עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY019312 מענקים וEY021126 (VJK), EY002687 למחלקת העיניים ומדעים חזותיים באוניברסיטת וושינגטון, ועל ידי מחקר למניעת עיוורון.

כל פרוטוקולי הניסוי היו בהתאם המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים המחקרים המוסדית באוניברסיטת וושינגטון. 1. הגדרה מחזיק זלוף והדגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לזלוף הרשתית טרי ביום של הניסוי. השתמש במים מזוקקים וללא יונים. השתמש באחד משלושת הפתרונות הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יקרבונט המכיל &#39;הפתרון (1 ליטר): 1 בקבוק איימס&#39; איימס התקשורת ו1.9 גרם של NaHCO 3, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של לוק (מ&quot;מ): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 10.0 HEPES, 20.0 3 NaHCO, 3.0 Na succinate, 0.5 גלוטמט Na, 0.02 EDTA, ו10.0 גלוקוז, ויטמיני ממ 0.1% ואמין חומצות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון HEPES שנאגר להכין רינגר (מ&quot;מ): 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 MgCl 2, 1.0 CaCl 2, 10.0 גלוקוז, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pHמותאם ל7.5 עם ~ 5.8 מיליליטר של 1 M NaOH, להוסיף L-15 0.72 גר &#39;/ בינוני תרבות L ליבוביץ. השתמש 20-50 מיקרומטר DL-AP4 ו50-100 מיקרומטר BaCl 2 לבודד את תגובת קולטי האור בכל מדיה זלוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לאלקטרודות 28 (מ&quot;מ): 140.0 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 3 HEPES, 0.01 EDTA ולהתאים את ה- pH ל7.4-7.5 עם NaOH. פתרון אלקטרודה ניתן לאחסן ב RT במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ולבדוק את בעל הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק נייר שחור / אפור מסנן על גבי הכיפות של חלק התחתון של בעל הדגימה (ראה איור 1 א). מורחים דבק אפוקסי 5 דקות שני מרכיבים בזהירות מסביב לקצוות של צמרות שטוחות של הכיפות. אם יש צורך, לעשות את זה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהדבק הוא (כ -4 דקות) כמעט יבשות ולחץ על נייר הסינון על הכיפות באמצעות פריט שטוח. נייר סינון דבק לפחות יום אחד לפני הניסוי.נייר סינון ניתן להשתמש מספר פעמים אבל יש להחליף אחרי חודש של הקלטות. השתמש 70% אתנול לנקות כיפות בזהירות מכל שאריות דבק לפני התקנת נייר ההחלפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את ערוצי אלקטרודה עם פתרון אלקטרודה מנסה להימנע מכל בועות אוויר ולדפוק אלקטרודות גלולה סגורות עם מתאם הברגה לערוצי אלקטרודה (ראה איורים 1 א &#39;וב&#39;). חבר את החתיכות העליונה ותחתונים של בעל הדגימה עם ארבעה ברגים ולמלא את שורות זלוף עם פתרון אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ההתנגדות ומתח בין המוביל של כל זוג האלקטרודה באמצעות מודד (איור 1). התנגדות צריכה להיות מתחת ל -100 Ωk והמתח מתחת ל -10 mV אם הערוצים ללא בועה ואלקטרודות נמצאות במצב טוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 400-700 מיליליטר של תקשורת זלוף בבקבוק הזכוכית. נפרד עוד 300 מיליליטר לשימוש בנתיחה של הרשתית ושלקרע אותו במקרר. הגדר את צינורות טפטוף בבלוק מחליף חום ולמקם את הבלוק שחומם מראש על צלחת החימום (ראה איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את הבקבוק עם מכסה שיש לו קשרים ל- CO 2 / O 2 גז (אם לוק של איימס &quot;או משמש) ולצינורות טפטוף (ראה איור 1D). מחממים את הבקבוק עם התקשורת עד 37 מעלות צלסיוס ולמקם אותו על צלחת החימום או על החלק העליון של יחידת גירוי האור באמבט מים מוגדר 37 - C 39 O 17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש קווי זלוף על ידי מילוי אותם עם תקשורת זלוף ליזום הזרימה מונעת כוח המשיכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת LKC, הנח את הבקבוק בחלק העליון של יחידת ממריץ 17 כדי לספק זרימה הכבידתית משמעותית שמותאמת לאחר מכן על ידי רגולטורי זרימת שיעור בלי שהושפע מרמת ההפחתה של פתרון זלוף בבקבוק במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת Ocuscience, למקם את pבקבוק erfusion בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש ואת מקום קווי פלט זלוף ארוך מבעל הדגימה (ראה שלב 2.8) הרבה מתחת לרמתו של בעל הדגימה (ובקבוק זלוף) כדי להגדיל את כונן הכבידה של הפתרון. להגן על קווי פלט אלה ולחבר את המגן לקרקע של המגבר כדי למנוע צימוד של רעש האלקטרומגנטים לאות ERG. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את זלוף - 3 5 מיליליטר / דקה באמצעות רגולטורי ספיקה. חבר 2/95% גז 5% CO 2 O מגליל עם רגולטור נכון ולהתאים את קצב הזרימה על מנת להבטיח מבעבע קבועה של התקשורת בבקבוק באמצעות אבן אוויר. </li></ol> הכנת 2. דוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מכשירי נתיחה נקיים וחדים כולל microscissors ישר-להב, אחד או שתיים 45 o פינצטה, סכין גילוח ופיסת נייר סינון מלבני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ -200 מיליליטר של perfu הקרפתרון שיאון בצלחת פטרי גדולה כל כך שכל החלק התחתון של בעל הדגימה (כולל כיפות) יכול להיות שקוע בפתרון. צעד זה הופך להיות חשוב כאשר ההרכבה הרשתית על הכיפות (ראה שלב 2.6). למרות כמה פתרונות נועדו להיות רווי בcarbogen (5% CO 2/95% O 2), זה לא חיוני לצורך הנתיחה ולא נעשה בניסויים שתוארו כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסוי טיפוסי, לשמור על בעלי חיים ב12/12 שעות אפלים מחזור האור / וכהה להתאימם ל6-12 שעות לפני ההקלטות. להרדים את החיה משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם תחת אור אדום עמום ולעשות את כל ההליכים תחת אור אדום או IR העמום הבאים (השתמש למשל, מסנן אדום מול מקור מיקרוסקופ האור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את העיניים החוצה באמצעות פינצטה ולשים אותם בתקשורת. מניחים עין אחת בכל פעם על פיסת נייר קטנה (למשל, כמה נייר סינון רגיל) ולעשות כהדליק כ ברמה של serrata אורה תוך החזקת עין עם פינצטה (זה נעשה מחוץ לפתרון כאן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך לאורך serrata אורה (או קרוב יותר לקו המשווה של העין) עם microscissors ולהסיר את הקרנית והעדשה. מניחים את כוס עין בתקשורת הקרה בצלחת פטרי הגדולה וחזור על אותו התהליך עם העין השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתך קטן מהחלק העליון של כוס עין לכיוון עצב הראייה על ידי שמירה על המספריים בין הרשתית ולובן העין על מנת לשמור על הרשתית כשלמה ככל האפשר. אחיזה בלובן העין משני צידי החתך באמצעות שתי פינצטה ולמשוך את פינצטה אחד משני כדי לנתק את הרשתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את עצב הראייה ולנסות לבודד את הרשתית עם כמות מינימאלית של מגע פיזי אל פני השטח דיסטלי. הרשתית תהיה בעיקר לנתק באופן אוטומטי מהרשתית במהלך תהליך הנתיחה. חשוב יותר, כדי למנוע הפרעה מכאנית של הרשתית מאשר לבצענתיחה במהירות, בדרך כלל ניתן מודגרות רשתית לפחות 30 דקות בפתרון ללא השפעה משמעותית על מאפייני התגובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הרשתית על הכיפות של בעל הדגימה (איור 1 ג). לטבול את החלק התחתון של בעל הדגימה בצלחת פטרי עם הרשתיות גזור. חלק את הרשתית, צד קולטי האור (המשטח הקמור של הרשתית המבודדת) כלפי מעלה, מעל לכיפה ולהרים את בעל הדגימה כך שהרשתית מצרפת על נייר הסינון. חזור על התהליך עבור הרשתית אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את צלחת בעל בזהירות כדי למנוע crosstalk החשמלי בין הרשתיות כמו גם הסטת רעש ואות. יש בעל דגימת O- טבעות סביב כיפות חלק התחתונה כדי למנוע דליפת פתרון בין התחתית והחלקים העליונים של בעל, כמו גם לעזור לבידוד חשמלי של הצדדים קולטי האור ותא גנגליון של הרשתית בודדת. צרף את החלק העליון של בעל עם ארבעה ברגים (ראה איור 1) ולמלא את ערוצי זלוף עם פתרון זלוף באמצעות מזרק ומחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את בעל הדגימה ליד הבלוק מחליף החום ולחבר את קווי קלט והפלט זלוף לבעל הדגימה (1D איור). חבר את האלקטרודות למגבר ERG (אלקטרודות העליונה להתחבר לאדמה / מינוס הסיכה במגבר) ולצרף את יחידת ממריץ / שליטה בבעל הדגימה באמצעות מתאם או להחליק את כרית החימום ליחידת ממריץ תלוי באיזה in vivo משמשת מערכת ERG. </li></ol> 3. הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הגדרות מגבר וגירוי באמצעות התוכנה של מערכת in vivo. הגדר את תדירות הרכישה לערך בין 1 kHz ו -10 ונמוך לעבור סינון 300 הרץ. אל תשתמש בסינון גבוה לעבור. השתמש 60 הרץ (או 50 הרץ באירופה) לחרוץ מסנן במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא בסיס ללא גירוי ושנינות אורh גירוי עמום (למשל., אור הירוק של -35 dB או 0.3 מ&quot;ר MCD -2) לבדיקת חיבור חשמלי טוב בין האלקטרודות ומדגם רשתית. חכה 10 - 20 דקות לפני תחילת איסוף הנתונים, כך שטמפרטורה ובתפקוד רשתית להגיע למצב יציב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרמטרים גירוי פי כל ניסוי ספציפי ולהתחיל איסוף הנתונים. לדוגמא, משתמשת באור ירוק מ -40 עד 0 dB או מ0.1 עד 1,000 מ&quot;ר MCD -2 למשפחת תגובת scotopic. השתמש על 2 עד 3 יומן-יחידות בהירות הבזקים בהקלטות photopic בי מוטות צריכה להיות מורחק על ידי אור הרקע (3-30 CDM -2) או הבזק בדיקה (מ&quot;ר על 1.3 Cd -2 = dB 1, ראה איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זאת, יש לזכור כי ערכי עוצמת אור המדויקים עשויים להיות מעט תלויים בכיול המערכת ותנאי ניסוי שלך. ככלל אצבע, בעוצמות בקנה מידה על ידי 5-10 פי לעומת in vivo </eמ &#39;&gt; הקלטות בעת שימוש באור ירוק 17. כיסוי שחור עם פתחים מעל הרשתית (הכלולה במערכת המתאם המסחרית) ניתן להשתמש כדי להפחית את פיזור אור בבעל הדגימה ולהקל גירוי אחיד