Этот метод позволяет манипулировать и количественно, как клетки организовать коллективно. Это важно, потому что мы можем моделировать шаблон в пробирке и disentangle сигналы плотно связаны in vivo. Техника требует минимального специального оборудования, что позволяет установить его в стандартной биологической лаборатории, и это количественно, что делает возможным открытие суб-визуальных событий шаблона.
Этот метод можно легко применить к любой клеточной системе, где может возникнуть закономерность, и обнаружить не случайные закономерности дифференциации, распространения и конкуренции ячеев. Основным методом является систематическая оптимизация параметров микропаттернирования для новых типов клеток. Например, размер и форма шаблона, тип матрицы и время ссадины клеток.
Надев перчатки, поместите кусок лабораторной пленки на дно 10-сантиметровой квадратной чашки Петри. Используйте 12-миллиметровый удар отверстия, чтобы сократить гидрофобные пластиковые слайды, чтобы создать 12-миллиметровую крышку скользит, и поместите крышку скользит в новой чашке Петри. Используйте пинцет, чтобы тщательно удалить защитную пленку из крышки скользит.
Поместите фотомышку на чистую и стабильную поверхность, хромированную сторону вверх и добавьте двухмиберную каплю двойной дистиллированной воды в положение желаемой конструкции чипа. Аккуратно нажмите крышку скольжения на падение и поместите держатель на верхней части пластиковых слайдов. Тщательно исправить этот бутерброд с зажимами для поддержания пластиковых частей в контакте с фотомойки.
Поместите сборку в ультрафиолетовую озоновую лампу примерно в двух сантиметрах от источника света для 10-минутного освещения. В конце периода освещения, схватить бутерброд с фото маской в нижней части и тщательно удалить зажимы при сохранении давления с одной стороны, чтобы предотвратить слайды от перемещения во время разборки бутерброда. Когда все зажимы будут удалены, снимите держатель, заботясь о том, чтобы все пластиковые кусочки все еще находятся на маске и не прилипли к держателю, и добавьте двойную дистиллированную воду к чипам, чтобы аккуратно отделить чипы от фотомойки.
Поместите фото-узорчатые чипы в матричную камеру осаждения, освещенную вверх, и добавьте 200 микролитров раствора покрытия на каждый чип. Затем добавьте трехсемейную чашку Петри, наполненную двойной дистиллированной водой, в камеру, чтобы ограничить испарение при четырех градусах Цельсия на ночь. Для посева эмбриональных клеток на чипы, мыть чипсы с двумя по крайней мере пять минут моет в свежем, стерильных PBS за стирку, прежде чем обойтись один раз десять пятых клеток в 200 микролитров соответствующей клеточной культуры среды на каждый чип.
Затем закройте посевную камеру. Инкубировать в течение одного часа, чтобы клетки придерживаться чипов. Когда клетки прикрепились, заполните колодцы многоярдовой пластины с 500 микролитров теплой среды на скважину, и использовать стерильные пинцеты для передачи чипов в отдельных колодцев пластины.
Встряхните пластину энергично, чтобы отделить любые неприемаемые клетки, и сразу же заменить супернатант со свежей, теплой среде. Затем проверьте под микроскопом, чтобы наблюдать, является ли узор виден. Через 48 часов после их покрытия, клетки должны образовывать плотные колонии, которые строго следуют форме узоров.
Оставляя чипы в тарелке, удалите все, кроме достаточно среды, чтобы предотвратить высыхание микросхем, и добавьте не менее 500 микролитров параформальдегида или раствора фиксации на основе PFA на колодец. Через десять минут, кратко мыть скважины три раза с стиральным раствором, а затем один мыть с 50-миллимолярия хлорида аммония разбавленной в стиральном растворе, чтобы утолить остаточные PFA перекрестной активности. После последней стирки обработать образцы блокирующим раствором не менее 30 минут.
