ونعترف مع الامتنان المجموعة بيولوجيا الخلية بيتا في مركز التميز السكري UMass لنصائح مفيدة ومناقشات. وقدمت جزيرات البنكرياس البشرية بالممول نيدك المتكاملة جزيرة ليلى توزيع البرنامج (إييدب) في مدينة الأمل. تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة/نيدك: R01-DK114686 (LCA)، R01-DK105837 (CY)، 2UC4DK098085 (إييدب)، ومن "الرابطة الأمريكية لمرض السكري" منحة #1-15-بكالوريوس-003 (LCA) بالتعاون مع النظام القطيفة.

بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات UMass المدرسة المؤسسية الحيوان الرعاية الطبية واستخدام اللجنة. دراسات جزيرة البشرية كانت يحددها المجلس استعراض المؤسسية UMass لعدم التأهل لاستعراض الكندي أو الإعفاء نظراً لأنها لا تنطوي على استخدام البشر.
1-جزيرة العزلة والثقافة
<ol><li>عزل الجزر الصغيرة وفصل عن تلويث أنسجة إفرازات والأقنية استخدام أسلوب اختيارك. ملاحظة: هذا الأسلوب الأمثل باستخدام الجزر الصغيرة المعزولة إينسوفليشن الأقنية كولاجيناز وفيكل الفصل12 (القوارض) أو الجزر بعد الشحن من "برنامج توزيع جزيرة المتكاملة" (إييدب13؛ الإنسان). كانت اختارته الجزر الصغيرة مع ميكروبيبيتي P200.</li>
	<li>لتحسين أمثلية مورفولوجيا جزيرة ليلى، السماح للجزر الصغيرة لاسترداد بين عشية وضحاها في 10 مل جزيرة كاملة المتوسطة (ربمي مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين الجلوكوز 5.5 مليمول/لتر) في دائرة هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2 في 37 درجة مئوية. على الرغم من أن هذه الخطوة غير مطلوب للحصول على مقاطع، الجزر الصغيرة لا أكثر على حالها بعد فترة استرداد (انظر الشكل 2).</li>
</ol>2-جزيرة التثبيت
<ol><li>استخدام تلميح P200 ملزمة منخفضة، handpick حوالي 250 جزيرة مكافئات (إيك)13 استخدام شبكة معايرة تحت ستيريوميكروسكوبي في أنبوب [ميكروفوج] ملزمة منخفضة 1.5 مل. نصائح ملزمة منخفضة وأنابيب تقليل الخسائر في جزيرة ليلى.</li>
	<li>السماح للجزر الصغيرة تسوية إلى الأسفل [ميكروفوج] أنابيب. إزالة معظم المادة طافية مع تلميح بيبيت P200، مع الحرص على عدم إزالة أي الجزر الصغيرة.</li>
	<li>أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الأنبوب في جهاز الطرد مركزي دلو يتأرجح حتى السرعة تصل إلى 200 x ز ووقف ثم الدوران. إزالة المادة طافية. كرر يغسل برنامج تلفزيوني، ليصبح مجموع يغسل اثنين.</li>
	<li>إضافة 500 ميليلتر من محلول الفورمالين 10% أو 4% طازجة بارافورمالدهيد. إصلاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لنتائج اختبار باستخدام هذا الأسلوب، كانت هذه أساليب التثبيت يمكن تمييزها. كما قد يكون التثبيت أقصر ممكنة؛ من المستحسن لتحسين مدة التثبيت للنتيجة المرجوة.</li>
	<li>إزالة مثبت مع تلميح P200.</li>
	<li>أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الأنبوبة حتى السرعة تصل إلى 200 x ز ووقف ثم الدوران. إزالة المادة طافية. كرر يغسل برنامج تلفزيوني، ليصبح مجموع يغسل اثنين.</li>
	<li>الشروع فورا في الخطوة التالية.</li>
</ol>3-إعداد القرص جزيرة ليلى (الشكل 1)
