באופן קולקטיבי. זה חשוב כי אנחנו יכולים מודל דפוס במבחנה ורמזים disentangle יחד בחוזקה vivo. הטכניקה דורשת ציוד מומחה מינימלי, המאפשר לה לקום במעבדה ביולוגית סטנדרטית, והיא כמותית, מה שמאפשר גילוי של אירועי דפוס תת-ויזואליים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על כל מערכת תא שבה דפוס יכול לצוץ ולגלות דפוסים לא אקראיים של התברות, התפשטות ותחרות בין תא לתא. העיקרי בשיטה זו הוא אופטימיזציה שיטתית של פרמטרים micropatterning עבור סוגי תאים חדשים. לדוגמה, גודל וצורה של תבנית, סוג מטריצה ותוזה של הידבקות בתאים.
לובשים כפפות, מניחים חתיכת סרט מעבדה בתחתית צלחת פטרי מרובעת באורך 10 ס"מ. השתמש בניקוב חורים של 12 מ"מ כדי לחתוך מגלשות פלסטיק הידרופוביות כדי ליצור תלושי כיסוי של 12 מ"מ מסביב, והצב את מחליקי הכיסוי בצלחת פטרי חדשה. השתמש פינצטה כדי להסיר בזהירות את הסרט מגן מן החלקות העטיפה.
מניחים את מסכת הצילום על משטח נקי ויציב, צד כרום למעלה, ומוסיפים טיפה של שני מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים במיקום של עיצוב השבב הרצוי. לחץ בעדינות על החלקת שער על הירידה והצב את המחזיק מעל מגלשות הפלסטיק. בזהירות לתקן את הכריך הזה עם מלחציים כדי לשמור על חתיכות פלסטיק במגע עם מסכת צילום.
מניחים את ההרכבה במנורת אוזון אולטרה סגולה כשני סנטימטרים ממקור האור לתאורה של 10 דקות. בסוף תקופת התאורה, תופסים את הכריך עם מסכת הצילום בתחתית ומסירים בזהירות את המהדקים תוך שמירה על לחץ ביד אחת כדי למנוע מהמגלשות לנוע תוך פירוק הכריך. לאחר הסרת כל המהדקים, מוציאים את המחזיק, דואגים שכל חתיכות הפלסטיק עדיין על המסכה ולא דבוקות למחזיק, ומוסיפים מים מזוקקים כפולים לשבבים כדי לנתק בעדינות את השבבים מסכת הצילום.
מניחים את השבבים בדוגמת התמונה בתוך תא התצהיר של המטריצה, צד מואר כלפי מעלה ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של תותב ציפוי על כל שבב. לאחר מכן, מוסיפים צלחת פטרי באורך 3 ס"מ מלאה במים מזוקקים כפולים לתא כדי להגביל את האידוי בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. עבור זריעת תאים עובריים על השבבים, לשטוף את השבבים עם שתי שטיפות לפחות חמש דקות PBS טרי, סטרילי לכל לשטוף, לפני חלוקת אחד 10 עד התאים החמישי ב 200 microliters של מדיום תרבות התא המתאים על כל שבב.
ואז לסגור את תא הזריעה. דגירה במשך שעה אחת כדי לאפשר לתאים לדבוק בשבבים. כאשר התאים מחוברים, למלא את בארות של צלחת multiwell עם 500 microliters של מדיום חם לגם, ולהשתמש פינצטה סטרילית להעביר את השבבים לתוך בארות צלחת בודדים.
מנערים את הצלחת במרץ כדי לנתק את כל התאים שאינם חסידים, ומיד להחליף את העל-טבעי במדיום טרי וחם. ואז לבדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לבחון אם דפוס גלוי. 48 שעות לאחר ציפוי שלהם, התאים צריכים ליצור מושבות צפופות כי בקפדנות בצע את הצורה של הדפוסים.
משאירים את השבבים בצלחת, מסירים את כל המדיום מלבד מספיק כדי למנוע מהשבבים להתייבש, ומוסיפים לפחות 500 מיקרוליטרים של פרפורמלדהיד או פתרון קיבוע מבוסס PFA לעין. לאחר עשר דקות, לשטוף בקצרה את הבאר שלוש פעמים עם פתרון כביסה, ואחריו לשטוף אחד עם 50 מילימולר אמוניום כלוריד מדולל בתת תקצוב כביסה כדי לרוות את פעילות ההצלבה PFA שיורית. לאחר הכביסה האחרונה, לטפל בדגימות עם פתרון חסימה לפחות 30 דקות.
לכשל חיסוני של תרבות השבבים, מעבירים את השבבים לצד תא מכתים למעלה, ומיד מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים העיקרי המעניין כל שבב. לאחר שעה על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורת החדר, לשטוף את השבבים שלוש פעמים עם פתרון כביסה כפי שהוכח, ולהדגים את השבבים עם נוגדנים משניים המתאימים במשך שעה אחת על הפלטפורמה מסתובבת. בסוף הדגירה המשנית של הנוגדנים, שטפו את השבבים שלוש פעמים בתסכולת הכביסה והרו את השבב על מגלשת מיקרוסקופיה עם 20 מיקרוליטרים של כל מדיום הרכבה סטנדרטי.