Для иммуностея чип культур, передать чипы в окрашивание камеры стороны вверх, и сразу же добавить 100 микролитров первичного раствора антитела интерес для каждого чипа. После одного часа на вращающейся платформе при комнатной температуре, мыть чипы три раза с стиральным раствором, как попродемонстрировано, и инкубировать чипы с соответствующими вторичными антителами в течение одного часа на вращающейся платформе. В конце вторичной инкубации антител трижды вымойте стружку в стиральном растворе и смонтировать чип на слайде микроскопии с 20 микролитров любой стандартной монтажной среды.
Чтобы изображение чипов, сначала настроить скорость сканирования, разрешение изображения, усреднение кадров, и детектор выгоды для определения оптимального между качеством изображения и время изображения. Затем приобрети изображения каждого чипа. Когда все изображения были приобретены, установить и запустить PickCells после документации, доступной в Интернете, создать новый эксперимент, и импортировать изображения в программу.
Используйте модуль Nessys для сегментации ядер на основе сигнала ядерного конверта. Используйте базовый модуль сегментации для определения сигнала автофлуоресценции шаблона. Затем нажмите Finish "и ждать, пока все изображения будут обработаны.
Для создания объектов ядер и вычисления основных объектов запустите модуль Intrinsic Features из панели задач и закройте панели Ellipsoid Fitter и Surface Extractor, чтобы держать открытыми только панель Basic Features. Выберите ядро "в качестве типа объекта и выберите предоставленную приставку, предоставленную для сегментированных изображений. Затем нажмите Compute "и ждать, пока все изображения будут обработаны.
На данном этапе дополнительные функции должны быть записаны в ядра перед экспортом данных для нашего анализа. Например, для хранения имени изображения каждое ядро принадлежит как атрибут ядра, нажмите Data"и New Attribute "и выберите ядро" в всплывающем диалоге. Нажмите OK "выберите сбор данных из других объектов, подключенных к узел" и нажмите Next "В левой панели, выберите изображение" и дважды нажмите на знак допроса, чтобы установить узел изображения в качестве мишени пути.
Расширьте панель операции по сокращению и выберите Get One"Expand the Available Attribute pane и выберите атрибут Name. Затем нажмите Изменение "и Далее" Введите имя изображения, нажмите клавишу Tab, и нажмите Закончить "Тогда экспортировать данные в файл, разделенный вкладкой значения. Для нашего анализа цикл экспортируемых данных в папку данных папки R-Script.
Откройте нашу студию" и откройте шаблон binned map R-Script"Затем установите рабочий каталог на местоположение файла источника и запустите скрипт для создания карт плотности. Через час после посева клеток, индивидуальная культура клеток pattens не может быть полностью стечены, как клетки размножаются с течением времени. Тем не менее, модели станут полностью колонизированы лишь очень немногими клетками за пределами клеевых поверхностей.
Шаблонирование, которое не проясняться до двух часов после посева, указывает на сбой процедуры. Пространственное заточение эмбриональных стволовых клеток мыши на больших дисках или кольцевых микропаттернах направляет узор поднаселения клеток, выражающие мезодермальный маркер брахиури. Например, когда эмбриональные стволовые клетки мыши выращиваются на микропаттернах с большим диском, брахиури-положительные клетки преимущественно ограничены периферией модели, где плотность местных клеток является самой низкой.
Эта закономерность подтверждается картой интенсивности мозга-брахиури. Эти данные свидетельствуют о том, что метод может выявить подвидную информацию, поскольку проверка одной колонии не достаточна для выявления какой-либо формы пространственной организации в маркере выражения интереса. Это, в частности, объясняется важной изменчивостью от колонии к колонии.
Техника также показывает, что не существует обнаруживаемого шаблона для ингибитора ДНК-связывающего, который может указывать на то, что Т-паттернирование не обусловлено костным морфогенетическим белком, сигнализирующим в этом контексте. Всегда помните, какая сторона крышки скольжения устранены и покрыты, а также убедитесь, что клетки должным образом придерживались перед смыванием лишних клеток. Этот метод позволяет изучать экологические сигналы, важные для руководства самоорганизации клеток, а также может информировать математические модели, которые помогают нам лучше под рудиментальной картины.