<ol><li>عند أول استخدام، تذوب الهلام (مثلاً، هيستوجيل) في 70 درجة مئوية وجعل مختبرين في 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب للتخزين على المدى الطويل. حجم الكوة ليست حاسمة، حيث يمكن إعادة استخدام مختبرين.</li>
	<li>الحارة الهلام (حوالي 100 ميليلتر كل عينة) في 70 درجة مئوية عن طريق وضع [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على قاسمة جل في كتلة حرارة تعيين إلى 70 درجة مئوية.</li>
	<li>نقل الخرز الأزرق [اغروس] (10 ميليلتر لكل عينة) في أنبوب نظيف [ميكروفوج] 1.5 مل. دقة ريسوسبيند الخرز قبل بيبيتينج. ملاحظة: تمتزج الخرز الأزرق مع الجزر الصغيرة للمساعدة في التعرف البصري للمواد المضمنة في الزر [اغروس] وكتلة البارافين. عدد الخرز الأزرق المستخدمة ليست حاسمة بالنسبة للنتيجة، ولكن تجنب الخرز المفرط (> 5 x العدد من الجزر الصغيرة) للسماح بالتوزيع الأمثل للجزر الصغيرة في الفروع.</li>
	<li>أغسل الخرز الأزرق مع 1 مل برنامج تلفزيوني، مرتين. لكل غسل، تدور الخرز 1 دقيقة في ز 800 x. بعد الغسيل الثاني، ريسوسبيند الخرز في (n+ 2) × 10 ميليلتر PBS، حيث n هو عدد أنابيب العينات؛ على سبيل المثال، سيكون حجم برنامج تلفزيوني إضافة إلى الخرز لأنابيب العينة 2، 40 ميليلتر.</li>
	<li>الطرد المركزي [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على الجزر (تدور موجزة إلى 200 س ز) وإزالة معظم المادة طافية. قطع غيض من تلميح ميكروبيبيتي 10 ميليلتر مع مقص أو شفرة وإضافة 10 ميليلتر من حبات لكل أنبوبة جزيرة ليلى، باستخدام تلميح نظيفة لكل عينة. لا تخلط (لتجنب فقدان الجزر الصغيرة).</li>
	<li>الطرد المركزي الجزر الصغيرة والخرز (تدور موجزة إلى 200 س ز). قم بإزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن مع نصيحة ميكروبيبيتي 10 ميليلتر تقطيعه.</li>
	<li>التسمية شرائح المجهر لتحديد هوية العينة. يمكن إعداد العينات اثنين إلى ثلاثة في كل شريحة. ضع الشريحة على مقاعد البدلاء قرب كتلة الحرارة مع هلام دافئة. النصائح من ثلاث إلى خمس قطع 20 ميليلتر ملزمة منخفضة ميكروبيبيتي نصائح كل عينة بشفرة حلاقة أو مقص. تحميل اثنين P20 ميكروبيبيتيس مع قطع نصائح للسماح بسرعة التحول من واحدة إلى أخرى.</li>
	<li>باستخدام ميكروبيبيتي أول، إضافة 15-20 ميليلتر من هلام الحارة للجزر الصغيرة/حبات [ميكروفوج] أنابيب؛ مزيج فورا، تجنب الفقاعات؛ وتنطبق على الشريحة بشكل خليط أجار/الجزر/حبات السائل < القرص قطرها 1 سم. ضع القرص القرب من الحافة من الشريحة، تاركاً مساحة للطوق الخارجي هلام (الخطوة التالية). انقر فوق الشريحة بلطف عدة مرات لتسوية الجزر الصغيرة والخرز.</li>
	<li>استخدام ميكروبيبيتي ثانية، إضافة 20 ميليلتر من هلام الحارة إلى أنبوب عينة. استخدام ميكروبيبيتي أول، مزيج هلام جديد مع أي المتبقية الجزيرات/الخرز، إعادة الاحترار في كتلة الحرارة إذا ما بدأ أن يصلب، ثم تطبيق هذا الخليط على الشريحة، المحيطة بالقرص الأصلي. كرر حسب الضرورة، باستخدام نصائح قبل قطع إضافية، حتى يصبح القرص بالحجم المطلوب وسمك. ملاحظة: التعامل مع القرص تبلور أسهل إذا كان خارج الحلبة قليلاً أكثر ثخانة. 3 x 20 ميليلتر من جل عادة كافية. هذه الخطوة يقلل من فقدان للجزر الصغيرة التي يغسل أنبوب ويضيف [اغروس] جزيرة فقيرة إلى خارج القرص لتسهيل معالجة القرص.</li>
