אנו מודים אטסשי המייאוואקי וחמאת הירושי לעצה שלהם על הניסויים elAbSca, צ'ארלס Yokoyama לעריכה של כתב היד, Ohshima אריקו, מיוקי Kishino לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמך על ידי קרנות מחקר של RIKEN תוצרת הארץ, Grants-in-Aid למחקר מדעי של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT) של יפן כדי תוצרת הארץ (אזורים חדשני "Mesoscopic Neurocircuitry"; 22115004), אס (25890023).

כל ההליכים ניסיוני היו אושרה על ידי RIKEN Wako חיה ניסויים ועדת ועדת הבטיחות של הניסוי רקומביננטי RIKEN גנטי, שבוצעה על פי הנחיות המוסדי של מתקנים בעלי חיים של מדע המוח RIKEN המכון.
1. הכנת הדמיה צ'יימברס
<ol><li>
הדמיית חדר19
	<ol>
<li>באמצעות יריעות גומי סיליקון, להכין חדר עם עובי של 5 מ מ, רצפת לוחות בעוביים שונים. בנוסף, מכינים צלחות פטרי עם או בלי זכוכית תחתון (איור 1 א').</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מרווח פרוסה
	<ol>
<li>להכין את מפרידי להחזיק דגימות, באמצעות יריעות גומי סיליקון עם עובי של 0.5 מ מ (איור 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מעקב הזרקה
הערה: לבצע זריקות לתוך פונס (2.1) או רקתי עליון (2.2). זריקה לתוך הנוירונים הקרנה מוחי תת תווית פונס באזור המוח רחב כולל האזורים חזותי, מנוע, תוך הזרקה לתוך הנוירונים הקרנה מוחי תת תוויות רקתי עליון באזור החזותי. לניסויים שליטה, להזריק תמיסת. סאלין במקום כולירה fluorescently התווית על-ידי יחידת משנה של הרעלן B. לשם קיום תנאי סטרילי להשתמש בכפפות פלסטיק לנקות עם אתנול וציוד מעוקר.
<ol><li>
לעשות זריקות לתוך פונס של עכברים בוגרים.
	<ol>
<li>לצייר µL 1 של כולירה fluorescently התווית על-ידי יחידת משנה של הרעלן B (25 µg/µL ב- PBS) לתוך מזרק G המילטון 26.</li>
		<li>במקום משאבת מזרק על המזרק.</li>
		<li>מקם את המזרק ואת משאבת את הכלי המחזיק תחמן על מכשיר stereotaxic. להטות manipulator 12° posteriorly מן הציר האנכי.</li>
		<li>עזים ומתנגד זכר או נקבה בוגרת עכבר (C57BL/6J או Tlx3-cre/Ai9) על ידי הזרקת סודיום פנטוברביטל intraperitoneally (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או על ידי מתן איזופלוריין (2-3%). המתן עד העכבר הופך ללא תגובה כאשר זנבו הוא צבט עם מלקחיים, המציין כי העכבר הוא מורדם לחלוטין.</li>
		<li>הנח את העכבר על הכלי stereotaxic.</li>
		<li>הסר בזהירות את השיער בעזרת סכין גילוח כדי למנוע זיהום ולחתוך 10 מ מ של הקרקפת כך bregma ואת למדא גלויים. לנהל 0.1 מ"ל של לידוקאין 1% באמצעות פיפטה. לקבוע את הזווית של הראש על-ידי התאמת המיקום האנכי של פיו על הכלי stereotaxic כך bregma ואת למדא באותה הרמה-z.</li>
		<li>להתאים את המיקום של manipulator על-ידי הזזה על הכלי stereotaxic כך קצה המזרק הוא קרוב bregma ולהקליט את המיקום של manipulator. . משכי את המזרק על-ידי הזזת כלי המחזיק על manipulator</li>
		<li>להזיז manipulator 5.4 מ"מ posteriorly ו- 0.4 מ מ רוחבית. לקדם את המזרק כך הטיפ הוא קרוב נקודת הכניסה על הגולגולת. . משכי את המזרק ולסמן את נקודת הכניסה.</li>
		<li>במיקום המסומן, לקדוח חור בקוטר של-1 מ מ.</li>
		<li>הכנס קצה המזרק דרך החור כך העומק טיפ הוא 6.9 מ מ יותר מאשר זה נמדד ב- bregma.</li>
		<li>מזריקים µL 1 של המשדרים באמצעות המשאבה ב 0.2 µL/דקה.</li>
		<li>הסר את המזרק המוח.</li>
		<li>במידת הצורך, לכסות את המוח החשוף עם רסיסי microfibrillar עוצר דימום, דבק מיידית.</li>
		<li>לשטוף את המוח החשוף באמצעות תמיסת מלח הנכללת פיפטה כדי למנוע זיהום, תפר את הקרקפת.</li>
		<li>הסר את העכבר הכלי stereotaxic. לאפשר את העכבר כדי להתאושש מן ההרדמה באינקובטור ב 30 הלעפה תרוטרפמט, בדרך כלל עבור 1 h. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. להחזיר את העכבר מחברתם של חיות אחרות אחרי זה הוא החלים לחלוטין.</li>
		<li>לשמור על העכבר 3 – 7 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לעשות זריקות לתוך רקתי עליון של עכברים בוגרים.
	<ol>
<li>הכן על פיפטה מזכוכית בקוטר עצה של 30 עד 50 מיקרומטר.</li>
		<li>להתחבר על פיפטה מזכוכית מזרק המילטון דרך צינור פלסטיק (איור 2 א).</li>
		<li>למלא את פיפטה מזכוכית, צינור פלסטיק, המילטון מזרק עם הנוזל פרפין.</li>
		<li>במקום משאבת מזרק על המזרק.</li>
