אנו להכיר בהכרת תודה הקבוצה ביולוגיה תאי בטא-תעודה מזויפת של אונ' סוכרת מרכז של מצוינות עבור עצות מועילות ודיונים. האדם לנגרהנס נמסרו על ידי NIDDK במימון משולב איון הפצה התוכנית (IIDP)-עיר של תקווה. עבודה זו מומן על ידי NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (חודשים), 2UC4DK098085 (IIDP), על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת תמלא #1-15-BS-003 (LCA) בשיתוף עם הסדר של ירבוז.

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי במסצ'וסטס הספר מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה. איון האנושי מחקרים נקבעו על ידי מועצת המנהלים לסקור מוסדיים במסצ'וסטס אינן מצריכות סקירה IRB או פטור משום שהם אינם כרוכים השימוש של בני אדם.
1. איון בידוד ותרבות
<ol><li>לבודד איונים, נפרדות ובלחות אקסוקרינית ו ductal רקמות בשיטת הבחירה שלך. הערה: שיטה זו היה ממוטב באמצעות איים מבודדים collagenase ductal insufflation ו Ficoll ההפרדה12 (מכרסם) או משלוח שלאחר איונים מתוכנית משולב איון הפצה (IIDP13; האדם). איים מוגנים עם micropipette P200.</li>
	<li>כדי למטב את איון מורפולוגיה, לאפשר איונים להתאושש בין לילה ב 10 מ"ל איון מוחלט בינוני (RPMI עם 10% FBS פניצילין/סטרפטומיצין, גלוקוז 5.5 mmol/L) בתוך תא humidified המכילה 5% CO2 ב 37 º C. למרות שלב זה לא נדרש להשיג חלקים, איים שלמים יותר לאחר תקופת התאוששות (ראה איור 2).</li>
</ol>2. איון קיבוע
<ol><li>באמצעות טיפ P200 נמוך מחייב, לבחור. לאישתך כ 250 איון מקבילות (IEQ)13 באמצעות רשת מכוילת תחת stereomicroscope לתוך צינור microfuge 1.5 mL מחייב נמוכה. טיפים וצינורות נמוך מחייב להפחית את אובדן איון.</li>
	<li>לאפשר איונים להתיישב לתחתית הצינור microfuge. הסר את תגובת שיקוע ברוב עם טיפ pipet P200, מטפל יש להסיר כל איונים.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל ל- PBS. צנטריפוגה צינור ומפרידה דלי מתנדנדים עד המהירות מגיע 200 גרם x, אז לעצור את העובדות. הסר את תגובת שיקוע. חזור על שטיפת PBS, עבור סכום כולל של שני שוטף.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של פתרון פורמלין 10% או 4% טריות paraformaldehyde. לתקן בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. התוצאות נבדק בשיטה זו, שיטות קיבוע אלה היו להבחין מגניחותיה. קיבוע קצר יותר ייתכן גם שתהיה אפשרות; מומלץ למטב את הקיבעון משך התוצאה הרצויה.</li>
	<li>הסר את לשבועיים עם טיפ P200.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל ל- PBS. צנטריפוגה צינור עד המהירות מגיע 200 גרם x, אז לעצור את העובדות. הסר את תגובת שיקוע. חזור על שטיפת PBS, עבור סכום כולל של שני שוטף.</li>
	<li>המשך מיד לשלב הבא.</li>
</ol>3. הכנת דיסק איון (איור 1)