	<li>إعداد القرص كل على حدة، وتتبع دقيق للأمر عينة إذا وضع أقراص متعددة على كل شريحة.</li>
	<li>ضع الشرائح على سطح مستو من الجليد الرطب، مع غطاء، لمدة 10 دقائق أو حتى يتصلب الهلام. من الصعب أكثر الشرائح القرص قبالة الزجاج إذا يجف.</li>
	<li>قم بتسمية خزعة تجهيز/تضمين أشرطة الأنسجة مع قلم رصاص، واحد لكل عينة. الجاف للجزء الخلفي الشريحة لتفادي ترطيب الورقة الزرقاء.</li>
	<li>برفق باستخدام حافة شفرة حلاقة حادة، دفع القرص في كل اتجاه تحريرها من الزجاج. عند ذلك الشرائح بسهولة، ببطء دفع القرص من الشريحة المجهر على المناديل الورقية الزرقاء. ضع القرص وجانب شقة أسفل، مباشرة على الورق.</li>
	<li>حفظ القرص مسطحة، طي الورقة حول القرص لمنع الحركة، ضع القرص في ورقة مطوية في الكاسيت، وأغلق الكاسيت. إذا كان القرص لا شريحة نظيفة قبالة الزجاج، إضافة هلام أكثر و/أو إرجاع الشريحة للجليد لبضع دقائق إضافية.</li>
	<li>تغرق في الكاسيت في برنامج تلفزيوني في كوب. عملية البارافين التضمين في نفس اليوم مورفولوجية الأمثل.</li>
</ol>4-البارافين التضمين
ملاحظة: عملية أقراص هلام جزيرة ليلى إلى كتل البارافين باستخدام سلسلة جفاف مختصر كما هو موضح أدناه. هذا الأسلوب الأمثل باستخدام معالج الآلي، ولكن المعالجة اليدوية وينبغي أن تسفر عن نتائج مماثلة.
<ol><li>تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 85% لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 95% لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 100% لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين لما مجموعة ثلاث يغسل.</li>
	<li>تزج أشرطة الكاسيت في زيلين نفط لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين لما مجموعة ثلاث يغسل.</li>
	<li>تزج أشرطة الكاسيت في البرافين المنصهر لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>نقل الأشرطة إلى البرافين المنصهر الطازجة لمدة 10-30 دقيقة.</li>
	<li>فتح الكاسيت وبسط الورقة الزرقاء بعناية. إزالة القرص هلام، تتبع من سطح مستو الذي اعترض على الورقة. تضمين القرص في العفن صغيرة، مع السطح (المحتوية على جزيرة ليلى) أسفل، موازية لسطح القطع. لسد العجز، بعناية إزالته من الكاسيت وتضمين ذلك في قالب صغير بطرف لافتاً نحو سطح القطع.</li>
</ol>5-البارافين تمزيقها وتلطيخ
<ol><li>قم بتسمية الشرائح تسلسلياً إذا كانت مطلوبة من مقاطع المسلسل.</li>
	<li>وقد 5 مقاطع البارافين ميكرومتر قطع طريق هيستوتيتشنولوجيست ذوي خبرة. لتعظيم العائد، حفظ كافة المقاطع التي تحتوي على المواد. وبصفة عامة، يسمح تجميع الأقسام 20 القبض على معظم المواد.</li>
	<li>تخزين المقاطع في درجة حرارة الغرفة. أقسام قابلة للبقع النسيجي الروتينية (مثل H & E) والفلورة (مثل الأنسولين والجلوكاجون و DAPI). تحسين التثبيت لمولدات المضادات الأخرى، إذا لزم الأمر.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.