		<li>למקם את פיפטה מזכוכית manipulator ותטה manipulator 60° posteriorly מן הציר האנכי (איור 2B).</li>
		<li>לבצע 2.1.4–2.1.9. המיקום של manipulator הוא 1.4 מ מ אחורי, צדדי 0.5 מ מ ל למדא.</li>
		<li>במקום סרט פרפין פלסטיק קטן על הגולגולת ולאחר מכן לשים כ 1 µL של הפתרון מעקב על זה. במהירות לקדם את פיפטה מזכוכית ולמלא אותו לפחות 0.5 µL של הפתרון מעקב.</li>
		<li>הכנס את פיפטה מזכוכית כך העומק עצה היא 3.0 מ מ פני המוח.</li>
		<li>מזריקים µL 0.5 של המשדרים באמצעות המשאבה ב 0.2 µL/דקה.</li>
		<li>הסר את פיפטה מזכוכית של המוח.</li>
		<li>לבצע 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. קיבוע וגיזום
<ol><li>להזריק סודיום פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף) intraperitoneally לתוך עכבר (C57BL/6J או Tlx3-cre/Ai9, עם או בלי הזריקה מעקב כפי שמתואר בשלב 2. המתן עד העכבר הופך ללא תגובה כאשר זנבו הוא צבט עם מלקחיים, המציין כי העכבר הוא מורדם לחלוטין.</li>
	<li>המתת חסד העכבר בצורה אנושית על ידי פרפוזיה transcardially העכבר20 עם סליין 0.9%.</li>
	<li>לתקן את העכבר20 על-ידי פרפוזיה 4% paraformaldehyde (PFA) במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.5).</li>
	<li>
חותכים את הקרקפת בעזרת זוג מספריים כדי לחשוף את הגולגולת כפי שמתואר20.
	<ol>
<li>חותכים האמצע של הגולגולת החשופים בעזרת זוג מספריים. הסר את הגולגולת באמצעות מלקחיים.</li>
		<li>אם מסמנים את המיקום של bregma ולמבדה הינם הכרחיים, להסיר תחילה והזיז חצי אחד של הגולגולת. להכניס מחטים טונגסטן דק לתוך המוח-העמדות של bregma, למדה על הגולגולת שנותרו על המוח, ולאחר מכן הסר את הגולגולת הנותרים. הערה: המוח יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כדי לבצע נוגדן מכתים של נוירונים מעכבות, לחתוך את דגימות המוח לפרוסות.
	<ol>
<li>מניחים את הדגימה המוח על vibratome.</li>
		<li>חותכים פרוסות עד עבה ב- PBS בטמפרטורת החדר 500 מיקרומטר, המשך לצעד שלב 5 (שיטת e AbScal).</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם הנוגדן מכתים מיותרים, קישוט לדוגמה המוח כדי חוסמת (עד 3 מ מ עובי) בעזרת סכין גילוח (איור 3), לשלב 4 (שיטת SeeDB). הערה: המוח יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 ° C לאחר חיתוך או חיתוך. שיטת SeeDB עדיפה כאשר נוגדן מכתים אינה נחוצה מכיוון שהיא דורשת פחות זמן מאשר שיטת elAbSca.</li>
</ol>4. ניקוי ללא נוגדנים מכתים (שיטת SeeDB)
<ol><li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 20% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 40% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 60% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 80% (w/v) פרוקטוז, תקופת דגירה זה של 12 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 100% (w/v) פרוקטוז, תקופת דגירה זה של 12 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 80.2% פרוקטוז (w/w), תקופת דגירה זה של 24 שעות ייבוש עדין בטמפרטורת החדר. הערה: לטפל המדגם בקפידה כדי לשמור על העיוותים קטן ככל האפשר. לא דגירה דגימות יותר הצביעו, כמו דגימות במהירות יכול להיות אטום.</li>
	<li>להטביע את הדגימה תא ההדמיה מלא עם הפתרון פרוקטוז 80.2% (איור 1B). במידת הצורך, לתקן את הדגימה על ידי לשים חתיכות קטנות של דבק גומי מסביב. אם החדר הוא עמוק מדי, לשים צלחת קומה בבית הבליעה לפני הצבת את הדגימות.</li>
	<li>מניחים על צלחת פטרי עם כיסוי זכוכית על תא הדמיה ולשים מים המנה, ואת התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים. עירור אורכי גל ומסננים פליטה מתוארים בטבלה 1. אם יש צורך, להשתמש במה ממונע.</li>
</ol>5. ניקוי עם נוגדן מכתים (שיטת e AbScal)
<ol><li>להכין ריאגנטים כפי שמתואר בטבלה 2.</li>