ושווה של שני הרשתיות על ידי כדור Ganzfeld של במסחר vivo מערכות. הערה: להקלטות מרשתית כהה מותאם, בעוצמות של הבזקי בדיקה המשמשים באקונומיקת ניסוי טיפוסית חלק זניח בלבד של פיגמנט, כך שחוסר ההתחדשות מונעת הרשתית היא לא בעיה. בנוסף, זה כבר הראה בעבר כי התחדשות פיגמנט החרוט עדיין יכולה להתרחש ברשתית המבודדת באמצעות תא מולר המחזור 20 החזותי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כניסויים יימשכו בדרך כלל בין 30 דקות עד כמה שעות, לפקח להיסחף בסיסיים, רמת רעש ויציבות תגובה במהלך הניסוי כשינויים באלה עלולים להצביע על בעיות טכניות. רעש מוגבר או ירידה: הערהאמפליטודות תגובת ד עשויה להצביע על בועות אוויר בערוצי זלוף או אלקטרודה, טמפרטורה נמוכה מדי או גבוהה, פתרון דליפה / שפך או עקירה של הרשתית. </li></ol> 4. ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את בעל דגימה מקווי זלוף, לפתוח אותו ולשטוף את הרשתית מנייר הסינון. הסר את האלקטרודות ולשטוף אותם במים מזוקקים (לא משתמש באתנול). נקה את בעל הדגימה (כולל ערוצי זלוף) עם אתנול ו / או מים מזוקקים. צינורות סומק זלוף בזהירות עם&gt; 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את בקבוק זלוף עם מים מזוקקים (לא משתמש בחומרי ניקוי). אתנול יכול לשמש גם כדי לנקות את הבקבוק. </li></ol>

<ol>
	<li>Armington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Electroretinogram. , (1974).</li><li>Einthoven, W., Jolly, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+form+and+magnitude+of+the+electrical+response+of+the+eye+to+stimulation+by+light+at+various+intensities.">The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities.</a> Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).</li><li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve.">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> J. Physiol. 77, 207-239 (1933).</li><li>Penn, R. D., Hagins, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transmission+along+retinal+rods+and+the+origin+of+the+electroretinographic+a-wave.">Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave.</a> Nature. 223, 201-204 (1969).</li><li>Stockton, R. A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-wave+of+the+electroretinogram.+A+reflection+of+ON+bipolar+cell+activity.">B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity.</a> J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).</li><li>Robson, J. G., Frishman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+linearity+and+kinetics+of+the+cat+retina:+the+bipolar+cell+component+of+the+dark-adapted+electroretinogram.">Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram.</a> Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissection+of+the+electroretinogram+from+the+isolated+rat+retina+with+microelectrodes+and+drugs.">A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs.</a> Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).</li><li>Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+responses+to+light+from+cat+pigment+epithelium:+origin+of+the+electroretinogram+c-wave.">Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave.</a> Nature. 227, 728-730 (1970).</li><li>Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bovine+arterially-perfused+eye:+an+in+vitro+method+for+the+study+of+drug+mechanisms+on+IOP,+aqueous+humour+formation+and+uveal+vasculature.">The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature.</a> Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+(Rana+temporaria).">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).</li><li>Hamasaki, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog.">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> J. Physiol. 167, 156-168 (1963).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).</li><li>Bastian, B. L., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+adaptation+in+toad+rods:+requirement+for+an+internal+messenger+which+is+not+calcium.">Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium.</a> J. Physiol. 297, 493-520 (1979).</li><li>Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+gradients+across+the+receptor+layer+of+the+isolated+rat+retina.">Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina.</a> J. Physiol. 256, 333-360 (1976).</li><li>Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+ERG+analysis+of+photoreceptors+using+an+in+vivo+ERG+system.">Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system.