يوفر هذا الأسلوب التضمين معدلة هلام-المستندة إلى قرص بسيطة وغير مكلفة، وطريقة فعالة لتوليد عائد عالية من الجزيرات كل قسم. بناء القرص جل على سطح زجاج مسطح يسهل انتشار الجزر إلى توزيع حتى على مساحة محددة تحديداً جيدا. نشر الجزيرات في قرص ثابت يوفر ميزة وضع العديد من الجزر الصغيرة في طائرة الباب وتحسين الغلة والسماح للجزر الصغيرة أقل لاستخدامها. سمك القرص يمكن تعديلها لتلبية احتياجات المحققين. حيث يمكن الحصول على عدة أقسام، يمكن تحليل مقاطع المسلسل من الجزر نفسها، زيادة عدد النتائج المتميزة التي يمكن قياسها في نفس العينة التجريبية. على الرغم من أن أمثل هنا جزيرات البنكرياس، يمكن تطبيق التقنية للمواد المنخفضة-وفرة الأخرى، بما في ذلك مع قطع صغيرة أو طبيعة قابلة للتفتيت أو عينات اللزجة التي وإلا سيكون من الصعب لعملية. هذا الأسلوب هو الأمثل للجزر الصغيرة الطازجة--ثابت ولم يتم اختباره لأنواع أخرى من المواد، مثل الجزر الصغيرة المجمدة سابقا. قد يكون من المفيد لفحوصات التهجين في الموقع للكشف عن الحمض النووي الريبي أو أيضا هذه المقاطع. إضافة جل إضافي يخدم غرضين: تحقيق أقصى قدر من جمع جزيرة ليلى وحماية مركز القرص الغنية بجزيرة ليلى من تعطل أثناء مناولة/نقل. القرص جل رقيقة يتصلب بسرعة ويسمح الجفاف مختصرة وزيلين نفط تسلل خطوات لتضمين البارافين. تشكيل القرص على سطح مستو وليس في حاوية ثانوي ([ميكروفوج] أنابيب أو الثقافة لوحة جيدا) يجعل من السهل فعلياً نقل القرص إلى كاسيت للمعالجة. بالمقارنة مع نتائج تقنية القرص، تقنية microtube قد انخفض محصول جزيرة ليلى وتجمعت التوزيع جزيرة ليلى، وعلى الرغم من أن هذا الترتيب غير مستو الأنسجة يمكن أن تولد عددا أكبر من التي تحتوي على جزيرة ليلى المقاطع.
وتشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول الأنسجة التثبيت، تكوين القرص هلام، البارافين التضمين، وتمزيقها. فيما يتعلق بالتثبيت، كما تم اختبارها قبل H & E والفلورة للأنسولين والجلوكاجون، تم الكشف عن لا الفرق بين منهاج عمل بيجين والفورمالين، أو تثبيت مدة تتراوح بين 10-30 دقيقة (غير معروضة). ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل التثبيت كثافة ومدة لاحتياجات المستخدم النهائي. الابتكار الرئيسي الوارد في هذا البروتوكول هو إعداد القرص جزيرة جل؛ ويرد في الشكل 1خطوات حاسمة. وتشمل الخطوات الرئيسية باستخدام كمية صغيرة من هلام التركيز الأنسجة في منطقة صغيرة وتشكيل القرص على سطح مستو لترتيب الأنسجة في طائرة واحدة لتمزيقها. يحسن استخدام ملزمة منخفضة [ميكروفوج] أنابيب ونصائح ودلو يتأرجح أجهزة الطرد مركزي لدوران كل الأنسجة الغلة؛ الجزر الصغيرة تتمسك بالبلاستيك بعد التثبيت. وتساعد إضافة الخرز مرئية بسهولة مع تكوين القرص، والتضمين وتمزيقها. إزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن قبل إضافة أمر بالغ الأهمية لتجنب إضعاف [اغروس] الهلام، الأمر الذي يؤدي إلى التصلب الفقيرة وصعوبة نقل القرص إلى الورقة. إبقاء القرص رقيقة سليمة في حين ينزلق من الشريحة الزجاجية للورقة يمكن أن تكون صعبة. في حالة حدوث تجاعيد في القرص، السماح لها بالعودة إلى الموقع الأصلي، وإضافة جل أكثر وإعادة تشيل الشريحة. فيما يتعلق بتضمين البارافين، من المهم تضمين القرص مسطحة-الجانب الأسفل وموازية لطائرة القطع. هيستوتيتشنولوجيست من ذوي الخبرة مع قطع مقاطع البارافين أمر ضروري لنجاح هذا الإجراء، نظراً للمواد التي يتركز في الحافة الأمامية للكتلة. مواجهة المفرط للخروج من الكتلة قد يؤدي إلى فقدان للعينة. من المستحسن للبدء في جمع المقاطع حالما الخرز الأزرق مرئية.
ينبغي أن يكون الأمثل التثبيت كثافة ومدة للأنسجة المحددة واحتياجات المستخدم النهائي. يمكن تعديل العدد من الجزر الصغيرة المستخدمة لكل عينة إذا لزم الأمر؛ ومع ذلك، الحد من انطلاق المواد يولد الأقسام مع الجزر الصغيرة أقل. يمكن إنشاء أقراص سمكا أو أكبر باستخدام هذه التقنية؛ الجفاف والخطوات تسلل زيلين نفط قد تحتاج إلى أن تطول، وينبغي أن يكون الأمثل. إذا الأقسام الناتجة تحتوي على شكل قرص جزئية فقط، النظر في إمكانية أن القرص ليس مضمن مواز لسطح القطع. إذا كان يتم الحصول على مقاطع قليلة جداً، قد فقدت تقني المواد أثناء إعداد كتلة الأولى.
هذا الأسلوب ينشئ الأقسام التي تحتوي على الأنسجة جزيرة ثابتة، وعلى هذا النحو، يمكن أن تستخدم فقط لنتائج النسيجي. للحصول على عدد كبير من الجزر الصغيرة كل قسم، إيك 200-250 ابتداء من مواد استخدمت، الذي يمثل تحديا لتوليد لبعض أنواع التجربة. مقاطع عالية الجودة التي تعتمد على وجود هيستوتيتشنولوجيست ذوي خبرة.
القدرة على توليد 10 + المقاطع التي تحتوي على العديد من الجزر الصغيرة من شرط تجريبي واحد سيتيح القياس الكمي لنتائج متعددة على نفس المواد، تحسين كفاءة التجريبية. التحليل الروتيني من الجزيرات سليمة يؤدي إلى التقدم في فهم في عدم تجانس النسيج، ليس فقط على مستوى خلوي، ولكن أيضا على مستوى الجزيرة، حول فيها سوى القليل من المفهوم حاليا. تطبيق هذه التقنية على عينات الأنسجة وفرة محدودة أخرى قد تقدم فوائد للحقول الأخرى، وكذلك.