	<li>להעביר את פרוסות בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של פתרון סרוק/eS0 ואת תקופת דגירה אותם של 12 שעות עם טלטול עדין ב 37 מעלות צלזיוס (איור 4B).</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eA2 ואני דגירה הפרוסות עבור h 36 ברעידות עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eB4 ואני דגירה הפרוסות במשך 24 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eA2 ואני דגירה הפרוסות במשך 12 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, דגירה הפרוסות במשך 6 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק 2 מ"ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה עם ראשי נוגדנים (טבלה 3) ב 1 מ"ל של AbScale פתרון עבור 48-72 h ב 37 מעלות צלזיוס (איור 4C) ברעידות עדין.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק מ ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה ב 4 מיליליטר AbScale פתרון 2 h 2 פעמים בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק 2 מ"ל בעזרת מרית.</li>
	<li>דגירה עם שכותרתו fluorescently משני נוגדנים (טבלה של חומרים, בטחונות) ב 1 מ"ל של AbScale פתרון עבור h 48-37 ° C עם טלטול עדין.</li>
	<li>בזהירות להסיר את פרוסות בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של הפתרון elAbSca, דגירה הפרוסות במשך 6 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של הפתרון elAbSca, דגירה את הפרוסות לקבלת 2 h 2 פעמים עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון מהצינור באמצעות פיפטה ולהוסיף 4 מ"ל של 4% PFA דגירה הפרוסות עבור h 1 ברעידות עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, דגירה הפרוסות עבור h 1 ברעידות עדין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של הפתרון סרוק/eS4, דגירה הפרוסות במשך 12 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.</li>
	<li>מקם את מרווח על משטח זכוכית מניחים את הפרוסות מרווח, לטבול את הפרוסות עם פתרון סרוק/eS4. חותם את מרווח עם כיסוי זכוכית (איור 1D).</li>
	<li>שים מים על חיפוי זכוכית ועל התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים. אם יש צורך, להשתמש במה ממונע. הערה: לבדוק החלקים עמוק של המדגם מסומנות באופן דומה לחלקים שטחית לאשר בהיעדר דעה קדומה תיוג משמעותית. הערה: חדירה של הנוגדנים שנבדקו מתוארת בטבלה3.</li>
</ol>6. תא בנחישות עמדה
<ol><li>לכל תפקיד של תמונות סרוקות, לחשב את ערכי המתאם באמצעות מסנן תלת ממדי התמונה14 (איור 5A-5D).</li>
	<li>לקבוע את העמדות של הפסגות של הערך קורלציה (איור 5D).</li>
	<li>לחקור תמונות סביב הפסגות כדי לאתר תאים (איור 5E).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462 (2015).</li><li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity.">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+Challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cortical+column:+a+structure+without+a+function.">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li><li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+cortical+column+would+that+be?.">Whose cortical column would that be?.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li><li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron.">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li><li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V.">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex.">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li><li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex.">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li><li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors.">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling.">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li><li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits.">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kim, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems.">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li><li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent.">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex,+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+(Ce3D).">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הוצגו הליכים כדי לקבל תמונות תלת-ממדיות בקנה מידה גדול של הארגון ייחודיים לסוג התא הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר, 5. לעומת ההכתמה פרוסה קונבנציונאלי, השיטה זו יותר שימושי לקביעת הארגון תלת מימדי של קליפת. השיטה מאפשרת ייבוא תמונות מ רחבה יותר, האזורים במוח עמוק יותר בהשוואה טיפוסי ...

