שיטה זו יכולה לעזור לייצר כמויות גדולות של RNAs רקומביננטי של עניין עבור יישום במחקר או בתעשייה. היתרון העיקרי הוא כי RNA רקומביננטי מיוצר Escherichia coli בתהליך זול שניתן לשנות בקלות. חשוב לציין, RNA מיוצר על פיגום RNA עגול, אשר מאפשר טיהור הומוגניות.
בניגוד לדנ"א או חלבונים, RNAs של עניין אינם מיוצרים בקלות בכמויות גדולות במערכות biofactory, כגון תרבות קולי Escherichia. השיטה שלנו מבוססת על ביטוי משותף של RNA של עניין מוכנס לתוך פיגום מעגלי יציב מאוד החלת ליגזה המתווה RNA חזור. פיגום ה-RNA המעגלי נובע מווירואיד המוגן בפטנט.
Viroids הם קטנים יחסית, לא סליל, RNAs מעגלי מאוד בסיס זיווג כי הם זיהומיות כמה צמחים גבוהים יותר. אנחנו יכולים לייצר עשרות מיליגרם של RNA רקומביננטי לליטר של תרבות חיידקית בתנאי מעבדה רגילים. כדי להתחיל בהליך זה, הגבר את ה- cDNA על-ידי PCR כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, להוסיף 100 ננוגרם של pLELVd-BZB פלסמיד לצינור 0.5 מיליליטר. הוסף 10 U מסוג IIS הגבלת אנזים BpiI ומספיק חיץ G כדי ליצור תגובה 20 microliter. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לעכל את הפלסמיד.
לאחר מכן, להפריד את PCR ומוצרי עיכול על ידי אלקטרופורזה ב 1 אחוז ג'ל אגרוז במאגר TAE. הכתם את הג'ל על ידי טלטולו ב 200 מיליליטר אתידיום ברומיד בריכוז של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר. באמצעות טרנסילומינטור UV, לדמיין את ה-DNA.
השתמש באזמל כדי לחתוך את הרצועות המתאימות cDNA מוגברת ואת פלסמיד מתעכל BpiI. באמצעות עמודי ג'ל סיליקה, יש לחמק מ- DNAs מרסיסי הג'ל. לכמת את ריכוז הדנ"א על ידי ניתוח ספקטרופוטומטרי.
הגדר תגובת הרכבה גיבסון באמצעות cDNA מוגברת ואת פלסמיד מתעכל. דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, השתמש בעמודת ג'ל סיליקה כדי לטהר את התגובה.
לאחר electroporating מוסמך E.coli DH5-אלפא תאים, לבחור כמה מושבות לבנות ולהעביר אותם למדיום נוזלי LB. לגדל את המושבות לילה ב37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בערכת miniprep כדי לטהר את הפלסמידים, ולנתח את גודלם על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז באחוז אחד במאגר TAE.
ראשית, משותף electroporate זן E.coli שנבחר עם נגזרת pLELVd-BZB המכיל את cDNA המתאים RNA של עניין ואת P15LTRNISM פלסמיד לבטא במשותף את ליגאז tRNA חצילים. מעבירים מדיום נוזלי SOC לתוך cuvette אלקטרופורציה כדי לשחזר את התאים, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, צלחת החיידקים על מדיום מוצק LB המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, ו 34 מיקרוגרם לכלוראמפניקול מיליליטר.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להוסיף 250 מיליליטר של מדיום TB נוזלי, המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, ו 34 מיקרוגרם לכלוראמפניקול מיליליטר, לבקבוק ארלנמאייר מבולבל ליטר אחד. אחזר את הדגירה E.Coli, ולאחר מכן לבחור מושבה לחסן את המדיום בבקבוקון.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות נמרצות ב 180 סל"ד במשך 12 עד 16 שעות לפני קצירת החיידקים. יוצקים את תרבות E.Coli שנקטפה לתוך בקבוק צנטריפוגה 250 מיליליטר ולסובב את התאים ב 14, 000 G במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים ב-30 מיליליטר מים.
העבר השעיה זו לצינור צנטריפוגה, ולסובב את התאים שוב באמצעות התנאים הקודמים. השלך את העל-טבעי והוסף 10 מיליליטר של מאגר כרומטוגרפיה לכדור התא. מערבולת כדי להשתמש מחדש בתאים במאגר.
הוסף נפח אחד של פנול:כלורופורם ומערבולת במרץ כדי לשבור את התאים. ואז, צנטריפוגה ב 12, 000 G במשך 10 דקות. לשחזר את השלב הממיקי, להוסיף נפח אחד של כלורופורם, ומערבולת במרץ.