<ol><li>השימוש הראשון, להמיס את הג'ל (למשל, Histogel) ב 70 ° C ולעשות aliquots ב 1.5 mL microfuge צינורות לאחסון לטווח ארוך. נפח aliquot אינה קריטית, שכן aliquots יכול להיות שימוש חוזר.</li>
	<li>לחמם את הג'ל (כ-100 µL עבור דגימה) ב 70 מעלות צלזיוס על ידי הצבת microfuge שפופרת המכילה את aliquot ג'ל בתוך גוש חום מוגדר כ- 70 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העברת agarose כחול חרוזים (10 µL עבור כל דגימה) לתוך צינור נקי microfuge 1.5 mL. Resuspend ביסודיות את החרוזים לפני pipetting. הערה: חרוזים כחול מעורבבים עם איונים כדי לסייע בזיהוי חזותי של החומר מוטמע לחצן agarose ואת הרחוב פרפין. מספר חרוזים כחול המשמש אינה קריטית לתוצאות, אך להימנע חרוזים מוגזמת (> 5 x מספר איים קטנים) כדי לאפשר הפצה אופטימלית של איים קטנים בסעיפים.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים הכחולים עם 1 מ"ל PBS, פעמיים. עבור כל כביסה, לסובב את החרוזים 1 דקות ב- g 800 x. לאחר לשטוף את השני, resuspend את החרוזים ב (n+2) x 10 הציבורית µL, כאשר n הוא המספר של צינורות מדגם; לדוגמה, עבור 2 צינורות מדגם, האחסון PBS כדי להוסיף החרוזים יהיה 40 µL.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור microfuge המכיל איים קטנים (קצר spin כדי 200 גרם x) ולהסיר את רוב תגובת שיקוע. לחתוך את הקצה של טיפ micropipette 10 µL בעזרת מספריים או סכין ולהוסיף 10 µL של חרוזים כל שפופרת איון, באמצעות טיפ נקי עבור כל דגימה. לא מערבבים (כדי להימנע מאובדן איים קטנים).</li>
	<li>צנטריפוגה איים קטנים, חרוזים (קצר spin כדי 200 גרם x). להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר עם טיפ micropipette נימולים 10 µL.</li>
	<li>תווית של שקופיות מיקרוסקופ לזיהוי הדגימה. 2-3 דוגמאות ניתן להכין בכל שקופית. מקם את השקופית על הספסל ליד הרחוב חום עם ג'ל ומחוממת. חותכים הטיפים של שלוש עד חמש 20 טיפים micropipette µL קשירה נמוכה עבור דגימה עם גילוח או מספריים. לטעון micropipettes P20 שני עם טיפים לחתוך כדי לאפשר מהירה מתמיכת אחד לשני.</li>
	<li>באמצעות את micropipette הראשונה, להוסיף µL 15-20 של ג'ל חם הצינור microfuge איים קטנים/חרוזים; מיד לערבב, הימנעות בועות; חלות נוזל התערובת אגר/איים קטנים/חרוזים השקופית לטופס < דיסק בקוטר 1 ס מ. מקם את הדיסק סמוך לקצה השקופית, משאיר מקום הטבעת החיצונית ג'ל (השלב הבא). הקש על השקופית בעדינות מספר פעמים כדי ליישב את איים קטנים, חרוזים.</li>
	<li>באמצעות micropipette של השני, להוסיף 20 µL של ג'ל חם הצינור הדגימה. באמצעות את micropipette הראשונה, לערבב ג'ל חדש עם כל שאר איונים/חרוזים, מחדש ההתחממות בבלוק חום אם הוא מתחיל לגבש, לאחר מכן להחיל תערובת זו אל השקופית, המקיפים את הדיסק המקורי. חזור על הצורך, באמצעות טיפים נוספים חתוכות מראש, עד הדיסק הוא הגודל הרצוי ואת עובי. הערה: טיפול הדיסק וג'ל קל אם הטבעת מבחוץ היא מעט עבה יותר. בדרך כלל, 3 x 20 µL של ג'ל מספיקה. שלב זה ממזער אובדן איים על ידי צינור שוטף ומוסיפה מסכן איון agarose החיצוני של הדיסק כדי להקל על הטיפול דיסק.</li>
