שיטה זו יכולה להיות שימושית כדי לענות על שאלות מפתח בתחומים נוירוביולוגיים כגון כיצד מסופי presynaptic לתפקד vivo. היתרון העיקרי של קבוצה זו של טכניקות הוא שאנו מראים גישות משלימות כדי התחת את הפונקציה של מסלולי חוש הריח באמצעות ראשיף קסנופוס כמודל בעלי חיים. הדגמת הליך זה יהיה אני, ביאטריס טרני, ופאולו Pacciolla.
התחל את הליך ההמרה על-ידי הרטבת שתי חתיכות נייר סינון איכותי תאית ב- 0.02%MS2 22 פתרון הרדמה והצבתן תחת היקף הניתוח. ואז לבחור ראשן מהטנק ולטבול אותו בצלחת של פתרון הרדמה. ראשן צריך להפסיק לשחות בתוך שתיים עד ארבע דקות.
בדוק הרדמה נכונה על ידי היעדר תגובה לגירויים מכניים המוחלים ברמת הזנב באמצעות פינצטה. מקם את ראשן הרדמה על נייר הסינון מתחת לטווח. מקם את החיה עם הצד הגבי שלה פונה כלפי מעלה כך מבני המוח ניתן לדמיין.
לניסויים התנהגותיים, השתמש במספריים של Veni כדי לשנות את שני העצבים כדי לדכא את כל המידע הריחני המגיע לנורה חוש הריח. לטעון פיפטה זכוכית poled עם שני microliters של סידן ירוק אחד פתרון דקסטרין, ולמקם אותו microinjector. מניחים ראשן הרדמה מתחת למיקרוסקופ המפעער על נייר המסנן, ואז מעבירים את קצה הפיפט לחלל העיקרי של קפסולת האף, ומספקים 0.15 עד 0.3 מיקרוליטרים של הצבע.
השאירו את ראשן במקום למשך 2-3 דקות. באמצעות פיפטה פסטר, לטפטף 0.02%MS2 22 פתרון על החלקים פדל יותר של החיה, כדי למנוע ייבוש. להעביר את החיה למיכל ההתאוששות שבו ראשן צריך לשחזר שחייה רגילה בתוך 10 דקות בערך.
שימו לב לפרחים ברמה של השכבה הגלומרולרית של נורת הריח ביום שלאחר ההזרקה. הכינו ראשן הרדמה להדמיה על ידי הסרת העור תחילה מעל נורת הריח. השתמש מספריים Veni לעשות חתך בצד השני על העור של ראשן בקצה מערכת העצבים המרכזית ברמה של נורת הריח.
הימנע מהרחבת החתך לתקטום, אשר ניתן לזהות בקלות על ידי המיקום של עצב הראייה. שמור על החיה לחה על ידי החלת טיפות של 0.02% MS2 22 פתרון באמצעות פיפטה פסטר ואז לצבוט את העור לחתוך באמצעות פינצטה ולמשוך אותו מעל מערכת העצבים. ודא הסרה מוצלחת על ידי היעדר מלנוציטים מעל נורת הריח.
מניחים את ראשן לתוך הבאר של צלחת מצופה שומר התא. מקם כיסוי זכוכית להחליק מצופה שומן ואקום גבוה כדי לכסות את החלק העליון של tectum עד סוף הזנב. ודאו שנורה חוש הריח ופלקודים נשארים חשופים למדיום החוץ-תאי.
מלאו את צלחת הפיטרי בתספורת של קסנופוס רינגר המכילה 100 טובוקורן מיקרומולרי למניעת התכווצויות שרירים. מניחים את המנה מחזיקה את ראשן תחת מיקרוסקופ זקוף. חבר את המאגר המכיל את הפתרון של קסנופוס רינגר עם המנה באמצעות צינורות פוליאתילן לשפע מתמשך של הפתרון של קסנופוס רינגר.
תתחילו להתריע על הפתרון של קסנופוס רינגר. לשמור על רמת הפתרון קבוע המנה לאורך כל הניסוי. להעריך ברציפות את הכדאיות ראשן על ידי התבוננות במחזור הדם דרך כלי הדם.
התחל הדמיה חיה באמצעות מטרת הגדלה נמוכה כדי לדמיין את ראשן. להזיז את ציר micromanipulator למקם את נימי אספקת פתרון ריח על החלק העליון של כמוסה אחת האף, ויוצרים זווית 90 מעלות עם עצב הריח. מצא את נורת הריח הממוקם ipsilaterally לקפסולה האף.
עבור למטרה של מי הגדלה גבוהה עם מרחק עבודה ארוך. בדוק את פליטת florescence על ידי מבנים I.Glomerular צריך להיות ברור. התחל על ידי צינורות 20 מיליליטר של פתרון חומצות אמינו טריות לתוך מאגר מוגבה.
לאחר מכן קחו שישה ראשנים מקופחים ממזון ממיכל הדיור שלהם, והצבו אותם בשני ליטרים של מי ראשן נקיים כדי למזער את החשיפה לריחות. מניחים מנה שש באר שונה על טרנסילומינטור LED לבן. ממלאים כל באר ב-10 מיליליטר של מי ראשן.
מניחים ראשן אחד לבא, ואז משאירים לנוח לפחות שלוש דקות. התחל רכישת תמונות ורכוש סרטים המכילים תקופות בסיס, גירוי והתאוששות. תגובה אטרקטיבית ניתן לזהות כתנועה לכיוון הזרבובית לספק את הפתרון של חומצות אמינו.
החזירו בעלי חיים למיכל שלהם לאחר ההדמיה. מעקב אחר עמדות ראש ראש ראש בתוך שטח של 35 מילימטרים על ידי 35 מילימטרים, או גודל שווה ערך בפיקסלים, מאפשר ניתוח כמותי של התנהגות מונחית חוש הריח. הקו המקווקו מייצג את האזור הפרוקסימלי להיכנס לתסרון הריח.
חלקות בודדות של תנועות ראשן בנויות באמצעות קואורדינטות X Y המתקבלות על ידי ניתוח תמונה. עלילות תנועתיות שחולצו חייבות לשחזר בנאמנות תמונות וידאו. אזור עניין של רדיוס של 8.75 מילימטר שבמרכזו מפרצון הפתרון משמש לסיווג קרבתם של בעלי החיים למקור הריח.
זמן נוסף שבילה בקרבת הזרבובית של הריח מצביע על טרופוליזם חיובי. הזמן שבילו ראשנים ליד הזרבובית בתקופות מוגדרות, למשל, מרווחים של 15 שניות, מאפשר זיהוי של היכולת לזהות פתרונות חומצות אמינו. את ההתנהגות הכוללת של אוכלוסיית ראשנים ניתן להשיג על ידי התוויית התפלגות של נתונים בודדים.
טרופוליזם חיובי ניתן לזהות כאשר פתרון חומצת אמינו מוכן במילימולר אחד או 160 micromolar. בעלי חיים אינם מגיבים ליישום המים. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו טכניקות היסטולוגיות או אלקטרופיזיולוגיה, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות כמו שינוי של תכונות סינפטיות לאחר פציעה.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את העיבוד של מידע חוש הריח ראשן קסנופוס.