البنكرياس جزر لانجرهانز، المصدر الوحيد لتعميم الأنسولين، أنسجة الحيوية للمحققين يدرسون مرض البول السكري. من أي كائن حي معين، قد الجزيرات حجم متغير وتردد نوع الخلية والهندسة المعمارية1،،من23. الاستراتيجية التقليدية للدراسة في فيفو هيكل وتكوين خلية الغدد الصماء من جزيرات البنكرياس بتقطيع بنكرياس الأنسجة4،5. أن الجزر تشكل سوى جزء صغير من إجمالي المحتوى الخلوية البنكرياس، تجري الدراسات الجزيئية على الجزر الصغيرة المعزولة. السابقين فيفو جزيرة الثقافة التجارب اختبار استجابة للمواد الغذائية، والتحوير الجيني (تعداء، تنبيغ)، أو علاجات تجريبية توفير نظرة ثاقبة آليات تحوير بقاء الخلية الغدد الصماء، والانتشار، ووظيفة هامة 5 , 6.
السابقين فيفو تجارب جزيرة صغيرة غالباً ما يتم تحليل استخدام الدراسات الجزيئية للجزر كله أو دراسات نسيجية أو الجزيئية للخلايا جزيرة متناثرة نمت في أحادي الطبقة5،6. التحليل الجزيئي للجزر كله يدخل التحذير الشديد من تمازج أنواع الخلايا، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة أو إيجابية كاذبة عند استقراء لأي نوع من الخلايا الفردية. تشتت الخلية على كوفيرسليبس للثقافة بعد انتهاء الفحص المجهري يتيح قياس نتائج الخلية-نوع معين، ولكن يعطل العمارة جزيرة ليلى، والتي قد تغير استجابة للتدخل، ويحول دون تحديد النتائج المتعلقة بالهندسة المعمارية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس عموما من التوصل إلى نتيجة واحدة فقط؛ على سبيل المثال، تحتاج تجربتين منفصلتين لقياس انتشار الخلايا بيتا وموت الخلايا بيتا نفس الظروف، التي يتعين القيام بها. وأيضا هذه النهج الأعمى لتقلب بين جزيرة ليلى، مجال يحظى باهتمام متزايد في المجال. فرز الخلايا جزيرة ليلى بالتدفق الخلوي للدراسات الجزيئية الخليوي-نوع معين، أو دراسات الحمض النووي الريبي خلية واحدة أنيقة لكنها محدودة، مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، بوفرة الأنسجة، القضاء على الهندسة المعمارية، وليست ملائمة تماما لتحليلات ثقافة الخلية الروتينية 5 , 7-تصوير [كنفوكل] من الجزيرات الجامع-جبل إيمونوستينيد ويقدم بيانات سليمة هندسة عالية الجودة، ولكن كثيفة العمالة، والبيانات التي تم الحصول عليها من كل عينة محدودة إلى نتائج يمكن تحديدها في إيمونوستينينج واحدة8.
القدرة على توليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات كله الثقافة بعد انتهاء سيتناول العديد من هذه الشواغل. جزيرة عالية التكلفة، ومنخفضة-وفرة الأنسجة من النماذج الوراثية الفريدة أو من الجهات المانحة الجهاز البشري، أو الجزر حالة وظيفة فيفو في أو في المختبر التجريبي التلاعب، الثمينة. الحصول على عدة مقاطع البارافين من الجزيرات نفس سيسمح تحليل الخلية-نوع محدد، وبنية سليمة متعددة من نفس التجربة.
التقنيات القائمة على توليد الكريات جزيرة ليلى لتمزيقها ناقصة. هو محسن لعلم الأنسجة [اغروس] هلام مائي نقطة انصهار منخفضة يستخدم على نطاق واسع في تجهيز عينات نسيجية والخلوية بما في ذلك عينات الأنسجة الصغيرة أو المجزأة التي يصعب عملية9. جزيرة واحدة تضمين نهج هو تعليق الجزر الصغيرة في [اغروس] في أنبوب ميكروسينتريفوجي، والطرد المركزي لبيليه بالمواد، واسترداد المكونات أجار، ثم عملية وتضمين لتقطيع10،11. استخراج عينة طدت من الجزء السفلي من الأنبوب وقتاً طويلاً وصعبا، مما أدى إلى تجزئة العينة العرضية وخطر الإصابة الشخصية. الجزر الصغيرة تتركز في غيض المكونات، مما يؤدي إلى توزيع جزيرة ليلى غير كافية في الأجزاء التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب. جولة أسفل المكونات تعقيد التضمين مثل أنه قد قدم في منطقة ايميا-الفقراء لتمزيقها. وعموما، هذا الأسلوب يؤدي إلى منخفضة الغلة وتوزيع جزيرة تحبب خفيف في الأقسام الناتجة.
هذا الأسلوب الجديد نهج مبسطة ومحسنة للتحضير لأقسام جزيرة ليلى. الجزر الصغيرة تتركز في حجم صغير وثم وضعت على سطح أملس لشريحة المجهر شكل قرص صغير، مع الجزر في طائرة واحدة. تتم معالجة القرص هيستوجيل-جزيرة لاحقاً البارافين التضمين في تقصير الجفاف وبروتوكول تسلل زيلين نفط. ويتم أيضا النهج السابق، الذي يركز الجزر الصغيرة في الجزء السفلي من أنبوب [ميكروفوج]، على سبيل مقارنة. هذا الأسلوب الجديد يحسن عائد الجزيرات كل قسم، توزيع الجزر الصغيرة في كل قسم، ووقتاً أقل لنقل كتل جزيرة ليلى إلى أشرطة الكاسيت. هذا الأسلوب مفيد لعلماء الأحياء جزيرة ليلى أو غيره من العلماء الذين يدرسون قطع صغيرة من الأنسجة الراغبين في تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية استخدام الأنسجة وفرة منخفضة بقياس نتائج متعددة في عينة واحدة في هندسة الأنسجة الأصلية به.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