	<li>להכין כל דיסק בנפרד ולשמור בזהירות אחר סדר דגימה אם הצבת מרובות דיסקים בכל שקופית.</li>
	<li>במקום השקופיות על משטח שטוח של קרח רטוב, עם כיסוי, במשך 10 דקות או עד עפור הג'ל. . זה קשה יותר להחליק את הדיסק את הזכוכית אם זה מתייבש.</li>
	<li>תווית ביופסיה עיבוד/הטבעה רקמות קלטות עם עיפרון, אחד לכל דגימה. יבש האחורי של השקופית כדי להימנע להרטיב את נייר כחול.</li>
	<li>משתמש הקצה הקהה של סכין גילוח, דחף בעדינות את הדיסק לכל כיוון כדי לשחרר אותו מהזכוכית. כאשר הוא מחליק בקלות, לאט לדחוף את הדיסק מתוך השקופית מיקרוסקופ על הנייר טישו כחול. הנח את התקליטור, צידה השטוח, ישירות על הנייר.</li>
	<li>שמירה על הדיסק שטוח, מקפלים את הנייר סביב התקליטור כדי למנוע תנועה, הכנס את הדיסק נייר מקופל בקלטת, ולסגור את הקלטת. אם הדיסק לא לגלוש נקיה הזכוכית, להוסיף ג'ל נוסף ו/או להחזיר את השקופית לקרח במשך עוד כמה דקות.</li>
	<li>להטביע את הקלטת ב- PBS ב גביע. תהליך פרפין הטבעה באותו היום על מורפולוגיה של האופטימלית.</li>
</ol>4. פרפין הטבעה
הערה: תהליך הג'ל איון דיסקים פרפין בלוקים באמצעות סדרות התייבשות מקוצרת כפי שמתואר להלן. טכניקה זו אופטימלי באמצעות מעבד אוטומטית, אך עיבוד ידני צריך לייצר תוצאות דומות.
<ol><li>לטבול קלטות 85% אתנול במשך 15 דקות.</li>
	<li>לטבול קלטות אתנול 95% במשך 15 דקות.</li>
	<li>לטבול קלטות 100% אתנול במשך 15 דקות. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.</li>
	<li>לטבול קלטות של קסילן במשך 15 דקות. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.</li>
	<li>לטבול קלטות של פרפין מותכת במשך 10 דקות.</li>
	<li>העברת קלטות פרפין מותכת טריים למשך 10-30 דקות.</li>
	<li>בזהירות פתח את הקלטת, עטיפה בעיתון כחול. הסר את התקליטור ג'ל, שמירה על מסלול של משטח שטוח שהופעל על הנייר. להטביע את הדיסק בתבנית קטנה, עם משטח שטוח (המכילות איון) למטה, במקביל למשטח חיתוך. עבור התקע, בזהירות להסיר אותו בקלטת, להטביע אותו תבנית קטנה עם קצה והצביע לעבר משטח חיתוך.</li>
</ol>5. פרפין חלוקתה ולא מכתים
<ol><li>תווית שקופיות ברצף אם מקטעים טורי נדרשות.</li>
	<li>יש 5 מיקרומטר פרפין מקטעים קיצוץ של histotechnologist מנוסה. כדי למקסם את התשואה, שמור כל המקטעים המכילים חומר. באופן כללי, איסוף מקטעים 20 מאפשר לכידה של רוב החומר.</li>
	<li>חנות מקטעים בטמפרטורת החדר. סעיפים נתונות שגרתית היסטולוגית כתמים (למשל, H & E) ו immunofluorescence (למשל, אינסולין, גלוקגון, דאפי). למטב את הקיבעון של אנטיגנים אחרים, אם יש צורך בכך.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.