</a> Vision Res. 101, 108-117 (2014).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li><li>Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+conductance+block+by+barium+in+amphibian+Muller+cells.">Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells.</a> Brain Res. 498, 308-314 (1989).</li><li>Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+buffering+of+extracellular+potassium+by+Muller+(glial)+cells+in+the+toad+retina.">Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina.</a> Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).</li><li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration:+retinal+tissue+as+a+biosensor.">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).</li><li>Walter, P., Luke, C., Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+light+responses+in+superfused+bovine+retina.">Antibiotics and light responses in superfused bovine retina.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+profile+of+alkylphosphocholines+in+the+model+of+the+isolated+perfused+vertebrate+retina.">The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).</li><li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+toxicity+testing+of+VEGF+Trap-Eye+in+an+isolated+perfused+vertebrate+retina+organ+culture+model.">Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model.</a> Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).</li><li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina:+rod+and+cone+photoresponses.">Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+sensitivities+of+short-+and+long-wavelength+sensitive+cone+mechanisms+in+the+frog+retina.">Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina.</a> Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).</li><li>Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-+and+midwave-sensitive+cone-driven+retinal+responses+of+the+mouse:+a+possible+phenotype+for+coexpression+of+cone+photopigments.">UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments.</a> J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).</li><li>Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+candelas+to+photoisomerizations+in+the+mouse+eye+by+rhodopsin+bleaching+in+situ+and+the+light-rearing+dependence+of+the+major+components+of+the+mouse+ERG.">From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG.</a> Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).</li><li>Azevedo, A. W., Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+protocols+alter+phototransduction:+the+implications+for+retinal+processing+at+visual+threshold.">Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold.</a> J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).</li><li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+I.+Structural+analysis+using+light+and+electron+microscopy.">Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy.</a> J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+vertebrate+photoreceptors.">Adaptation in vertebrate photoreceptors.</a> Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li><li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors:+adaptation,+noise,+and+kinetics.">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li><li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina:+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling.">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li><li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation.">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li><li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation.">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li></ol>

יש אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס הסכם רישיון עם Xenotec, Inc. ועשויה לקבל תמלוגים ממכירת מתאם vivo לשעבר.

