Este método pode ajudar a produzir grandes quantidades de RNAs recombinantes de interesse para aplicação em pesquisa ou indústria. A principal vantagem é que o RNA recombinante é produzido em Escherichia coli em um processo barato que pode ser facilmente ampliado. É importante ressaltar que o RNA é produzido em um andaime circular de RNA, o que facilita a purificação da homogeneidade.
Em contraste com o DNA ou proteínas, as RNAs de interesse não são facilmente produzidas em grandes quantidades em sistemas biofatoriais, como uma cultura Escherichia coli. Nosso método baseia-se na co-expressão do RNA de interesse inserido em um andaime circular altamente estável e na aplicação de um ligase que media a circularização do RNA. O andaime RNA circular deriva de um viróide patenteado.
Viróides são relativamente pequenos, não-enrolados, rnas circulares altamente emparelhadas com base que são infecciosos para algumas plantas mais altas. Podemos produzir dezenas de miligramas do RNA recombinante por litro de cultura bacteriana em condições de laboratório regulares. Para iniciar este procedimento, amplie o cDNA por PCR conforme descrito no protocolo de texto.
Em seguida, adicione 100 nanogramas do pLELVd-BZB plasmídeo a um tubo de 0,5 mililitro. Adicione 10 U da enzima de restrição IIS tipo BpiI e o suficiente de buffer G para criar uma reação de 20 microliter. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora para digerir o plasmídeo.
Depois disso, separe os produtos PCR e digestão por eletroforese em um gel de 1% de agarose no buffer TAE. Manche o gel sacudindo-o em 200 mililitros brometo de etídio a uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro. Usando um transilluminador UV, visualize o DNA.
Use um bisturi para cortar as bandas correspondentes ao cDNA amplificado e ao plasmídeo digerido BpiI. Usando colunas de gel de sílica, elute os DNAs dos fragmentos de gel. Quantifique a concentração do DNA por análise espectrofotométrica.
Configure uma reação gibson assembly usando o cDNA amplificado e o plasmídeo digerido. Incubar a 50 graus Celsius por uma hora. Em seguida, use uma coluna de gel de sílica para purificar a reação.
Depois de eletroporar células E.coli DH5-Alpha competentes, escolha várias colônias brancas e transfira-as para o meio LB líquido. Cresça as colônias durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, use um kit miniprep para purificar os plasmídeos, e analise seus tamanhos por eletroforese em um gel de 1% de agarose no buffer TAE.
Primeiro, co-eletroporar a cepa E.coli selecionada com o derivado pLELVd-BZB que contém o cDNA correspondente ao RNA de interesse e o plasmídeo P15LTRNISM para co-expressar a liga ligase de tRNA de berinjela. Transfira o meio líquido SOC para a cuvette de eletroporação para recuperar as células, e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, aborrece as bactérias em meio sólido LB contendo 50 microgramas por ampicillina mililitro, e 34 microgramas por niólito clorofenicol.
Incubar a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione 250 mililitros de meio líquido de TB, contendo 50 microgramas por ampicillina mililitro, e 34 microgramas por clororamfenicol mililitro, a um frasco de um litro confundido erlenmeyer. Recupere o E.Coli incubado, e então escolha uma colônia e inocula o meio no frasco.
Incubar a 37 graus Celsius com agitação vigorosa a 180 RPM por 12 a 16 horas antes de colher a bactéria. Despeje a cultura E.Coli colhida em uma garrafa de centrífugas de 250 mililitros e gire as células a 14.000 G por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células em 30 mililitros de água.
Transfira esta suspensão para um tubo de centrífuga e gire as células novamente usando as condições anteriores. Descarte o supernatante e adicione 10 mililitros de tampão de cromatografia à pelota celular. Vórtice para resuspensar as células no buffer.
Adicione um volume de fenol:clorofórmio e vórtice vigorosamente para quebrar as células. Então, centrífuga a 12.000 G por 10 minutos. Recupere a fase aquosa, adicione um volume de clorofórmio e vórtice vigorosamente.
Centrífuga a 12.000 G por 10 minutos. Depois disso, filtre a preparação do RNA através de um filtro de seringa de 45 micrômetros. Purifique o RNA usando uma coluna de amina de etanol dietil de um mililitro conectada a um sistema de cromatografia líquida.
Ajuste a taxa de fluxo para um mililitro por minuto e equilibre a coluna com 10 mililitros de tampão de cromatografia. Em seguida, carregue a amostra e lave a coluna com 10 mililitros de tampão cromatógrafo. Elute o RNA com 20 mililitros de tampão de elução, e colete uma alíquota mililitro.
Utilizando eletroforese de gel de poliacrilamida bidimensional, separe as RNAs circulares de suas contrapartes lineares. Primeiro, prepare um gel de poliacrilamida de 5% no tampão TBE e contendo oito ureia molar, conforme descrito no protocolo de texto. Misture 20 microliters das preparações de RNA com um volume de tampão de carga.
Incubar a 95 graus Celsius em um bloco de aquecimento por 1,5 minutos e, em seguida, esfriar no gelo. Carregue as amostras no gel de poliacrilamida e execute a eletroforese nas condições adequadas para a dimensão do gel. Depois disso, manche o gel em 0,5 micrograma por brometo de etídio mililitro por 15 minutos.
Lave o gel manchado com água e, em seguida, visualize o RNA sob luz UV. A análise eletroforética de vários plasmídeos recombinantes nos quais diferentes cDNAs são inseridos mostram migrações diferentes quando comparadas com pLELVd-BZB. Observe que pLELVd-BZB contém o marcador lacZ, que é substituído pelo cDNA correspondente ao RNA de interesse, portanto, enquanto a migração depende do tamanho do cDNA inserido, os plasmídeos recombinantes geralmente migrarão mais rápido do que o plasmídeo de controle.
A produção do RNA recombinante em culturas bacterianas co-eletroporadas é monitorada pela quebra das células e pela análise do RNA por meio da desnaturação PAGE. Podem ser vistas bandas fortes, que correspondem a formas elvd vazias e quimricas de ELVd, nas quais diferentes RNAs de interesse foram inseridas. Curiosamente, uma grande fração do RNA recombinante é vista como uma forma circular.
A circularidade da fração principal é observada usando uma combinação de dois PAGEs em condições de desnaturação com alta e baixa resistência iônica. A preparação do RNA pode ser purificada por cromatografia de troca de ânion. Como visto aqui, o RNA E.Coli é eficientemente retido com baixa resistência iônica, e posteriormente elucido com alta resistência iônica, com a maior parte do RNA sendo coletado nas frações dois e três.
O RNA recombinante pode ser purificado ainda mais para a homogeneidade por eletroforese 2D. Este protocolo permite a fácil produção de grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli e purificação à homogeneidade graças à circularidade do produto final. Lembre-se que o RNA de juros resulta embutido em um andaime circular de RNA derivado de um viróide vegetal.
Se você deseja separar ambas as moieties, você precisa usar uma estratégia padrão, como ribozymes, DNAzymes ou RNase H.O rendimento deste protocolo depende do RNA particular de interesse, já que pequenos RNAs provavelmente serão produzidos em quantidades maiores do que as maiores. Para expressões de maior escala, leve em consideração que o tempo ideal para colher bactérias depende de muitos fatores, incluindo a cepa E.Coli, o meio cultural e as condições de crescimento. Recomendamos um ensaio preliminar de curso de tempo para encontrar a janela de produção ideal em suas condições particulares.
Lembre-se que as RNAs recombinantes se acumulam em células bacterianas transitoriamente, e que elas desaparecem completamente na fase de crescimento tardio.