تجارب باستخدام جزيرات البنكرياس معزولة هاما لأبحاث مرض السكري، ولكن الجزر الصغيرة مكلفة ومحدودة الوفرة. الجزر الصغيرة تحتوي على عدد خلايا مختلطة في هيكل منظم الآثار الدالة والجزيرات البشرية على نطاق واسع متغير في تكوين نوع الخلية. وتشمل الأساليب الحالية المستخدمة بشكل متكرر لدراسة الجزيرات مثقف الجزيئية دراسات أجريت على الجزر كله أو فاعلين جزيرة تباين أنواع الخلايا معا، أو الفحص المجهري أو الدراسات الجزيئية في خلايا الجزيرة الصغيرة المتناثرة، تعطيل العمارة جزيرة ليلى. في فيفو الدراسات جزيرة ليلى، جزءا لا يتجزأ من البارافين البنكرياس تمزيقها تقنية قوية لتقييم النتائج الخاصة بالخلايا في البنكرياس البيئة الأصلية. دراسة ثقافة ما بعد الجزر بتقطيع البارافين سيوفر العديد من المزايا: الكشف عن نتائج متعددة على نفس الجزيرات (يحتمل حتى بالضبط نفس الجزر الصغيرة، باستخدام مقاطع المسلسل) وقياسات خلية-نوع معين، والحفاظ على مواطن جزيرة خلية خلية والخلية-التحتية التفاعلات أثناء التعرض التجريبية والتحليل. ومع ذلك، عزل التقنيات الموجودة لتضمين الجزيرات الثقافة بعد هي غير فعالة، وتستغرق وقتاً طويلاً، وعرضه لفقدان المواد وتنتج عموما المقاطع مع أرقام جزيرة ليلى غير كافية أن تكون مفيدة للتحديد الكمي لنتائج. مرافق إعداد كتلة الخلايا مختبر علم الأمراض السريرية غير قابل للوصول وغير عملي لمختبرات البحوث الأساسية. قمنا بتطوير أسلوب أعلى مقاعد البدلاء المحسنة والمبسطة التي تنشئ المقاطع ذات غلة قوية والتوزيع للجزر الصغيرة. الجزر الصغيرة الثابتة حراكه في الحارة النسيجي [اغروس] هلام وبيبيتيد إلى قرص ثابت على شريحة زجاج قياسية، مثل أن الجزر الصغيرة توزع في طائرة. بعد الجفاف القياسي والتضمين، يمكن قص (10 +) 4-5 ميكرومتر مقاطع متعددة من نفس الكتلة جزيرة ليلى. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن إجراء تحاليل نسيجية وإيمونوفلوريسسينت على الماوس وفار والجزيرات البشرية. هذا نهج فعالة وغير مكلفة وتوفير الوقت لتقييم نتائج الخلية-نوع محدد، وبنية سليمة من الجزيرات المستزرعة.