ששונה ג'ל-דיסק מבוסס ההטבעה שיטה זו מספקת פשוטה, זולה, דרך יעילה ליצירת תשואה גבוהה של איים קטנים לכל סעיף. בניית הדיסק ג'ל על משטח זכוכית שטוחה מקלה על איונים מתפשטת בריפודי כתופיים מעל אזור מוגדר היטב. להפיץ את איים בדיסק שטוח מציעה את היתרון של הצבת איים רבים במישור של מקטע, אופטימיזציה של התשואה ומאפשר איונים פחות לשמש. ניתן להתאים את עובי דיסק כדי לענות על הצרכים של החוקרים. מאז ניתן להשיג מספר מקטעים, טורי חלקים איים באותו יכול להיות מנותח, הגדלת מספר תוצאות נפרדות שניתן למדידה על הדגימה ניסיוני באותו. למרות המותאם במיוחד כאן לנגרהנס, בטכניקה יכול להיות מיושם חומר נמוך-שפע אחר, כולל אלה עם חתיכות קטנות, הטבע לעזאזל או דגימות צמיגה שאחרת היה קשה לעכל. שיטה זו ממוטבת עבורו איונים טריים-קבוע, לא נבדק עבור סוגים אחרים של חומרים, כמו איים בעבר קפואים. סעיפים אלה גם עשויה להיות שימושית עבור בחיי עיר הכלאה מבחני לגילוי DNA או RNA. התוספת של ג'ל נוסף משמשת לשתי מטרות: להגדיל את אוסף איון וכדי להגן על המרכז איון-עשיר דיסק מפני שיבושים במהלך העברת/טיפול. התקליטור ג'ל דק עפור במהירות, ומאפשר התייבשות מקוצר, קסילן הסתננות צעדים להטבעת פרפין. להרכיב את הדיסק על משטח שטוח ולא במיכל המשני (microfuge צינור או תרבות לוח טוב) מקל עליך להעביר פיזית את הדיסק לקלטת לעיבוד. כאשר לעומת התוצאות טכניקה דיסק, הטכניקה microtube היה מופחתת התשואה איון, התגבש איון הפצה, למרות הסידור הרקמה הלא-מישורי יכול לייצר מספר גדול יותר של איון המכיל מקטעים.
השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללות רקמות קיבעון, היווצרות של הדיסק ג'ל, פרפין הטבעה ולאחר חלוקתה. לגבי יציבות, כפי שנבדקו על-ידי H & E ו- immunofluorescence אינסולין, גלוקגון, אין הבדל זוהה בין מחברים, פורמלין, או משך קיבוע הנע בין 10-30 דקות (לא מוצג). עם זאת, קיבוע בעוצמת ומשך צריך להיות מוטבת לצרכים של משתמש הקצה. החידוש העיקרי הכלול בפרוטוקול זה הוא הכנת ג'ל איון הדיסק; שלבים קריטיים מסוכמות באיור1. השלבים החשובים כוללים באמצעות אמצעי אחסון קטן של ג'ל להתרכז רקמות באזור קטן ויוצרים את הדיסק על משטח שטוח כדי לארגן את הרקמה במטוס יחיד חלוקתה. השימוש מחייב נמוך microfuge צינורות, טיפים, צנטריפוגה דלי מתנדנדים עבור מהדורות כל משפר את רקמת תשואה; איונים מקל פלסטיק לאחר קיבוע. תוספת של חרוזים גלויים בקלות מסייע דיסק למערך, הטבעה, חלוקתה. הסרת כמה שיותר PBS ככל האפשר לפני הוספת שהג'ל הוא קריטי כדי למנוע דילול של agarose, מה שמוביל התמצקות המסכן ואת הקושי העברת הדיסק על הנייר. לשמור את הדיסק דק ללא פגע בעת הזזה של השקופית זכוכית על הנייר יכול להיות מאתגר. אם קמט מתרחשת הדיסק, לאפשר לחזור למצב המקורי, להוסיף עוד ג'ל ולהירגע מחדש את השקופית. לגבי פרפין הטבעה, חשוב כי הדיסק ניתן להטביע שטוח כלפי מטה, מקביל למישור של חיתוך. Histotechnologist מנוסה עם חיתוך פרפין מקטעים חיוני להצלחת הליך זה, שכן החומר הוא מרוכז בחוד החנית של גוש. מול יתר מחוץ לבלוק עלול להוביל לאובדן של המדגם. מומלץ להתחיל איסוף מקטעים ברגע החרוזים הכחולים גלויים.