כדי לדמיין את השבבים, התאם תחילה את מהירות הסריקה, רזולוציית התמונה, ממוצע המסגרות ורווחי הגלאי כדי לזהות אופטימלי בין איכות התמונה לזמן ההדמיה. לאחר מכן לרכוש תמונות של כל שבב. לאחר שכל התמונות נרכשו, התקן והפעל את PickCells בהתאם לתיעוד הזמין באינטרנט, צור ניסוי חדש וייבא את התמונות לתוכנית.
השתמש במודול Nessys כדי למקטע את הגרעינים בהתבסס על אות המעטפה הגרעינית. השתמש במודול הפילוח הבסיסי כדי לזהות את אות השפע האוטומטי של התבנית. לאחר מכן לחץ על סיום"והמתן לעיבוד כל התמונות.
ליצירת עצמים גרעיניים ולמשכוב תכונות אובייקט בסיסיות, הפעל את המודול תכונות מהותיות מפס המשימות וסגור את הלוחות Ellipsoid Fitter ו- Surface Extractor כדי להשאיר רק את החלונית 'תכונות בסיסיות' פתוחה. בחרו 'גרעין' כ'סוג אובייקט', ובחרו את הקידומת שסופקה לתמונות המפוספקות. לאחר מכן לחץ על מ לחשב" והמתן לעיבוד כל התמונות.
בשלב זה, תכונות נוספות צריך להיות כתוב לתוך גרעינים לפני ייצוא הנתונים לניתוח שלנו. לדוגמה, כדי לאחסן את שם התמונה שכל גרעין שייך לה כתכונת גרעין, לחץ על נתונים "ותכונה חדשה" ובחר גרעין בתיבת הדו-שיח המוקפץ. לחץ על אישור"בחר לאסוף נתונים מאובייקטים אחרים המחוברים לצומת" ולחץ על הבא "בחלונית הימנית, בחר תמונה" ולחץ פעמיים על סימן החקירה כדי להגדיר את צומת התמונה כיעד של הנתיב.
הרחב את החלונית פעולת הפחתה ובחר קבל תכונה אחת"הרחב את החלונית תכונה זמינה ובחר את התכונה שם. לאחר מכן לחץ על שנה"ו הבא"הזן שם תמונה, הקש על מקש Tab ולחץ על סיום"לאחר מכן יצא את הנתונים לקובץ ערך המופרד באמצעות טאבים. לצורך הניתוח שלנו, לולאה את הנתונים המיוצאים לתיקיית הנתונים של תיקיית R-Script.
פתח את הסטודיו שלנו"ו פתח את תבנית המפה המאוכפלת R-Script"לאחר מכן הגדר את ספריית העבודה למיקום קובץ המקור והפעל את קובץ ה- Script כדי ליצור מפות צפיפות. בשעה אחת לאחר זריעת התאים, ייתכן שתרבות התאים הבודדת לא תהיה חד-משמעית לחלוטין מכיוון שהתאים מתרבים עם הזמן. עם זאת, הדפוסים יתיישבו באופן מלא עם מעט מאוד תאים מחוץ למשטחי ההיבקות.
תבנית שלא ברורה עד שעתיים לאחר הזריעה מצביעה על כשל בהליך. הכליאה המרחבית של תאי גזע עובריים של עכבר על דיסקים גדולים או מיקרופטרנים טבעת מנחה את התבנית של תת אוכלוסייה של תאים המבטאים את סמן הברכיורי mesodermal. לדוגמה, כאשר תאי הגזע העובריים של העכבר גדלים על מיקרופטרנים של דיסק גדול, התאים החיוביים-ברכיורי מוגבלים באופן מועדף לפריפריה של התבנית שבה צפיפות התאים המקומית היא הנמוכה ביותר.
דפוס זה מאושר על ידי המפה של עוצמת המוח-brachyury. נתונים אלה מראים כי השיטה יכולה לחשוף מידע תת-ויזואלי מכיוון שבדיקה של מושבה אחת אינה מספיקה כדי לזהות כל צורה של ארגון מרחבי בסמן של ביטוי עניין. זה מוסבר בעיקר על ידי השונות החשובה בין המושבה למושבה.
הטכניקה גם מדגימה כי אין דפוס לגילוי קיים עבור מעכב של DNA מחייב אחד אשר עשוי להצביע על כך T-דפוס אינו מונע על ידי חלבון מורפגנטי עצם איתות בהקשר זה. זכור תמיד איזה צד של להחליק הכיסוי בוטל מצופה וגם להיות בטוח כי התאים דבקו כראוי לפני לשטוף את התאים העודפים. שיטה זו מאפשרת את המחקר של רמזים סביבתיים חשוב בהנחיית ארגון עצמי של תאים והוא יכול גם ליידע מודלים מתמטיים המסייעים לנו טוב יותר תחת דפוס בסיסי.