<html> אנו מדגימים כאן את השלבים הקריטיים להשגת הקלטות vivo ERG לשעבר באיכות גבוהה בו זמנית משתי רשתיות עכבר מבודדות באמצעות רכיבים במערכת vivo ERG יחד עם vivo לשעבר מתאם ERG. במחקר זה אנו perfused שני הרשתיות מבעלי החיים עם אותו הפתרון (או איימס &#39;, לוק של או רינגר) אבל זה גם אפשרי לינקב כל רשתית עם למשל פתרון שונה, למטרות בדיקת סמים. הצעדים החשובים ביותר לקבלת נתונים באיכות גבוהה הם מיגון מרעש אלקטרומגנטים, לנתיחה זהירה של הרשתית, יציב וזרימת זלוף מהירה יחסית על ידי שימוש בבעל דגימה שהותקן מתקדם, וביצוע כל הליכי הכנת המדגם תחת אדום עמום (או IR) אור. השיטה המתוארת כאן מאפשרת שימוש מיידי של שני הרשתיות והשימוש הכפול של התקנת ERG in vivo לבצע in vivo לשעבר הקלטות ERG vivo. _content &quot;&gt; vivo לשעבר בעל דגימת ERG שהותקן נועד לאחרונה על ידי 17, ועכשיו זמין באופן מסחרי, משפר את יחס האות לרעש על ידי בידוד חשמלי יעיל של הפרוקסימלי וחלקים הדיסטלי של הרשתית ומייעלת את זרימת זלוף מעל הרשתית (שער החליפין גבוה פתרון .) היעדרות של רכיבי רעש בתדר האיטי באות vivo לשעבר ERG מאפשרת ניתוח כמו גם מתגובות קטנות מאוד עם זאת, מצאנו כי הקלטת vivo לשעבר היא נוטה יותר להפרעות של רעש קו AC-הכח (60 הרץ בארה&quot;ב;. 50 הרץ באירופה) מאשר בvivo ניסויים. רעש זה מצמידים את האות בעיקר באמצעות קו זלוף, וזה יכולים להיות בעיקר הוסרו על ידי מגן (והארקה) כל רכיבי זלוף (בקבוק, צינורות) המתגורר מחוץ לתחום כלוב פאראדיי או Ganzfeld . בנוסף, לפעמים 60 הרץ רעש מצמידים את אות ERG vivo לשעבר דרך מחליף החום ורעש זה יכול גם להסיר על ידי הארקה. &lt;/ P&gt; אנו מדגימים כיצד להסיר רכיבי אות ERG ספציפיים על ידי הוספת חוסמי תרופתיים לזלוף במהלך הניסוי מאפשר לנתיחה של הפונקציה של סוגי תאים שונים באותו הרשתית / ניסוי עם שלוש תקשורת שונה פיזיולוגית זלוף (איור 2). מחקר שנערך לאחרונה הראה כי הבחירה של תקשורת זלוף משפיעה פיזיולוגיה קולטי האור בהקלטות תא בודדת 32. כאן אנו משמשים &quot;לוק של, ו&#39;איימס תקשורת &#39;HEPES-רינגר להקליט תגובות הבזק כהות מותאמת בהעדר והנוכחות של חומרים כימיים תרופתיים נועדו לבודד את מרכיב קולטי האור של אות ERG (איור 2). פתרונות שנאגרו ביקרבונט נתנו אמפליטודות a- וב-גל גדול יותר, עד 1 mV. תגובות הבזק קולטי האור עמומים תחת בינוני של לוק עם חוסמי הכילו צורת גל התאוששות מסובכת (ראה הבלעה של איור 2 ד) שלא ראה עם AmesR17; או זלוף רינגר. כאשר השימוש בvivo לשעבר ERG הופך מותאם על ידי מעבדות יותר יהיה זה מועיל להשתמש באותו כלי התקשורת זלוף ושיטות סטנדרטיים לבודד את רכיבי אות שונים. בשלב זה נראה שהאופציה צדדי ביותר היא המדיום &#39;איימס כי זה נותן לי אמפליטודות a- וב-גל יציב וגדולה. בנוסף, תגובת קולטי האור, פרמקולוגית מבודד בפתרון זה, נראה שיש לי צורת גל פשוט מזכיר שנרשם מקולטני אור יחיד (איור 2E). ובכל זאת, כמה שאלות פתוחות יישארו על קיומם של רכיבי אות אחרים ERG נצפו בתנאי in vivo. לדוגמא, בתנאים שלנו הקלטת vivo לשעבר לא ראו פוטנציאל oscillatory בולט, 100 - 150 הרץ גלי נדנוד שנצפו בדרך כלל בשלב של העלייה ב-גל in vivo תגובת ERG. יתכן אפוא שפונקצית הרשתית הפנימית בvivo לשעבר שלנו </eמ &#39;&gt; תנאים נפגעו למרות vivo לשעבר ב-גלים גדולים מעורבים קיימא על תפקוד תאים דו קוטבי. מחקרים עתידיים צריכים לפתור אם שינויים בפרוטוקולים הניסוי שמוצגים כאן (לנתיחה, וכו &#39;זלוף) תאפשר לנו להקליט פוטנציאלי oscillatory בתנאי vivo לשעבר. פונקצית קון היא חיונית לחזון שלנו. עם זאת, חקירה של קונוסים הקשו על ידי גודלם הקטן ומחסור במיוחד בעכבר רשתית 33. בידוד של פונקצית קונוס מסתבך עוד יותר בהקלטות ERG עכבר כי יש לי M-קונוסים והמוטות שלהם רגישויות רפאים כמעט זהות 30. פרוטוקולים סטנדרטיים לנצל את הבדל יומן-יחידת מספר בין רגישויות מוט וחרוטים באמצעות אור רקע דיכוי-מוט. עם זאת, לאור רקע יציב ידוע להוריד את רמת רגישות מוטות 34,35 ולהשפיע על תפקוד קונוס אולי דרך אפנון של צימוד junctional פער בין מוטות קונוסים &lt;sup&gt; 36,37. לפיכך, קשה למצוא עוצמת אור רקע שהיא בהיר מספיק כדי לשמור על מוטות רוויות מבלי להשפיע על קונוסים. כאן אנו מדגימים שיטת הבזק כפולה חלופית שמנצלת הן את הרגישות וקינטיקה התאוששות מהירה יותר של קונוסים 19,29,30 נמוכות יותר. בדרך זו קל יותר לבודד תגובות בתיווך חרוט באמת-כהות מותאמות. שם לב שבאיימס &quot;או הפתרונות של לוק ללא כל חוסמי, הפרטים של צורת גל ההתאוששות הושפעו במידה מסוימת במהלך הניסוי על ידי השימוש בהבזקי בדיקה ובדיקה בהירים. זה מסובך ניתוח החיסור כדי לבודד את תגובות קונוס. עם זאת, הסרת רכיב גליה ידי בריום עזרה לייצב את הזנב של התגובות המצביעות על כך ההשתנות הייתה בשל מרכיב תא מולר. בדרך זו ניתן היה להשיג את תגובות מונעים חרוט כהות מותאמות בעכברי WT (איור 3). תגובות קונוס מבודדים על ידי הבזק כפולטכניקה מעכברי WT הופיעה קטנה יותר בהשוואה לאלו שנרשמו מעכברי WT באמצעות אור הרקע לדכא פעילות מוט 17,37. הבדל זה יכול להיות מוסבר על ידי השפעה מאופיינת היטב של אור הרקע שלאט (תוך 10 דקות) משפרת אמפליטודות תגובת חרוט כנראה בשל הסרת הדיכוי בתיווך המוט של תגובות קונוס 37-39. לסיכום, השיטה הוכיחה כאן עושה הקלטות אלקטרו vivo לשעבר ניתן ללמוד את הפונקציה של הרשתית. בעתיד, אנו מקווים שעוד רבות מעבדות תהיה להתאים שיטה זו עוצמה ללמוד הפיסיולוגיה ופתולוגיה של רשתית בעלי חיים ובני אדם ולקדם את ההבנה של תפקוד רשתית שלנו ולפתח טיפולים טובים יותר למחלות מסנוורים.