קיבוע בעוצמת ומשך צריך להיות מוטבת בשביל לרקמות ספציפיות וצרכים של משתמש הקצה. ניתן לשנות את מספר איונים המשמש לדגימה במידת הצורך; עם זאת, הפחתת חומר המוצא יוצרת מקטעים עם פחות איונים. דיסקים עבה יותר או גדול יותר יכול להיווצר בעזרת טכניקה זו; התייבשות קסילן הסתננות צעדים ייתכן שתצטרך להיות מאורכים, צריך להיות מותאם. אם וכתוצאה מכך מכילים רק צורת דיסק חלקית, לשקול האפשרות כי הדיסק לא היה מוטבע במקביל למשטח חיתוך. אם גם מספר קטעים מתקבלים, טכנולוג איבד חומר במהלך הכנת בלוק הראשונית.
שיטה זו יוצרת מקטעים המכיל רקמות איון קבועה, בתור שכזה, ניתן להשתמש רק לתוצאות היסטולוגית. כדי לקבל מספר רב של איים קטנים לכל סעיף, IEQ 200-250 החל החומר שימש, אשר הוא מאתגר ליצור עבור סוגים מסוימים ניסוי. חלקים באיכות גבוהה תלויות שיש histotechnologist מנוסה.
היכולת להפיק 10 + מקטעים המכילים איים רבים מתוך ניסיוני תנאי יחיד יאפשר כימות של תוצאות מרובים על אותו חומר, לשפר את היעילות ניסיוני. ניתוח שגרתי של איים שלמים עלול להוביל ההתקדמות בהבנת רקמות הטרוגניות, לא רק ברמה התאית, אלא גם ברמת איון, על אילו מעט כעת מובנת. החלת טכניקה זו דגימות רקמה מוגבלת-שפע אחרים עשויים להציע יתרונות בתחומים אחרים.

הלבלב לנגרהנס, המקור הבלעדי של מחזורי אינסולין, הם רקמה קריטי לחוקרים הלומדים סוכרת. מכל יצור נתונה, איים קטנים יש גודל המשתנה תדירות סוג התא, אדריכלות1,2,3. האסטרטגיה קונבנציונאלי ללמוד ויוו מבנה והרכב האנדוקרינית תא לנגרהנס הוא על ידי חלוקתה4,של רקמת הלבלב5. מאז איונים מהווים רק חלק קטן הכולל תכנים סלולריים הלבלב, במחקרים מולקולריים מבוצעות על איים מבודדים. Ex-vivo איון תרבות ניסויים בדיקות בתגובה חומרים מזינים, ג'ין אפנון (תרביות תאים, התמרה חושית), או טיפולים ניסיוניים לספק חשוב תובנות מנגנוני הכוח ויסות הישרדות cell האנדוקרינית, התפשטות, ופועלים 5 , 6.
Ex-vivo איון ניסויים לעיתים קרובות הם ניתחו שימוש במחקרים מולקולריים של איים שלם או מחקרים היסטולוגית או מולקולרית של תאי איון התפזרו גדלו ב חד שכבתי5,6. אנליזה מולקולרית של איים קטנים כל מציג אזהרה חמורה של סוגי תאים intermixing, אשר עשויה לייצר תוצאות שווא-שלילי או חיובי-false כאשר אומדן לכל סוג של תא בודד. תא פיזור על coverslips עבור פוסט-תרבות מיקרוסקופיה מאפשר מדידה תוצאה ייחודיים לסוג התא, אך משבש איון אדריכלות, אשר עשוי לשנות את התגובה להתערבות, מונע זיהוי של תוצאות הקשורות אדריכלות. בנוסף, בדרך כלל רק תוצאה אחת ניתן למדוד; לדוגמה, כדי למדוד את התפשטות תאי בטא ומוות תאי בטא תחת באותם התנאים, שני ניסויים נפרדים צריך להתבצע. גישות אלה הם גם עיוור הבין-איון השתנות, שטח של עניין גובר בתחום. מיון תאי איון מאת cytometry זרימה במחקרים מולקולריים ייחודיים לסוג התא, או מחקרים RNA בתא יחיד הינם אלגנטיים אך יקר, זמן רב, מוגבלת על ידי רקמת שפע, ולחסל-אדריכלות, לא מתאימה כדי תא שגרתית תרבות ניתוחים 5 , 7. הדמיה קונאפוקלית של איים immunostained כולה-הר מספק נתונים שלם-אדריכלות באיכות גבוהה, אבל עמל רב, והנתונים שהתקבלו כל מדגם מוגבל לתוצאות לזיהוי יחיד immunostaining8.