קליפת בתרבית של מורכב של מספר רב של סוגי תאים, אחד עם דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, אלקטרופיזיולוגיות ומאפייני הביוכימי, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו 1,2 ,3,4,5,6,7. בין אם אלה סוגי תאים מאורגנים מבנים חוזרים ונשנים כבר לא ברור. קורטיקלית, כולל העמודות האוריינות החזותית וחביות המגע, יש לחזור על מבנים, אך הארגון הסלולר שלהם נשאר לא ברור8,9. אלה נמצאים אזורים קורטיקליים מסוימים והם אינם המערכת כולו במוח.
בשכבה neocortical 5, רובם המכריע של נוירונים מסווגים לארבעה סוגים עיקריים. סוג העיקריים של נוירונים סינאפסות, הקרנה מוחי תת הנוירונים, פרויקטים אקסונים אל המטרות subcortical לרבות פונס, חוט השדרה, רקתי עליון ומייצג, לכן, מסלול פלט קורטיקלית הגדולות10. הקרנה קורטיקלית הנוירונים, סוג מרכזי נוסף של הנוירונים סינאפסות, innervate קליפת10. נוירונים מעכבות גם להכיל שני מעמדות עיקריים: תאים parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין11.
ניתוחים אחרונים מציינים סוגי תאים ארבע מאורגנות מבנים חוזרים ונשנים12,13,14. הקרנה מוחי תת נוירונים12,13,14 והן נוירונים בקליפת המוח הקרנה14 לארגן סוג התא microcolumns ספציפיים בקוטר של 1-2 תאים. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין ישר במיוחד microcolumns של נוירונים הקרנה מוחי תת אבל לא עם microcolumns של נוירונים בקליפת המוח הקרנה14. Microcolumns את עצמם מעת לעת יתיישר טופס משושה סריג מערך14 , קיימים אזורים קורטיקליים מרובים כולל אזורים חזותי, המגע, מנוע12,מוח העכבר14 בשפה אזורי המוח האנושי13. נוירונים ב- microcolumn בודדים התערוכה פעילות מסונכרנת ויש תגובות החישה דומה14. מקרים אלה מצביעים על סוגי תאים בשכבה 5 לארגן לתוך מבנה סריג microcolumn המייצג הארגון ברחבי המוח הידוע הראשון של חוזרות מודולים פונקציונליים.
Microcolumns יש רדיוס של 10 מיקרומטר ויש על תקופתיות המרחבי כ-40 מיקרומטר. בנוסף, כיוון microcolumns הוא מקביל שלהם דנדריטים הפסגה, משתנה בהתאם למיקום שלהם ב- קליפת14. לכן, מערכת microcolumn קשה לנתח באמצעות פרוסות קורטיקלית קונבנציונאלי עם עובי טיפוסי של כמה עשרות מיקרומטר. בנוסף, הניתוח של תקופתיות דורשת נתונים תלת-ממדיים של מגוון רחב של אזורים במוח, ולכן אזור ההדמיה טיפוסי של מיקרוסקופיה קונפוקלית או ויוו הדמיה 2-פוטון הוא צר מדי.
לאחרונה פותחו טכניקות כדי לנקות רקמות בעובי15,16. כאן נתאר היישום של שיטות אלה כדי להשיג בקנה מידה גדול, תלת מימדי תמונות הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר 5 המרכיבים את המערכת microcolumn. הקרנת subcerebral נוירונים מסומנים על-ידי תיוג רטרוגרדית או הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת ב- Crym-egfp העכברים הטרנסגניים12, והקרנה קורטיקלית נוירונים מסומנים על-ידי גם הכוכבים תיוג או על-ידי הביטוי tdTomato ב Tlx3-cre-/Ai9-עכברים-17. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין מסומנות על ידי אימונוהיסטוכימיה. שיטה (נוגדן בקנה מידה S) AbScale18 משמש הנוגדן מכתים ניסויים, ואילו בשיטה SeeDB (ראה מוחי עמוק)19 משמש לניסויים אחרים. שיטות אלה להתגבר על הקשיים הנ של שיטות הדמיה קונבנציונאלי ולחשוף הארגון הסלולר מדויק של שכבה 514.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Crym-egfp transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>012003-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tlx3-cre transgenic mice</td>
			<td>MMRRC</td>
			<td>36547-UCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX #7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-01</td>
			<td>0.5 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-02</td>
			<td>1.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-611-05</td>
			<td>3.0 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C022241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C22842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 310</td>
			<td>Pons injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>KDS 100</td>
			<td>Superior colliculus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Toyo Associates</td>
			<td>HP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avitene microfibrillar hemostat</td>
			<td>Davol Inc</td>
			<td>1010090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alonalfa</td>
			<td>Daiichi-Sankyo</td>
			<td>Alonalpha A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>UVP</td>
			<td>HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Liquid, light</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26132-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Otsuka</td>
			<td>1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>26126-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td>Inter medical</td>
			<td>&#934;0.1 *L200 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-thioglycerol</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33709-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-) Fructose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>16315-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BluTack</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>CKBT-450000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td colspan="2">CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>COMS</td>
			<td>PT100C-50XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-492/SP-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-575/25-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-629/56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>D605/55m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL plastic tube</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>VIO-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tube</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35905-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyserol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>191612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(-)-sorbitol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-14735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo chemical industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Cyclodextrin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td>
			<td>Skin Essential Actives</td>
			<td>33996-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>13445-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35624-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-immersion long working distance objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTIP2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Statb2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD67</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GABA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Frontier Institute</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Somatostatin</td>
			<td>Peninsula Laboratories</td>
			<td>T-4103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fos</td>
			<td>CalbioChem</td>
			<td>PC38</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