Electroretinogram (ERG) הוא טכניקה מבוססת היטב כי ניתן להשתמש כדי להקליט את הפעילות החשמלית של הרשתית מופעלת על ידי אור. אות ERG מופקת בעיקר משינויי מתח שנגרמו על ידי זרמי רדיאלי (לאורך הציר של קולטני האור ותאים דו קוטביים) זורמים במרחב תאי ההתנגדות של הרשתית. אות ERG הראשונה נרשמה בשנת 1865 על ידי הולמגרן מפני שטח של עין דג 1. Einthoven וJolly 1,908 2 חילקו את תגובת ERG לתחילתה של אור לשלושה גלים שונים, נקראת a-, B-, וג-גלים, שכיום ידועים שישקפו בעיקר את הפעילות של קולטני האור, על תאים דו קוטביים, ואפיתל הפיגמנט תאים, בהתאמה 3-8. ניתן להקליט ERG מהעיניים של בעלי חיים או בני אדם (in vivo) בהרדמה, מהכנת עין מבודדת 9, על פני רשתית שלמה מבודדת (לשעבר vivo) 3,10-15 או על פני שכבות רשתית ספציפיות עם microelectrodes (מקומיERG) 4,16. מבין אלה, in vivo ERG הוא כיום השיטה הנפוצה ביותר להערכת תפקוד רשתית. זוהי טכניקה לא פולשנית שיכול לשמש למטרות אבחון או למעקב ההתקדמות של מחלות רשתית בבעלי חיים או חולים. עם זאת, בvivo הקלטות ERG לייצר אות מורכבת עם מספר מרכיבים חופפים, לעתים קרובות מזוהמות ברעש extraocular הפיזיולוגי (למשל, נשימה ופעילות לב). ERG המקומי ניתן להשתמש כדי להקליט את האות על פני שכבות מסוימות של הרשתית אבל זה חודרני ביותר ויש לו את היחס הנמוך ביותר אות לרעש (SNR) בהשוואה לתצורות הקלטת ERG האחרות. ERG המקומי הוא גם תובעני מבחינה טכנית ודורש ציוד יקר (למשל, מיקרוסקופ וmicromanipulators). Transretinal ERG מהרשתית שלמה, מבודדת (לשעבר vivo ERG) מציע פשרה בין in vivo ושיטות ERG מקומיים המאפשרת יציב וHIGהקלטות h SNR מרשתית שלמה של בעלי חיים או בני אדם 17. לאחרונה, שיטה זו שמשה בהצלחה ללמוד לתפקד מוט וקולטי אור חרוט ברשתית של יונקים, קופים ובני אדם 18-20. בנוסף, בשל היעדר אפיתל הפיגמנט ברשתית vivo לשעבר, מרכיב ג-הגל החיובי של אות ERG מוסר ורכיב איטי שלילי בולט PIII מתגלה בvivo לשעבר ההקלטות. רכיב PIII האיטי הוכח מקורן את הפעילות של תאי גליה מולר ב21-23 הרשתית. לפיכך, לשעבר vivo שיטת ERG יכול לשמש גם כדי ללמוד תאי מולר ברשתית ללא פגע. גם מספר מחקרים הראו כי vivo לשעבר הקלטות ERG יכולים לשמש למדידת ריכוז של סוכנים תרופתיים סביב 24 הרשתית ולבדוק את הבטיחות ויעילות של תרופות 25-27. מסחרי מרובים במערכות vivo זמינים ומשמש במעבדות רבות שלא בהכרח יש לי רקע אלקטרופיזיולוגיה נרחב. לעומת זאת, מכשירי vivo לשעבר לא היו זמינים עד לאחרונה 17 וכתוצאה מכך רק מעט מאוד מעבדות כיום מנצלות טכניקה רבת עוצמה זו. זה יהיה מועיל לבצע הקלטות vivo לשעבר ERG זמינים ליותר מעבדות במטרה לקדם את הידע שלנו על פיזיולוגיה והפתולוגיה ברשתית, ולפתח טיפולים חדשים למחלות מסנוורים. אנו מדגימים כאן מכשיר vivo לשעבר ERG פשוט ובמחיר סביר 17 ולהראות כיצד ניתן להשתמש בו בשילוב עם מספר מערכות vivo ERG הזמינים מסחרי בלהקליט איתות rod- ותיווך קונוס (a- וB-גלים) והפונקציה של תאי מולר (להאט PIII) מרשתית עכבר wild-type בשלמותה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>HMsERG</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>LKC Technologies</td>
			<td>UTAS-E 3000</td>
			<td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex vivo adapter</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>Ex VIVO ERG adapter</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>North Central Instruments</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;idCategory=27">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR emitter</td>
			<td>Opto Diode Corp.</td>
			<td>OD-50L</td>
			<td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prowler Night Vision Scopes</td>
			<td>B.E. Meyers Electro Optics</td>
			<td>D4300-I</td>
			<td>Military grade product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red filter</td>
			<td>Rosco Laboratories</td>
			<td>Roscolux #27 Medium Red</td>
			<td>May be used instead of IR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red head light</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>ERGX011</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>500086</td>