היכולת לייצר באיכות גבוהה פרפין מקטעים של פוסט-תרבות איונים כל כתובת זו הרבה חששות אלה. עלות גבוהה, נמוך-שפע איון רקמות דגמים גנטיים ייחודיים או תורמי איברים אנושיים, או איים מצב פוסט vivo בתוך או במבחנה ניסיוני מניפולציה, יקרות. קבלת מספר מקטעים פרפין מ איונים באותו תאפשר ניתוחים ייחודיים לסוג התא, שלם-ארכיטקטורה מרובים מאותו הניסוי.
קיימות טכניקות ליצירת כדורי איון על חלוקתה מושלמים. Agarose הממוטבים היסטולוגיה היא ג'ל מימית נקודת התכה נמוכה נרחב המשמש לעיבוד היסטולוגית ו cytological דגימות כולל דגימות רקמה קטן או מפוצלים שקשה תהליך9. אחד איון הטמעת הגישה היא להשעות את איים קטנים ב- agarose בשפופרת microcentrifuge, צנטריפוגה הצניפה החומר, לאחזר את התקע אגר, ולאחר מכן לעבד, להטביע על חלוקתה10,11. חילוץ המדגם הקרושה מהחלק התחתון של הצינור הוא זמן רב וקשה, שמוביל מפעם לפעם פיצול של המדגם, הסיכון לפציעה. איים מרוכזים בקצה של התקע, שמוביל איון לקוי הפצה בסעיפים המתקבל בשיטה זו. בתחתית התקע עגול מסבך הטבעה כזאת אזור איון-עניים שיוצבו על חלוקתה. בסך הכל, שיטה זו מובילה תשואה נמוכה והפצה איון גושית בסעיפים וכתוצאה מכך.
שיטה חדשה זו היא גישה מפושטת ומשופרות עבור הכנת איון מקטעים. איים מרוכזים אמצעי אחסון קטן, ואז להניח אותה על פני חלקה של שקופית מיקרוסקופ כדי ליצור דיסק קטן, עם איים מטוס יחיד. הדיסק Histogel-איון לאחר מכן מעובד עבור פרפין הטבעה התייבשות מקוצר, קסילן הסתננות פרוטוקול. הגישה הקודמת, אשר מרכזת את איונים בחלק התחתון של צינור microfuge, מבוצעת גם לשם השוואה. טכניקה חדשה זו משפרת את התשואה של איים קטנים לכל סעיף, ההתפלגות של איים קטנים בכל מקטע, ולוקח פחות זמן כדי להעביר בלוקים איון קלטות. טכניקה זו שימושית לביולוגים איון או מדענים אחרים הלומדים חתיכות קטנות של רקמות המעוניינים למקסם פורה לשימוש טישו נמוך-שפע על ידי מדידת תוצאות מרובות על דוגמה אחת בארכיטקטורה רקמה מקורי שלו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

ניסויים באמצעות איים מבודדים הלבלב חשובים למחקר בסוכרת, אך איונים הם יקרים השפע מוגבל. איונים מכילים אוכלוסיה לתא מעורב באדריכלות מובנית אשר משפיעה על תפקוד, איונים אנושי נרחב משתנה בקומפוזיציה סוג התא. שיטות נפוצות ללמוד איונים בתרבית כוללים מולקולרית מחקרים שבוצעו על כל איונים, מכלילה איון ובתחזוקה סוגי תאים ביחד, או מיקרוסקופ או במחקרים מולקולריים בתאי איון התפזרו, שיבוש איון אדריכלות. ללימודים ויוו איון, הלבלב פרפין-מוטבע חלוקתה היא טכניקה חזקה כדי להעריך את תוצאות ספציפיות תא בסביבת הלבלב מקורית. לימוד פוסט-תרבות איים על ידי חלוקתה פרפין, הייתי מציע מספר יתרונות: זיהוי של תוצאות מרובים על אותו איים קטנים (שעשויות להיות אפילו אותו ליתר דיוק איונים, באמצעות סעיפים טורי), מדידות ייחודיים לסוג התא, יליד לשמירה על איון תא התא, התא-תשתית אינטראקציות במהלך החשיפה ניסיוני והן לצורך ניתוח. עם זאת, קיימות טכניקות הטבעה מבודדים איונים פוסט-תרבות הן לא יעיל, זמן רב, נוטה אובדן של חומר, בדרך כלל לייצר סעיפים במספרים איון לא מספיק כדי להיות שימושי עבור לכימות תוצאות. הפתולוגיה הקלינית מעבדה התא בלוק הכנה מתקני הינם נגישים ולא מעשי עבור מעבדות מחקר בסיסי. פיתחנו שיטת ספסל-העליון משופרת, ההופך את יוצרת מקטעים עם תשואה חזקים והפצה של איים קטנים. איונים קבוע resuspended ב agarose היסטולוגית חמים ג'ל, pipetted לתוך דיסק שטוח על משטח זכוכית רגילה, כך איים מפוזרים במטוס. לאחר התייבשות רגילה, הטבעה, ניתן לחתוך (10 +) 4-5 מיקרומטר מקטעים מרובים מהגוש איון אותו. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניתוחים היסטולוגית ו immunofluorescent על עכבר, חולדה, איונים אנושי. זו גישה אפקטיבית, זולה, לחיסכון בזמן כדי להעריך מן איונים בתרבית תאים ייחודיים לסוג, שלם-אדריכלות התוצאות.

מפרטים טכניים מאויר של צעדים כדי להכין את הדיסק ג'ל מוצג באיור1. זה ג'ל דיסק בשיטה התוצאות בסעיפים פרפין המכילים מספר מספיק של איים מופץ במטוס בודד כדי לאפשר כימות משמעות של תוצאות. איור 2 מציג תמונות נמוך-הגדלה של הסעיפים שנוצר כדי להמחיש את מספר איונים שנתפסו לפי סעיף. באופן כללי, > איונים 35 היו גלויים בכל מקטע 250 IEQ שימשו את ההליך, ו > סעיפים 10 (4-5 מיקרומטר) המכיל איונים, התקבלו כל דגימה. הגדלת מספר איים קטנים המשמשים את ההליך הגדילה את מספר איונים בסעיפים. איונים בסעיפים היו מגוונות מבחינה מבנית, בגדלים שונים, את הרעיון החדש, מעניין נתונים ניתן להשיג באמצעות סעיפים ולא טכניקות עיוור להבדלים הבין-איון. השיטה עבדה באותה מידה גם עבור מכרסמים איים מבודדים במעבדה (עכברים, עכבר) ועבור איונים אנושי לאחר משלוח שקיבל את IIDP. איונים מכרסמים היה ניכר יותר מורפולוגיה ללא פגע לאחר השחזור שלאחר בידוד בין לילה איון בינוני, עם משטח מעוגל חלק וקומפקטי צורה כדורית (איור 2א). מורפולוגיה אנושית איון היה דומה כאשר מוטבע על יום ההגעה או מוטבע לאחר השחזור שלאחר משלוח בן לילה, אולי בגלל ע כבר התאוששו בידוד מתח לפני משלוח. שיטת microtube הניבו רקמות חתך הרוחב לאזור קטן, עם פחות איונים לכל סעיף, וארזו בצפיפות איים קטנים, חרוזים (איור 2B). הדימויים microtube המוצגים באיור 2B היו הטובים ביותר שיכולנו להשיג בשיטה זו; לאחד הדגימות היה להישלח חזרה לחתוך קטעים יותר כי אין איונים נמצאו במערכה הראשונה של מקטעים.