تخطيطي يتضح من خطوات لإعداد القرص جل يرد في الشكل 1. هذا جل القرص نتائج الأسلوب في البارافين المقاطع التي تحتوي على عدد كاف من الجزر الصغيرة الموزعة في طائرة واحدة للسماح بمعنى القياس الكمي لنتائج. ويبين الشكل 2 الصور المنخفضة-التكبير من الأقسام الناتجة لتوضيح العدد من الجزر الصغيرة القبض على كل قسم. وبصفة عامة، > الجزر 35 كانت مرئية في كل مقطع عندما استخدمت إيك 250 لهذا الإجراء، و > أقسام 10 (4-5 ميكرومتر) التي تحتوي على الجزر الصغيرة التي تم الحصول عليها من كل عينة. زيادة العدد من الجزر الصغيرة المستخدمة للإجراء زيادة في العدد من الجزر الصغيرة في الفروع. الجزر الصغيرة في الأقسام المختلفة هيكلياً وذات أحجام مختلفة، دعم هذا المفهوم الجديد ومثيرة للاهتمام البيانات يمكن الحصول عليها باستخدام المقاطع بدلاً من تقنيات المكفوفين للاختلافات بين جزيرة ليلى. عملت الطريقة متساوية جيدا للقوارض الجزر الصغيرة المعزولة في المختبر (فأر، الماوس) والجزيرات البشرية تلقاها في إييدب بعد الشحن. وكان الجزيرات القوارض مورفولوجيا سليمة ملحوظ أكثر بعد الانتعاش بعد انتهاء العزلة بين عشية وضحاها في جزيرة متوسطة، مع سطح أملس مستدير وضغط كروية الشكل (الشكل 2أ). مورفولوجيا الإنسان جزيرة ليلى مماثل عند مضمن في يوم الوصول أو مضمنة بعد الانتعاش بعد الشحن بين عشية وضحاها، ربما لأن الجزر الصغيرة استعادت فعلا من الإجهاد عزلة قبل الشحن. الأسلوب microtube أسفرت عن منطقة مستعرضة أصغر أنسجة، مع الجزر الصغيرة أقل من كل قسم، والمزدحمة الجزر الصغيرة والخرز (الشكل 2ب). الصور microtube هو مبين في الشكل 2ب كانت أفضل كنا قادرين على الحصول على هذا الأسلوب؛ وكان أحد النماذج ليتم إرسالها مرة أخرى إلى قطع المزيد من المقاطع لأنه تم العثور على لا الجزر الصغيرة في أول مجموعة من المقاطع.
هذا الأسلوب بإنشاء أقسام جزيرة عالية الجودة لغذائها والفلوره تلطيخ (الشكل 3). وأظهرت الأنسولين والجلوكاجون تلطيخ تشكيلة متنوعة والتباين في العمارة جزيرة ليلى. المقاطع لخص وضوح الاختلافات المعمارية المعروفة بين الإنسان، اختلطت الجزيرات الماوس وفار، مع الجزر البشرية تتألف من خلايا α وفيرة مع خلايا بيتا، بينما أظهرت الجزيرات الماوس وفار بنية مماثلة مع نواة خلية بيتا وخلايا ألفا في الهامش. مقاطع المسلسل تم الحصول عليها؛ تظهر اللوحات في الشكل 3 مقاطع المسلسل نفس جزيرة الملون ح & ه (يسار) والفلوره (يمين).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig1.jpg"> الشكل 1 . شكل توضيحي لخطوات حاسمة لجعل القرص جل جزيرة ليلى. هلام استعد إلى 70 درجة مئوية في كتلة حرارة (A) يتم نقلها إلى ملزمة منخفضة [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على جزيرة ليلى/حبة بيليه (ب). الجزر هي حراكه في جل الحارة ونقلها إلى شريحة زجاجية، نشر المواد في شكل قرص (ج-د). يتم نقل جل نظيفة إضافية إلى [ميكروفوج] أنابيب، ثم إزالة جميع المواد المتبقية وينتشر circumferentially الأولى جزيرة ليلى/حبة-التي تحتوي على القرص على الشريحة الزجاجية (ه-و). بعد التبلور على الجليد، هو القرص الجانب المنقول، شقة أسفل، ورقة علم الأنسجة (ز)، التي يتم طيها ووضعها في كاسيت (ح) للمعالجة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57931/57931fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig2.jpg"> الرقم 2. مقاطع البارافين هلام أقراص تحتوي على عدد كبير من الجزر الصغيرة الموزعة جيدا. (أ) التكبير المنخفض الألواح (40 X، 3 × 3 صور مخيط معا، مع تداخل 15 ٪) من الماوس، تظهر الفئران أو أقسام جزيرة البشرية ملطخة H & ه أن العديد من الجزر الصغيرة تكون مرئية في كل قسم. إظهار insets التكبير عالية (200 س) الجزيرات الممثل. لوحات اليسرى تظهر المقاطع من الجزيرات مضمن مباشرة بعد عزلة (الماوس وفار) أو شحن (البشري)؛ تظهر لوحات حق الجزيرات مضمنة بعد الانتعاش بين عشية وضحاها في الثقافة. هي دوائر زرقاء باهتة ينظر في 40 X صور الخرز المدرجة للتصور خلال التضمين وتمزيقها. هذه العينات خاصة هي من الماوس C57BL/6N (1 سنة) وبدر الفئران (4 أسابيع)، الجزيرات معزول بواسطة حقن كولاجيناز الأقنية وفصل فيكل والجزيرات T2D البشرية الواردة من إييدب. (ب) إيك 250 من الجزيرات البشرية المضمنة كل تقنية قديمة [ميكروفوج] أنابيب، للمقارنة. انخفاض لوحات التكبير (40 X؛ وواحد الصورة أونستيتشيد القبض على جميع المواد) وإظهار insets ماج عالية (200 س) المقاطع التمثيلية. وكان متوسط الثقافة ربمي مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين الجلوكوز 5.5 مليمول/لتر. أشرطة مقياس للوحات التكبير المنخفض هي 1000 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس للوحات عالية التكبير هي 50 ميكرومتر. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57931/57931fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig3.jpg"> الشكل 3 . الممثل histochemical والفلوره تلطيخ على جزيرة ليلى المسلسل المقاطع. المضمنة أقسام الماوس وفار، والجزيرات البشرية بعد الملون ح & ه الثقافة بين عشية وضحاها وتصويرها بالفحص المجهري برايتفيلد (200 X؛ واليسار). قسما مجاورة كان الملون للأنسولين (أحمر)، الجلوكاجون (الأخضر)، التي شنت في الوسائط التي تحتوي على DAPI (أزرق) وتصويرها باستخدام مجهر فلوري (200 X؛ وحق). تغيير حجم أشرطة: 50 ميكرومتر. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57931/57931fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections at JoVE.com