צנטריפוגה ב 12, 000 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, לסנן את הכנת RNA באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 45. לטהר את ה-RNA באמצעות עמודת אמין דיתיל אתנול מיליליטר אחד מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית.
התאם את קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה, וצייד את העמודה ב- 10 מיליליטר של מאגר כרומטוגרפיה. לאחר מכן, לטעון את המדגם ולשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של מאגר כרומטוגרפיה. אלוט RNA עם 20 מיליליטר של חיץ אלוטיון, ולאסוף aliquots מיליליטר אחד.
באמצעות אלקטרופורזה דו מימדית של ג'ל פוליאקרילמיד, הפרד את ה- RNAs המעגליים מעמיתיהם הליניאריים. ראשית, להכין חמישה אחוזים פוליאקרילמיד ג'ל במאגר TBE ומכיל שמונה אוריאה טוחנת כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מערבבים 20 מיקרוליטרים של תכשירי ה-RNA עם נפח אחד של מאגר טעינה.
דגירה ב 95 מעלות צלזיוס בבלוק חימום במשך 1.5 דקות, ולאחר מכן הצמד להתקרר על קרח. טוענים את הדגימות בג'ל פוליאקרילמיד ו מפעילים את האלקטרופורזה בתנאים המתאימים למימד הג'ל. לאחר מכן, להכתים את הג'ל ב 0.5 מיקרוגרם למיליליטר אתידיום ברומיד במשך 15 דקות.
לשטוף את הג'ל המוכתם במים, ולאחר מכן לדמיין את RNA תחת אור UV. ניתוח אלקטרופורטי של מספר פלסמידים רקומביננטיים שבהם מוכנסים cDNAs שונים להראות הגירות שונות בהשוואה pLELVd-BZB. שים לב כי pLELVd-BZB מכיל את סמן lacZ, אשר מוחלף על ידי cDNA המתאים RNA של עניין, כך בעוד ההעברה תלויה בגודל של cDNA שנוספה, פלסמיד רקומביננטי בדרך כלל להעביר מהר יותר מאשר פלסמיד הבקרה.
הייצור של RNA רקומביננטי בתרבויות חיידקים co-electroporated מנוטר על ידי שבירת התאים וניתוח RNA על ידי denaturing PAGE. ניתן לראות להקות חזקות, התואמות לצורות ELVD ריקות ו- ELVD כימריות, שבהן הוכנסו RNAs שונים של עניין. מעניין, חלק גדול של RNA רקומביננטי נתפס כצורה מעגלית.
המעגליות של השבר העיקרי נצפתה באמצעות שילוב של שני PAGEs בתנאים denaturing בעוצמה יונית גבוהה ונמוכה. הכנת RNA ניתן לטהר עוד יותר על ידי כרומטוגרפיה חילופי אניון. כפי שניתן לראות כאן, E.Coli RNA נשמר ביעילות בעוצמה יונית נמוכה, ולאחר מכן eluted בעוצמה יונית גבוהה, עם רוב RNA נאסף בשברים 2 ו -3.
RNA רקומביננטי ניתן לטהר עוד יותר הומופוביות על ידי אלקטרופורזה דו-מיתית. פרוטוקול זה מאפשר ייצור קל של כמויות גדולות של RNA רקומביננטי ב Escherichia coli וטיהור הומוגניות הודות המעגליות של המוצר הסופי. זכור כי RNA של תוצאות עניין מוטבע לתוך פיגום RNA עגול נגזר וירווידי צמח.
אם ברצונך להפריד בין שני moieties, אתה צריך להשתמש באסטרטגיה סטנדרטית, כגון ריבוזים, DNAzymes, או RNase H.The התשואה של פרוטוקול זה תלוי RNA מסוים של עניין, כמו RNAs קטנים צפויים להיות מיוצרים בכמויות גבוהות יותר מאשר גדולים יותר. לביטויים בקנה מידה גדול יותר, יש לקחת בחשבון כי הזמן האופטימלי לקצור חיידקים תלוי בגורמים רבים, כולל זן E.Coli, מדיום תרבות, ותנאי גידול. אנו ממליצים על בדיקה ראשונית של קורס זמן כדי למצוא את חלון הייצור האופטימלי בתנאים הספציפיים שלך.
זכור כי RNAs רקומביננטי לצבור בתאי חיידקים באופן חולף, כי הם נעלמים לחלוטין בשלב מאוחר גדל.