			<td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers #5</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Metler Toledo</td>
			<td>AB54-S/FACT</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter and electrode</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>pHI 350</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60129</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63020</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0750</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP4</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>101</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>224731</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2834</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz culture medium L-15</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN3156</td>
			<td>5% CO2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

הקלטנו תגובות הבזק מסוג wild-כהה מותאם (WT) C57BL / 6 רשתית עכבר ידי ביצוע פרוטוקולי הניסוי שתואר לעיל ושמודגמים באיור 1 על ידי שימוש בפתרוני זלוף סטנדרטיים שונים (איור 2). גל התגובה וקינטיקה כמו גם הרגישות של קולטני אור מוט הופיעו דומים באיימס &#39;והתקשורת של לוק (איור 2 א&#39; וב &#39;). מצד השני, תחת פתרון HEPES שנאגר רינגר (לא O CO 2/95% ביקרבונט או 5% 2) אמפליטודות התגובה היתה קטנה יותר באופן משמעותי. מצאנו גם כי בתנאים אלה יציבות ב-גל הייתה בסכנה. הוספת 40 APB מיקרומטר (DL-AP4) הוסר ב-גל חיובי ביעילות בכל שלוש התקשורת (איורים 2D-F). הסרת ב-הגל חשפה גל גדול איטי שלילי (איור 2 ד) שיוחס לפעילות תאי מולר 21. הוספת 100 &amp;956 #; M של בריום בוטל רכיב זה, חושף את תגובת קולטי האור של אות ERG vivo לשעבר (איורים 2D-F). אנחנו יכולים להקליט עד 1 תגובות קולטי האור mV רוויות באיימס &#39;ולוק של אילו תגובות מקסימליים היו בדרך כלל סביב 200 μV תחת זלוף רינגר. תגובות קולטי האור קון היו מבודדות בעבר על ידי מה שנקרא טכניקת הבזק הכפול שבו הבזק בדיקה בהיר להרוות את המוטות ואחריו הבזק בדיקה בתקופה שבי קונוסים החזירו המדינה הכהה המותאמות שלהם, אבל מוטות להישאר רוויות 19,29. כאן אנו מבודדים תגובות ERG בתיווך חרוט (המכיל את שני a- וב-גל) בתקשורת &quot;איימס בתוספת של בריום 100 מיקרומטר, אך לא DL-AP4 על ידי שימוש בטכניקה כפולה הבזק (איור 3). בריום שימש כדי להסיר את רכיב גליה האיטי שהופיע כדי להפוך את החלק המאוחר של התגובות משתנים יותר במיוחד בשימוש חוזר ונשנה של brighהבזקים לא. אנחנו השתמשנו בפלאש בדיקה מתמיד כדי להרוות מוטות והבזקי מבחן משתנים 300 אלפיות שניים לאחר הבדיקה הבזק לעורר תגובות קונוס. משפחת תגובת קונוס שהושגה על ידי הפחתת בדיקה תגובת הבזק מהתגובות &quot;הבזק הבדיקה + בדיקה &#39;מוצגת באיור 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig1.jpg" /> מילוי איור 1. שימוש בבעל דגימת vivo לשעבר ERG. (א) לערוצי אלקטרודה והרכבה של האלקטרודות. (ב) בדיקה של בעל דגימה שנאסף לפני הנתיחה על ידי מדידת ההתנגדות ומתח בין זוגות אלקטרודה. הרכבה (C) של הרשתית על נייר הסינון בבעל הדגימה. (ד) בעל הדגימה מחובר לקווי זלוף ומגבר ERG בסאי ERG המסחרייםגזע. זרימת זלוף הנתיב מסומן בחצים כחולים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig2.jpg" /> משפחות איור 2. Flash תגובה נרשמו מהרשתית כהה מותאם WT עכבר perfused עם של לוק (), איימס &#39;(B), ובינוני HEPES שנאגר רינגר (C). ההבזקים נמסרו 3, 40, 130, 390 ו1,400 הפוטונים מיקרומטר -2 (מ-36 ל-9 dB או -3.6 ל-0.9 יומן (ס&quot;מ Cd -2) אור ירוק (530 ננומטר)). עקבות שחורות בתגובות הצג (DF) נרשמו מרשתית ב( AC) לאחר תוספת של 40 מיקרומטר APB ו -100 מיקרומטר בריום. עקבות אדומות בתגובות הצג (ד) נרשמו מהרשתית ב()<html> perfused עימו של לוק בתוספת APB מיקרומטר 40 אבל לא בריום. הבלעה מראה את התגובות לשלושת ההבזקים הקלושים ביותר בתקשורת של לוק מכילה APB ובריום. ההבזקים נע בין 7 ל -14,000 פוטונים