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

السابقين فيفو الدراسات جزيرة البنكرياس تعتبر هامة لأبحاث مرض السكري. التقنيات القائمة لدراسة الجزيرات المزروعة في بهم العمارة 3 الأبعاد الأصلية مضيعة للوقت وغير كفؤة، والمستخدمة بشكل متكرر. ويصف هذا العمل طريقة جديدة وبسيطة وفعالة لتوليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات مثقف كلياً.

جزيرة البنكرياس التضمين لمقاطع البارافين

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

pancreatic-islet-embedding-for-paraffin-sections

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  UMass Medical School. السابقين فيفو الدراسات جزيرة البنكرياس تعتبر هامة لأبحاث مرض السكري. التقنيات القائمة لدراسة الجزيرات المزروعة في بهم العمارة 3 الأبعاد الأصلية مضيعة للوقت وغير كفؤة، والمستخدمة بشكل متكرر. ويصف هذا العمل طريقة جديدة وبسيطة وفعالة لتوليد مقاطع البارافين ...

Video: Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Murine Pancreatic Islet Isolation

فأري عزل جزيرة البنكرياس

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

المناعية : أقسام البارافين باستخدام ABC Vectastain مجموعة من مختبرات المتجهات

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

المناعية على أقسام البارافين للبشرة باستخدام الماوس أجسام نيون

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الأول : الهضم ومجموعة من الأنسجة البنكرياس

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الثاني : تنقية الثقافة والإنسان من الفشوت

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

بمساعدة الحاسوب على نطاق واسع التصور النوعي والكمي لقداس جزيرة البنكرياس والتوزيع الحجم والعمارة

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...