טכניקה זו יוצרת מקטעים איון באיכות גבוהה עבור היסטולוגית ו immunofluorescence מכתים (איור 3). אינסולין, גלוקגון מכתים הראה את הרכב מגוון והטרוגניות של איון אדריכלות. הסעיפים בבירור recapitulated אדריכלות ידוע ההבדלים בין בני האדם, עכבר, חולדה איונים, עם איים האנושית המורכבת של תאי-α שופע התערבבו עם תאי הבטא, ואילו איונים עכבר ועכברוש, הראה אדריכלות דומה עם ליבה של תאי בטא תאי אלפא בפריפריה. סעיפים טורי היו השגה; הלוחות באיור 3 הצג סעיפים טורי של אותו איון צבעונית עבור H & E (משמאל) ו immunofluorescence (מימין).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig1.jpg"> איור 1 . איור של השלבים הקריטיים להכנת התקליטור ג'ל איון. ג'ל התחמם עד 70 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום (א) מועבר אל הצינור microfuge מחייב נמוך המכיל בגדר איון/חרוז (B). ע resuspended ב ג'ל חם והועבר שקופית מזכוכית, הפצת החומר בצורת דיסק (C-D). ג'ל נקי נוספים מועבר אל הצינור microfuge, ואז כל החומר הנותר הוא הסיר circumferentially לפזר את הדיסק הראשונית איון/חרוז-המכיל בשקופית זכוכית (E-F). לאחר ג'לי על קרח, הדיסק הוא צד שטוח, שהועברו, היסטולוגיה נייר (ז), אשר הוא מקופל והניח קלטת (H) לצורך עיבוד. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57931/57931fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig2.jpg"> באיור 2. פרפין מקטעים של ג'ל הדיסקים מכילים מספר רב של איים קטנים המפוזרים היטב. (א) הגדלה נמוכה לוחות (40 X, 3 x 3 תמונות תפר יחד, עם חפיפה 15%) של עכבר, חולדה או איון האנושי סעיפים מוכתמים H & E להראות כי איים רבים גלויים בכל מקטע. בהגדלה כניסות (200 X) הצג נציג איים קטנים. לוחות שמאלה מראים קטעים של איים מוטבע מיד לאחר בידוד (עכבר, חולדה) או משלוח (בני אדם); נכון מראות איונים מוטבע אחרי התאוששות לילה בתרבות. חיוור העיגולים הכחולים ראיתי בתמונות X 40 הם החרוזים כלולים להדמיה במהלך ההטמעה והשיוך חלוקתה. אלה דוגמאות מסוים הם C57BL/6N העכבר (בן שנה), עכברים BBDR (בן 4 שבועות), איים מבודדים על ידי הזרקת ductal collagenase והפרדה Ficoll, איים T2D האדם קיבל את IIDP. (B) 250 IEQ של האדם איונים מוטבע לאדם זקן microfuge צינור הטכניקה, לשם השוואה. נמוכה הגדלה לוחות (40 X; יחיד תמונת unstitched כבשו את כל החומר) ולהראות כניסות mag גבוהה (200 X) סעיפים נציג. תרבות בינוני היה RPMI עם 10% FBS פניצילין/סטרפטומיצין, גלוקוז 5.5 mmol/L. גודל ברים לפאנלים הגדלה נמוכה הם 1000 מיקרומטר; גודל ברים עבור לוחות בהגדלה הם 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57931/57931fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig3.jpg"> איור 3 . נציג פתולוגיה, immunofluorescence מכתים במקטעי איון טורי. מקטעים של עכבר, חולדה איונים האנושי מוטבעת לאחר לילה תרבות היו מוכתמים ל H & E, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ brightfield (200 X; שמאלה). מקטע הסמוך היה מוכתם גלוקגון, אינסולין (אדום) (ירוק), נטען בתקשורת המכילות דאפי (כחול), עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (200 X; נכון). גודל ברים: 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57931/57931fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections at JoVE.com

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

pancreatic-islet-embedding-for-paraffin-sections

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  UMass Medical School. Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

Video: Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Murine Pancreatic Islet Isolation

הלבלב Murine איילט בידוד

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...