מיקרומטר -2 (מ-32 עד 1 אור הירוק dB) ב( ד &#39;), בין 3 ל -1,400 פוטונים מיקרומטר -2 (מ-36 ל-9 dB אור ירוק) ב( E), וממיקרומטר 7 ל -1,400 פוטונים -2 (מ-32 ל-9 dB אור ירוק) ב( F). ראה Vinberg et al. 2,014 17 וLyubarsky et al. 1,999 30 ו2004 31 לפרטים של המרת אנרגיה זוהרת photopic ניתנה בCd מ&quot;ר -2 לפוטונים מיקרומטר -2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> עומס / 52,855 / 52855fig3.jpg &quot;/&gt; בידוד איור 3. תגובות קונוס עם שיטת הבזק כפולה בעכבר WT. (א) תגובה לבדיקת הבזק (מיקרומטר 14,000 פוטונים -2 או 1 אור ירוק dB, שחור) ותגובה לבדיקת הבזק ואחריו הבזק מבחן (81,000 מיקרומטר פוטונים -2 או 9 אור dB ירוק, אדום). (ב) תגובות פלאש קון לבדוק הבזקים החל 360 ל81,000 פוטונים מיקרומטר -2 (-14 עד 10 אור הירוק dB) המבודדים על ידי הפחתת תגובת הבזק בדיקה מ&quot; בדיקה + בדיקת פלאש &quot;תגובה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52855/52855fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System at JoVE.com

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

9.1K Views.  Washington University in St. Louis. Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Video: Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

An Implantable System For Chronic In Vivo Electromyography

Electromyography (EMG) measures the muscle response to electrical stimulation or spontaneous activity of motor units and plays an important role in assessing neuromuscular function. Chronic recording of EMG activity reflecting a muscle&#8217;s reinnervation status after nerve injury has been limited, due to the invasive nature of traditional EMG recording techniques. In this regard, an implantable system is designed for long-term, in vivo EMG recording and nerve stimulation. It has been applied and tested in a study on reinnervation of laryngeal muscles. This system consists of 1) two bipolar electrode nerve cuffs and leads for stimulating each of two nerves: the recurrent laryngeal nerve (RLN) and internal branch of the superior laryngeal nerve (SLN); 2) two EMG recording electrodes and leads for each of the two laryngeal muscles: posterior cricoarytenoid (PCA) muscle and thyroarytenoid-lateral cricoarytenoid (TA-LCA) muscle complex; and 3) a skin receptacle interfacing all implanted lead terminals to an external recording preamplifier and stimulator using a connection cable. The wire leads are Teflon-coated, multi-filament, type 316 stainless steel. They are coiled and can stretch during body movement of the awake animal to prevent lead breakage and electrode migration. This system is implanted during an aseptic surgery. Afterwards, baseline EMG recordings are performed before the RLN is transected in the second surgery to study muscle reinnervation. Throughout the study, multiple physiological sessions are conducted in the anesthetized animal to obtain evoked and spontaneous EMG activity that reflects the reinnervation status of laryngeal muscles. The system is compact, free of infection over the course of the study, and highly durable. This implantable system can provide a reliable platform for research in which long-term recording or nerve stimulation is required in an anesthetized or freely moving animal.&#160;

Presented here is a protocol for the manufacturing of an implantable system for in vivo chronological recording of evoked and spontaneous electromyographic potentials. The system is applied to the investigation of reinnervation of laryngeal muscles following nerve injury. &#160;&#160;

מערכת ולוהשתלות לכרוני בVivo האלקטרומגרפיה

Electromyography (EMG) measures the muscle response to electrical stimulation or spontaneous activity of motor units and plays an important role in ...