קליפת בתרבית של מורכב של סוגים רבים של נוירונים סינאפסות, כל אחד עם מאפייני אלקטרופיזיולוגיות וביוכימי ספציפיים, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו , אבל שלהם basic אנטומי פונקציונלי הארגון של הסלולר לקנה המידה רשת ממעטים להבין. כאן נתאר שיטת ההדמיה תלת מימדי של נוירונים שכותרתו fluorescently על פני שטחים נרחבים של המוח לחקירה של הארגון סלולרי קורטיקלית. סוגי נוירונים ספציפיים מסומנים על ידי ההזרקה של פלורסנט המשדרים עצביים רטרוגרדית או ביטוי של חלבונים פלורסנט ב העכברים הטרנסגניים. בלוק המוח דגימות, למשל, האונה, המוכנים על קיבעון, עשה שקוף עם רקמת ניקוי שיטות, נתון פלורסנט immunolabeling של סוגי תאים מסוים. אזורים גדולים נסרקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים מצויד גדול לעבוד מרחק מטרות ושלבים ממונע. בשיטה זו ניתן לפתור הארגון תקופתי של המודולים פונקציונליים ייחודיים לסוג microcolumn תא בתוך קליפת העכבר. ההליך יכול להיות שימושי לצורך המחקר של אדריכלות סלולרית תלת מימדי אזורי מוח שונים וברקמות מורכבים אחרים.

אנו תווית נוירונים בקליפת המוח הקרנה באמצעות הביטוי של tdTomato ב Tlx3-creהעכברים הטרנסגניים /Ai9, דמיינו נוירונים הקרנה מוחי תת ידי הזרקת את רכיב המעקב רטרוגרדית CTB488 לתוך פונס. האונה השמאלית של המוח היה נתון לשיטת SeeDB וייסרק באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים מצויד זמן עוב?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex at JoVE.com

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  RIKEN Brain Science Institute. כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

Video: Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

הקלטה בקנה מידה גדול הרכבים העצבית עם בדיקות הסיליקון ב עכברוש הרדים

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

בקנה מידה גדול הקלטה של ​​הנוירונים על ידי בדיקות מטלטלין סיליקון מתנהג מכרסמים

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...